CN102755991A

CN102755991A - 利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法

Info

Publication number: CN102755991A
Application number: CN2012102728508A
Authority: CN
Inventors: 姜健; 杨宝灵; 范方; 王冰; 温小红; 刘淼
Original assignee: Dalian Nationalities University
Current assignee: Dalian Minzu University
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2032-08-02
Also published as: CN102755991B

Abstract

本发明公开了一种利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水；（2）在紫花苜蓿种子上包覆含有有机磷农药降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂；（3）对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；（4）将包衣的紫花苜蓿种子播种到有机磷农药污染土壤中；（5）出苗后进行田间管理。本发明能够有效进行土壤中有机磷农药的分解、降解和吸附，减少土壤中有机磷农药残留，并且具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点。

Description

利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及生态环保领域，具体是一种利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法。

背景技术

土壤污染是指人类活动所产生的污染物通过各种途径进入土壤，其数量和速度超过了土壤的容纳和净化能力，从而使土壤的性质、组成及性状等发生变化，使污染物质的积累过程逐渐占据优势，破坏了土壤的自然生态平衡，并导致土壤的自然功能失调、土壤质量恶化的现象。土壤污染的明显标志是土壤生产力下降。土壤有机污染物主要是化学农药。目前大量使用的化学农药达数百种，其中主要包括有机磷农药、有机氯农药、氨基甲酸酶类、苯氧羧酸类、苯酚、胺类。此外，石油、多环芳烃、多氯联苯、甲烷、有害微生物等也是土壤中常见的有机污染物。

目前，中国农药生产量居世界第二位，但产品结构不合理，质量较低，产品中杀虫剂占70%，杀虫剂中有机磷农药占70%，有机磷农药中高毒品种占70%，包括敌敌畏、久效磷、乐果、速灭磷等杀虫剂，稻瘟净、克瘟净等杀菌剂，以及其他有机磷产品如有机磷灭鼠剂、有机磷除草剂、生长调节剂等仍旧在使用，致使大量农药残留，带来严重的土壤污染。

有机磷农药的降解主要有化学氧化、生物降解、光化学降解等方式，其中生物降解的作用占重要地位。化学氧化是降解有机磷农药的有效方法，通过化学反应有机磷农药被氧化为微毒或无毒的物质，从而达到处理的目的。常用的氧化剂有过氧化氢、过碳酸钠、铈配合物等。生物降解主要是微生物降解、植物降解。在微生物降解方面，自然环境中存在的部分细菌、真菌、放线菌、藻类等对有机磷农药具有降解作用，研究得比较深入的有细菌和真菌两类，细菌包括：假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、无色杆菌属（Achromobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、微球菌属（Micrococcus）、黄单胞杆菌属（Xanthomonas）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、短杆菌属（Brevibacterium）、沙雷氏菌属（Serratia）、链球菌属（Streptococcus）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、欧文氏菌属（Erwinia）、库特氏菌属（Kurthia）、气单孢菌属（Aeromonas）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、变形菌属（Proteus）、固瘤细菌属（Azotomonus）、杆菌属（Thiobacillus）等；真菌包括青霉菌属（Penicillium）、根霉菌属（Rhizopus）、木霉菌属（Trichoderma）、镰刀菌属（Fusarium）、酵母菌属（Saccharomyces）等；放线菌中的诺卡氏菌（Nocardia），藻类中的菱形硅藻属（Nitzschia）等。

植物修复是利用根系的吸收作用和体内发达的酶系统对污染进行治理的一种修复方式。植物以太阳能作为驱动力，在修复土壤的同时还能净化空气和水体、美化环境、防止水土流失，无二次污染，特别适用于大面积污染区域的治理。由于植物新陈代谢的差异，所以植物修复的作用机理也不尽相同，但总体上可分为5种：(1)植物挥发：利用植物将一些挥发性污染物吸收到植物体内，然后将其转化为气态物质释放到大气中；(2)植物提取：植物直接吸收一种或几种污染物并在植物体内蓄积，之后将植物收获进行处理；(3)植物降解：植物利用本身产生的各种酶的作用，将吸收到植物体内的污染物进行转化和降解的一种方式；(4)植物根际作用：利用植物根际微生物及根释放的各种酶的降解作用来转化有机污染物；(5)植物稳定：又称植物钝化，通过植物与土壤的共同作用,将污染物吸附于根系及土壤表面，从而降低污染物的有效形态。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科蝶形花亚科苜蓿属植物，因其产草量高、富含蛋白质、适口性好、适应性强等特点而被称为“牧草之王”。紫花苜蓿是多年生植物，一般生长年限可达到10年左右，根系发达，茎叶繁茂。夏季它的茂密枝叶可以阻挡雨水对土壤的物理冲刷和地面径流，秋冬季地表覆盖度高，不会使表土受到大风的侵蚀，减少空气中风沙含量。在水土流失严重的黄土高原区被誉为“水保先锋”。紫花苜蓿根系发达入土深，一般可达到3-5米，最长可以达到10米以上，因此能吸收土壤深层的水分，抗旱能力自然就很高，而且庞大的根系上着生的大量根瘤，会进行生物固氮，每亩约固氮32.9公斤，相当于2460kg的硫酸铵，这样大大提高了土壤肥力，这一特性对草田轮作非常有利，可显著提高后茬作物的产量和品质，并减少了肥料的投入，降低了因大量的肥料投入而引起的环境污染。此外，近年来，用紫花苜蓿进行有机农药污染土壤修复的方法常有报道，如专利文献1（CN 101966529A）中公开了使用紫花苜蓿修复多氯联苯污染土壤的方法，专利文献2（CN 102228899A）中公开了使用紫花苜蓿修复苯胺类化合物污染土壤的方法。

然而，目前国内外对有机磷农药污染土壤实施生物修复的有效案例还很少，尤其在植物种类选择及植物修复机制研究上还缺乏深入系统的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种修复有机磷农药污染土壤的有效方法。

具体而言，本发明的方法是一种利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水；

（2）在紫花苜蓿种子上包覆含有有机磷农药降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂；

（3）对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；

（4）将包衣的紫花苜蓿种子播种到有机磷农药污染土壤中；

（5）出苗后进行田间管理。

步骤（1）中，优选在对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水之前，在有机磷农药污染土壤表面均匀喷洒质量浓度为0.05%的过氧化氢溶液。其中，所述耕翻、平整和灌水优选在过氧化氢溶液喷洒后24小时以内进行。

步骤（2）中，所述紫花苜蓿种子优选成熟、饱满、无虫蛀的种子，所述有机磷农药降解菌优选枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）和假单胞菌（Pseudomonas），所述苜蓿根瘤菌优选苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobiummeliloti）。

步骤（2）的工艺流程优选如下：把含有有机磷农药降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后，再加入紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂，种子与菌剂的质量比为1:7-10。其中，使用的粘着剂优选为选自羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶中的1种或2种以上。

步骤（3）的工艺流程优选如下：把由步骤（2）得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上一层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。其中，所述包衣材料优选为选自滑石粉、云母粉、陶土粉中的1种或2种以上。

步骤（4）中，优选的播种条件如下：播种方式为条播，播种量为1.5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。

本发明的方法能够有效进行土壤中有机磷农药的分解、降解和吸附，减少土壤中有机磷农药残留，并且具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点，为大面积修复有机磷农药污染土壤提供了有效方法。

附图说明

图1是表示本发明实施例具体步骤的流程图。

具体实施方式

本发明是一种利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水；

（3）对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；

（4）将包衣的紫花苜蓿种子播种到有机磷农药污染土壤中；

（5）出苗后进行田间管理。

本发明利用紫花苜蓿多年生、根系发达、可生物固氮以及可对污染土壤进行修复等生物特性并结合微生物修复技术进行有机磷农药污染土壤的生物修复。含有有机磷农药降解菌的菌剂通过包覆在紫花苜蓿种子上并通过包衣材料进一步的包裹作用，牢固地结合在紫花苜蓿种子上。当种子播入土壤中后，菌剂中包括有机磷农药降解菌在内的微生物就会随着种子的发芽、根系的生长和延伸，沿着紫花苜蓿的根系进行分布、繁殖。在有机磷农药降解菌的微生物修复和紫花苜蓿的植物修复的双重作用下，可有效分解、降解和吸附土壤表层乃至土壤深层污染的有机磷农药，从而有效减少土壤中有机磷农药残留。本发明的方法具有修复速度快、效果好、操作简单、处理量大、易于人工掌握等特点，是一种用于大面积修复有机磷农药污染土壤的有效方法。

在上述步骤（1）中，通过过氧化氢对有机磷农药的化学氧化降解反应，可以提高有机磷农药污染土壤的生物修复效果。另外，优选在过氧化氢溶液喷洒后24小时以内对土壤进行耕翻、平整和灌水。耕翻深度一般为15-30厘米，优选为20厘米。

在上述步骤（2）中，紫花苜蓿种子优选成熟、饱满、无虫蛀的种子。使用这样的种子，可以得到更好的土壤修复效果。另外，为了避免灰尘等对菌剂包覆的影响，优选将种子在常温的清水中进行清洗，之后自然条件下干燥。

苜蓿根瘤菌是与苜蓿共生形成根瘤并将空气中的氮还原成氨供植物营养的一类革兰氏阴性菌。通过在菌剂中加入苜蓿根瘤菌，可促进紫花苜蓿根系的生长和固氮，从而提高土壤的修复效果。作为苜蓿根瘤菌，优选苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meiiloti）。

对使用的有机磷农药降解菌没有特别限制，可以列举：枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、假单胞菌（Pseudomonas）、链球菌（Streptococcus）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、欧文氏菌（Erwinia）、库特氏菌属（Kurthia）、气单孢菌属（Aeromonas）等，但从降解速度、降解效果以及安全性的角度来讲，优选枯草芽胞杆菌。枯草芽胞杆菌代谢活动能够使土壤pH方式变化而引起有机磷农药降解，同时通过脱卤作用、脱烃作用、胺及酯的水解、还原作用以及环裂解等代谢活动产生某些辅助因子或化学物质参与有机磷农药的转化。

另外，还优选在菌剂中添加假单胞菌。假单胞菌是以极生鞭毛运动、不形成芽孢、化能有机营养、严格好氧、呼吸代谢、从不发酵的一类细菌，可以通过水解酶类和转移酶类作用于农药分子的P-O-烷基、P-O-芳基、O=P-NH₂、=C-NH₂，使有机磷农药降解。

作为菌剂，例如可以分别将枯草芽胞杆菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中、苜蓿中华根瘤菌在YMA液体培养基中、假单胞菌在LB液体培养基中进行培养，收集各菌后进行混合，得到复合菌剂。各菌的混合比（质量比）优选为，苜蓿中华根瘤菌：枯草芽胞杆菌：假单胞菌=1：5~10：1~5，更优选为1：7~8：4~5。

对步骤（2）的具体工艺没有特别限制，但优选使用如下方法：把含有有机磷农药降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后，再加入紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂。通过使用该方法，菌剂可通过粘着剂的作用牢固地粘附于种子上，菌剂在播种过程中不易从种子上脱落，播种后菌剂中的微生物可有效地沿着紫花苜蓿的根系进行分布、繁殖，从而提高了土壤的生物修复效果。

在上述方法中，种子与菌剂的质量比优选为1：7-10，更优选为1：8。

对使用的粘着剂没有特别限制，但从防止土壤污染的角度来讲，优选来源于植物或动物的粘着剂或者对这些粘着剂进行改性得到的粘着剂。作为这样的粘着剂，可以列举羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶等。这些粘着剂可单独使用或两种以上混合使用。

对步骤（3）的具体工艺没有特别限制，但优选使用如下方法：把由步骤（2）得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上一层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。通过使用该方法，可以使包衣材料均匀地包裹在种子外粘附的菌剂上，从而更有效地改善了菌剂与种子之间的复合作用，提高土壤的生物修复效果。

对使用的包衣材料没有特别限制，但从防止土壤污染的角度来讲，优选天然的矿物质材料。作为这样的包衣材料，可以列举滑石粉、云母粉、陶土粉等。这些包衣材料可单独使用或两种以上混合使用。从材料来源广泛、价格便宜的角度来讲，优选滑石粉。

步骤（4）的播种条件优选如下：播种方式为条播，播种量为1.5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。

步骤（5）中的田间管理是指及时的灌水、杂草防除和病虫害防治等。

实施例

下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实验分析所用的农药标准品：乐果(95.0%)、甲胺磷(99.0%)、马拉硫磷(97.0%)，均购于国家标准物质研究中心。上面括号内数字均为质量分数。

实验分析方法采用《中药中有机磷农药残留量的毛细管气相色谱测定方法》（分析测试学报，1999年18卷5期，15-17页）。

具体步骤如下（如图1所示）：

①有机磷污染土壤制作和处理：试验地选择在大连民族学院环境与资源学院实验基地，试验地面积300平方米，2010年5月17日用40质量%乐果500倍稀释液、50质量%甲胺磷乳油500倍稀释液、45质量%马拉硫磷乳油500倍稀释液进行均匀喷洒，喷洒后耕翻20厘米。耕翻24小时后，在土壤表面均匀喷洒0.05质量%的过氧化氢溶液。随机取5个土样进行有机磷分析。

②有机磷污染土壤耕作：喷洒质量浓度0.05%的过氧化氢溶液8个小时后进行20厘米耕翻、平整和灌水。

③紫花苜蓿种子的筛选、清洗和干燥：筛选成熟、饱满、无虫蛀的敖汉苜蓿（Medicago sativaL.cv.Aohan）种子0.7公斤（购自吉林省农业科学院畜牧科学分院草地研究所），在常温的清水中进行清洗后，自然条件下干燥。

④菌株培养和菌剂制作：取苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）（购自上海艾研生物科技有限公司）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）（购自湖北启明生物工程有限公司）和假单胞菌（Pseudomonas）（购自上海志研生物科技有限公司），分别在28℃的条件下于液体培养基中摇床培养48h后，收集各菌，混合各菌得到复合菌剂。所用菌株和使用的培养基为：苜蓿中华根瘤菌-YMA液体培养基（400ml）、枯草芽胞杆菌-牛肉膏蛋白胨液体培养基（3200ml）、假单胞菌-LB液体培养基（2000ml）；苜蓿中华根瘤菌：枯草芽胞杆菌：假单胞菌（质量比）=1：8：5。

⑤包覆菌剂：粘着剂使用羟甲基纤维素钠，取上述复合菌剂（约5600克）加入到质量浓度为5%的羟甲基纤维素钠水溶液（5000ml）中，搅拌均匀后，再加入种子，反复搅拌，使每一粒种子都粘有复合菌剂。

⑥种子包衣：包衣材料为滑石粉，把上述粘附有复合菌剂的种子放入到装有滑石粉的包衣机中，经过包衣机反复震荡混合包衣，使每一粒种子都裹上一层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。

⑦播种：2010年5月20日进行条播播种，播种量1.5-2公斤/亩，播种深度2-3厘米。

⑧田间管理：出苗后及时进行灌水、杂草防除和病虫害防治。

检测分析结果如下：

2011年5月20日随机取5个土样进行有机磷降解率分析，乐果、甲胺磷、马拉硫磷的降解率分别达到39%、58%、33%；2012年5月20日随机取5个土样进行有机磷降解率分析，乐果、甲胺磷、马拉硫磷的降解率分别达到67%、75%、61%，说明本发明的方法能够有效修复有机磷农药污染土壤。

Claims

1.一种利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水；

（3）对包覆有菌剂的紫花苜蓿种子进行包衣；

（4）将包衣的紫花苜蓿种子播种到有机磷农药污染土壤中；

（5）出苗后进行田间管理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，在对有机磷农药污染土壤进行耕翻、平整和灌水之前，在有机磷农药污染土壤表面均匀喷洒质量浓度为0.05%的过氧化氢溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在过氧化氢溶液喷洒后24小时以内进行耕翻、平整和灌水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述紫花苜蓿种子为成熟、饱满、无虫蛀的种子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述有机磷农药降解菌为枯草芽胞杆菌和假单胞菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述苜蓿根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）的工艺流程如下：把含有有机磷农药降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂加入到粘着剂中，搅拌均匀后，再加入紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每一粒种子上都粘有菌剂，种子与菌剂的质量比为1:7-10。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述粘着剂为选自羟甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、淀粉、明胶、阿拉伯树胶中的1种或2种以上。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）的工艺流程如下：把由步骤（2）得到的紫花苜蓿种子放入包衣机中，经过包衣机反复震荡混合，使每一粒种子都裹上一层包衣材料，最后将种子放于通风处，阴干待用。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述包衣材料为选自滑石粉、云母粉、陶土粉中的1种或2种以上。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，播种方式条播，播种量为1.5-2公斤/亩，播种深度为2-3厘米。