CN102755314A - 以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物和鬼臼毒素组成。其中，鬼臼毒素占总重量的5-20％，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为25-50％。本发明与传统的抗肿瘤药物鬼臼毒素相比较，具有更好的水溶性，可明显提高对肿瘤细胞的抑制作用，为进一步开发成可以有效治疗多种癌症的药物提供可能。

Description

以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种靶向药物组合物，尤其涉及一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物及其制备方法。

背景技术

鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PPT)是从小檗科鬼臼属植物中提得的天然化合物，主要用于尖锐湿疣，也可用于其他病毒疣。分子式：C₂₂H₂₂O₈；分子量：414.41。CAS登录号为4354-76-1；518-28-5，结构式如下：

鬼臼毒素对麻疹和I型单纯疱疹有拮抗活性。0.5％鬼臼毒素酊剂为世界卫生组织推荐的治疗性病尖锐湿疣的首选药物，临床实验证明治疗效果显著。作为抗肿瘤成分，有较强的细胞毒作用，由于不良反应多而限制其在肿瘤治疗方面的临床应用。为寻找毒性小、疗效高的抗肿瘤药，国内外学者对鬼臼毒素进行了结构修饰，合成了大量具有明显抗肿瘤活性的鬼臼毒素衍生物。其中由鬼臼毒素结构改造所得的衍生物依托泊苷(etoposide，VP-16)及其磷酸盐(etoposide phosphate或称e-topophos)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)已成为应用于临床的抗癌代表药物。它们对小细胞肺癌、睾丸癌、急性白血病以及恶性淋巴肿瘤等多种癌症均有良好的疗效。但也存在诸如抗癌谱较窄、水溶性差，以及较严重的骨髓抑制与胃肠道反应等缺点，限制了它们的应用。研究和开发高效、低毒的抗癌新药目前已成为医药领域的热点。鬼臼毒素因具有显著的抗癌活性而备受关注。

鬼臼毒素本身的抗肿瘤活性是通过破坏正在进行有丝分裂的细胞中的微管蛋白集结以及微管的形成，即阻止了微管蛋白形成微管，使细胞有丝分裂停止在M期，抑制了肿瘤细胞正常分裂，从而达到抗肿瘤作用。

随着纳米技术在生物学及医学领域的不断发展，壳聚糖及其衍生物作为一种新型靶向抗肿瘤药物载体，以其良好的组织相容性和靶向缓释特性，成为目前肿瘤靶向治疗的研究热点。因此以壳聚糖为载体包裹鬼臼毒素的抗肿瘤作用，值得进一步研究。

硬脂酸嫁接壳聚糖(CSO-SA)，嫁接物在水性介质中能够形成阳离子聚合物胶团，胶团由两亲性的聚合物在水溶液中自发形成，将难溶性药物鬼臼毒素包裹在聚合物内核，形成独特的核-壳结构。聚合物胶团能够携带疏水性鬼臼毒素聚集到肿瘤组织，具备较强的细胞膜穿透能力，通过生物膜的转运，靶向细胞核，以实现鬼臼毒素的抗肿瘤靶向治疗，提高药效，减少不良反应。

现有技术中尚未有采用硬脂酸嫁接壳聚糖-包裹鬼臼毒素，形成聚合物胶束作为抗肿瘤药物的应用的披露。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，选择硬脂酸嫁接壳聚糖作为药物载体，嫁接物在水性介质中能够形成阳离子聚合物胶团，聚合物胶团能够携带疏水性药物鬼臼毒素靶向细胞核，提高水溶性，以实现鬼臼毒素的抗肿瘤靶向治疗，提高药效，减少不良反应。

本发明的另一个目的是提供一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物的制备方法。

一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物和鬼臼毒素组成，其中鬼臼毒素占总重量的5-20％；壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量15.0-18.0KD壳聚糖与硬脂酸化学结合而成，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为25-50％。壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度优选为25％。

一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物的制备方法，将鬼臼毒素溶于乙醇；称取壳寡糖硬脂酸嫁接物于水中，超声30～40次后得壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液；将壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液与鬼臼毒素乙醇溶液混合，超声30～40次后，得鬼臼毒素载药胶团(CSO-SA/PPT)。之后，将得到的鬼臼毒素载药胶团装入透析袋透析24小时，除去乙醇，再将透析液冷冻干燥，得鬼臼毒素载药胶团(CSO-SA/PPT)固体粉末。

优选截流分子量为3.5KD的透析袋。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明对鬼臼毒素通过选择壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束进行包封，制备鬼臼毒素壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制剂，与传统的抗肿瘤药物鬼臼毒素相比较，具有更好的水溶性，可明显提高对肿瘤细胞的抑制作用，为进一步开发成可以有效治疗多种癌症的药物提供可能。

附图说明

图1是壳聚糖硬脂酸的IR图谱；

图2是鬼臼毒素的IR图谱；

图3是鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸聚合物的IR图谱；

图4不同投药量胶束的载药量和包封率；

图5鬼臼毒素(PPT)壳聚糖-硬脂酸胶束中鬼臼毒素的体外释放行为。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。

本发明实施例制取以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物的方法，具体如下：配置浓度为0.2mg/mL鬼臼毒素乙醇溶液。称取重量8-32mg的不同氨基取代度的壳寡糖硬脂酸嫁接物，置8mL的蒸馏水中，探头超声30～40次(500w，工作2s停3s)，得壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液。将壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液与鬼臼毒素乙醇溶液混合，冰浴条件下探头超声30～40次，制备不同投药比(如：5％、10％、15％和20％)的载药胶团。将混合液装入透析袋(MWCO 3.5KDa)，用500mL去离子水室温下透析24h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得鬼臼毒素载药胶团(CSO-SA/PPT)固体粉末。

实施例1

取32mg壳寡糖硬脂酸嫁接物(氨基取代度40％，壳聚糖平均分子量18.0KDa)，精密称定，置于8mL蒸馏水中，探头超声30～40次(500w，工作2s停3s)，得浓度为4mg/mL的壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液。加入药物浓度为0.2mg/mL鬼臼毒素乙醇溶液2mL，探头超声30次，制备投药比是5％的载药胶团。将混合液装入透析袋(MWCO 3.5KDa)，用500mL去离子水室温下透析24h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得鬼臼毒素载药胶束固体粉末。

图1是壳聚糖硬脂酸的红外光谱图，图1可见壳聚糖硬脂酸红外光谱图中有3个特征峰，分别是3428cm^-1、1634cm^-1、1075cm^-1。图2是鬼臼毒素的红外光谱图。图3是鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸聚合物的红外光谱图，壳聚糖硬脂酸载药胶团的3个特征峰分别是3412cm^-1、1632cm^-1、1074cm^-1。其中3428cm^-1处的O-H的伸缩振动峰红移了16cm^-1，这表明形成了一定强度的分子内和分子间氢键。红外图谱证明了鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸载药胶束的结构。

实施例2

取8mg壳聚糖硬脂酸嫁接物(氨基取代度50％，壳聚糖平均分子量15.0KDa)，精密称定，置于8mL蒸馏水中，探头超声30～40次(500w，工作2s停3s)，得浓度为1mg/mL的壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液。加入药物浓度为0.2mg/mL鬼臼毒素乙醇溶液2mL，探头超声30次，制备投药比是20％的载药胶团。将混合液装入透析袋(MWCO 3.5KDa)，用500mL去离子水室温下透析24h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得鬼臼毒素载药胶束(CSO-SA/PPT)固体粉末。

实施例3

取16mg壳聚糖硬脂酸嫁接物(氨基取代度25％，壳聚糖平均分子量18.0KDa)，精密称定，置于8mL蒸馏水中，探头超声30～40次(500w，工作2s停3s)，得浓度为2mg/mL的壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液。加入药物浓度为0.2mg/mL鬼臼毒素乙醇溶液2mL，探头超声30次，制备投药比是10％的载药胶团。将混合液装入透析袋(MWCO 3.5KDa)，用500mL去离子水室温下透析24h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得鬼臼毒素载药胶束(CSO-SA/PPT)固体粉末。

采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸载药胶团的粒径和表面电位，1.0mg/mL壳聚糖硬脂酸载体浓度的CSO-SA/PPT胶束的粒径大小是360.3nm，表面电位是40.9mV。药物包封率是70.2％，药物含量为7.02％，具体见图4。

取鬼臼毒素壳聚糖-硬脂酸胶束适量，用2.5mL去离子水分散，得到药物浓度为180μg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束溶液。取2.5mL溶液放入透析袋中(MWCO 3.5KDa)，扎紧袋口，将透析袋置于含有30mL PBS 7.4的释放管中，密塞，于37℃下水浴振摇，振荡频率为100次/min，定时取样1mL，同时补加介质1mL，HPLC测定药物浓度，计算药物的累积释放量。鬼臼毒素壳聚糖-硬脂酸胶束(CSO-SA/PPT)中鬼臼毒素的体外释放行为见图5。

实施例4

将“实施例3”得到的鬼臼毒素载药胶束(CSO-SA/PPT)固体粉末，用生理盐水配成所用浓度，考察鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸载药胶束对肿瘤细胞的毒性作用。采用四唑蓝比色法(MTT Assay)进行细胞毒性研究。取对数生长期的MCF-7、Bel-7402、A549细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清(FBS)的1640培养基调整细胞密度为1.0×10⁵/mL·孔，接种于24孔培养板，每孔1.0mL，置37℃，5％CO2孵箱培养24h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的CSO-SA、PPT和CSO-SA-PPT以及未处理的空白细胞为对照，每孔设3个复孔。正常1640培养基继续培养24h，然后加60μL MTT(5.0mg/mL)溶液，置于37℃，5％CO2孵箱继续培养4h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜400μL，振荡10min，用多功能酶标仪测定570nm处吸光度，计算细胞增殖抑制率，数据见表1。

表1鬼臼毒素-壳聚糖硬脂酸载药胶束对肿瘤细胞的毒性作用

Claims (5)

1.一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，其特征是由壳聚糖-硬脂酸嫁接物和鬼臼毒素组成，所述的鬼臼毒素占总重量的5-20％，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为25-50％。

2.根据权利要求1所述的以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，其特征是所述的壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量15.0-18.0KD壳聚糖与硬脂酸化学结合而成。

3.根据权利要求1所述的以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物，其特征是所述的壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为25％。

4.一种以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物的制备方法，其特征是将鬼臼毒素溶于乙醇；称取壳寡糖硬脂酸嫁接物于水中，超声30～40次后得壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液；将壳寡糖硬脂酸嫁接物胶束溶液与鬼臼毒素乙醇溶液混合，超声30～40次后，得鬼臼毒素载药胶团。

5.根据权利要求1所述的以鬼臼毒素为主要活性成分的药物组合物的制备方法，其特征是所述的透析袋的截流分子量为3.5KD。

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