CN102753684B - 增加大豆油脂中的油酸含量的突变体及其原因基因 - Google Patents

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Abstract

不使用基因重组技术而提供含有油酸的量高于目前为止开发的高油酸大豆的大豆。本发明提供包含GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因以及GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因的大豆品种。

Description

增加大豆油脂中的油酸含量的突变体及其原因基因
技术领域
本发明涉及对大豆的GmFAD2-1b基因导入功能缺失型突变而得到的大豆品种以及该导入了突变的基因。 
背景技术
大豆是世界上最大量生产的植物油脂供给源。植物油脂中包含的脂肪酸的组成直接影响油脂的品质，因此对大豆而言，脂肪酸组成的改变也是品种改良的主要课题。一般而言，在脂肪酸组成中，饱和脂肪酸含量高则油脂的品质稳定，但如果摄取这样的油脂，则低密度脂蛋白胆固醇的血中水平提高，因而营养学上不优选。此外，亚油酸等多元不饱和脂肪酸容易氧化而不稳定，在作为生物燃料使用的情况下，存在容易产生淤渣的问题。 
传统上，作为弥补多元不饱和脂肪酸的不稳定性的手段，进行加氢，但由于耗费成本而不经济，此外，作为副产物还会生成被认为是冠状动脉系疾病的风险因子的反式脂肪酸，因此不优选。与此相对，油酸等一元不饱和脂肪酸对氧化比较稳定，且能够降低血中胆固醇水平，因而富含油酸的大豆无论作为燃料源还是营养源都是优选的。 
从通常流通的大豆的种子获得的油脂的组成中，油酸量是20～25％左右，亚油酸量是50～57％，因而进行了许多以增加油酸含量为目的的品种改良。然而，目前为止开发出的品种尚未达到均有实用上充分的油酸含量。 
由目前为止的研究可知：为了增加植物油脂中的油酸含量，降低内质网型Omega-6脂肪酸不饱和化酶(FAD2)的活性是重要的(非专利文献1)，其催化将油酸不饱和化生产亚油酸的过程，编码该酶的FAD2基因成为品种改良时的靶标。作为利用了基因重组技术的FAD2基因修饰大豆，有报告称，已开发出采用共抑制法抑制了FAD2基因的表达的超高油酸大豆(系统名：260-05)，其油酸含量增加至约80％以上(专利文献1以及非专利文献2)。此外，还有报告称。通过利用基因重组降低编码参与饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例调节的棕榈酰ACP硫酯酶的基因的表达，增加了油酸含量(专利文 献2)。然而，这些高油酸大豆是基因重组体，最终未能被消费者接受，目前尚未进行食用目的的生产。 
因此，在以提供含有高油酸的食用大豆或大豆油为目的的情况下，希望不使用基因重组技术而提供高油酸大豆。以前，本发明人通过诱发突变制作了将作为FAD2基因之一的GmFAD2-1a基因的功能完全破坏的2种突变系统(M23以及KK21)，成功地将大豆的油酸含量从约25％倍增至50％以上(专利文献3以及非专利文献1)，但不采用基因重组技术而进一步增加油酸含量是困难的。 
专利文献1：特表平11-508961号公报 
专利文献2：特开2005-530506号公报 
专利文献3：特开2004-3号公报 
非专利文献1：Anai et al.，Breeding Science 58：447-452(2008) 
非专利文献2：Kinney and Knowlton.，Genetic Modification in the Food Industry.Blackie，London.193-213.PP.(1998) 
发明内容
本发明的课题是：提供含有高于目前为止开发的高油酸含量大豆的量的油酸的非基因重组型大豆。 
本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果成功地在野生型大豆的与GmFAD2-1a基因不同的FAD2基因——GmFAD2-1b基因中导入了功能缺失型的突变。于是发现具有该突变的大豆在兼具GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的情况下，油酸不会转化成亚油酸，具有非常高的油酸含有率，从而完成了本发明。 
即，本发明如下。 
[1]一种非基因重组型油酸高含量大豆，其中，编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因中导入了功能缺失型突变。 
[2]所述[1]所述的大豆，其中，油酸含量为大豆的总脂肪酸量的75％以上。 
[3]所述[1]所述的大豆，其具有以下的(a)～(e)中的至少1个特征。 
(a)种子的表皮的褶皱与野生型相比未增加 
(b)未生成构成实质性问题的量的亚油酸 
(c)总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)含量与野生型相比实质上未降低 
(d)总贮藏蛋白质量与野生型相比实质上未降低 
(e)可育性与野生型相比未降低 
[4]所述[1]所述的大豆，其中，所述功能缺失型突变是选自错义突变、无义突变、移码突变和无效突变中的任何突变。 
[5]所述[1]所述的大豆，其中，所述GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变是编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的包含于选自以下(1)～(8)中的区域中的氨基酸残基的密码子中发生的突变。 
(1)由第58位～第79位的氨基酸残基构成的区域 
(2)由第88位～第108位的氨基酸残基构成的区域 
(3)由第180位～第194位的氨基酸残基构成的区域 
(4)由第229位～第251位的氨基酸残基构成的区域 
(5)由第254位～第277位的氨基酸残基构成的区域 
(6)由第109位～第114位的氨基酸残基构成的区域 
(7)由第141位～第149位的氨基酸残基构成的区域 
(8)由第319位～第326位的氨基酸残基构成的区域 
[6]所述[5]所述的大豆，其中，所述氨基酸残基是第103位和/或第189位的氨基酸残基。 
[7]所述[5]所述的大豆，其中，所述突变是编码第103位和/或第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变。 
[8]所述[7]所述的大豆，其中，所述编码第103位的氨基酸残基的密码子的错义突变是由从甘氨酸的密码子到缬氨酸的密码子的取代引起的。 
[9]所述[7]所述的大豆，其中，所述编码第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变是由从苏氨酸的密码子到脯氨酸的密码子的取代引起的。 
[10]所述[5]所述的大豆，其具有由SEQ ID NO：3或5所示的碱基序列构成的基因。 
[11]所述[2]所述的大豆，其中，GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同。 
[12]非基因重组型油酸高含量大豆，其通过使保藏号为FERMBP-11249的KK21大豆与保藏号为FERM BP-11248的B12大豆杂交而得 到。 
[13]包含所述[1]～[12]中任一项所述的大豆或其处理物的药物组合物、食品或饲料。 
[14]从所述[1]～[12]中任一项所述的大豆或其处理物提取的大豆油。 
[15]包含所述[14]所述的大豆油的医药组合物用、食品用或饲料用材料。 
[16]由所述[1]～[12]中任一项所述的大豆或其处理物生成的燃料。 
[17]非基因重组型油酸高含量大豆的制造方法，其包括使所述[1]～[12]中任一项所述的大豆之间、或该大豆与其他大豆品种之间杂交。 
[18]非基因重组型油酸高含量大豆的制造方法，其包含选自以下的(i)～(iv)中的步骤。 
(i)使具有GmFAD2-1a基因的突变的大豆品种与具有GmFAD2-1b基因的突变的大豆品杂交的步骤 
(ii)对具有GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的步骤 
(iii)对具有GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的步骤 
(iv)对野生型大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的步骤 
[19]非基因重组型油酸高含量大豆的筛选方法，该方法包括： 
(a)使用包含所述[1]～[12]中任一项所述的大豆所具有的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位的碱基序列的寡核苷酸探针、和/或被制作成对所述基因的碱基序列及其互补序列中的至少一个进行扩增时的扩增片段中包含所述突变部位的寡核苷酸引物，对被检大豆的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因进行扩增处理和/或杂交处理的步骤；以及 
(b)检测所述基因的突变部位的步骤。 
[20]被制作成包含所述[1]～[12]中任一项所述的大豆所具有的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位的碱基序列的寡核苷酸。 
[21]所述[20]所述的寡核苷酸，其被制作成寡核苷酸的5’末端或者3’末端或中央的碱基是GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位。 
[22]所述[20]或[21]所述的寡核苷酸，其具有10～200个碱基的长度。 
[23]将所述[20]～[22]中任一项所述的寡核苷酸固定于支持体而得到的微阵列。 
[24]包含所述[20]～[22]中任一项所述的寡核苷酸和/或所述[23]所述的微阵列的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变检测用试剂盒。 
具有本发明的突变基因的大豆含有高含量的油酸，特别是在兼具GmFAD2-1a基因以及GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的情况下，显示约80％这样的极高的油酸含量。该油酸值可以认为完全满足油酸含量的希望基准值。而且，本发明的超高油酸含量大豆是可以不使用基因重组技术而获得的非基因重组大豆，因此完全能够获得消费者的认同，可以认为其作为食品、饲料以及药品的源材料材具有广泛的用途和实用性。 
此外，本发明的基因的突变可以使用用寡核苷酸制作的探针、引物等容易地进行检测。因此，通过使本发明的大豆与其他大豆品种杂交，并使用这些探针或引物，在其后代大豆的基因组DNA中选择包含本发明的突变基因的大豆系统，能够制作具有新特性的高油酸大豆品种。 
附图说明
图1为显示GmFAD2-1a以及GmFAD2-1b中具有功能缺失型突变的FH00ES04E11系统的种子的脂肪酸组成的气相色谱。峰1～5分别对应棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸以及α-亚麻酸。 
图2为显示仅GmFAD2-1a中具有功能缺失型突变的BC3F4系统的种子的脂肪酸组成的气相色谱。峰1～5的对应同图1。 
图3为显示GmFAD2-1a以及GmFAD2-1b中均不具有功能缺失型突变的FUKUYUTAKA的种子的脂肪酸组成的气相色谱。峰1～5的对应同图1以及图2。 
图4为显示对CELI核酸酶处理的切断模式进行解析的结果的图。 
图5为显示对限制酶的切断模式进行解析的结果的图。 
图6为显示各大豆中所含的蛋白质的组成的SDS-PAGE分析的结果的图。 
图7为显示对各大豆中所含的脂肪酸的组成用气相色谱进行分析的结果的图。 
图8是显示制造本发明的大豆的方法的模式图。 
图9是显示制造本发明的大豆的方法的模式图。 
发明的具体实施方式 
以下对本发明进行具体说明。以下的实施方式仅是用于说明本发明的示例，并不意味着本发明仅限于这些实施方式。本发明只要不脱离其要旨，可以以各种方式实施。 
而且，本说明书中引用的全部文献、和公开公报、专利公报等专利文献均并入本说明书中作为参照。此外，本说明书中包含作为本申请优先权基础的2009年6月22日申请的日本国专利申请(特愿2009-147706号)的说明书以及附图所述的内容。 
本发明人等对GmFAD2-1a基因具有功能缺失突变的大豆进一步实施突变处理，成功地对GmFAD2-1b基因导入了功能缺失型的突变，结果制作了GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因的两者中均有功能缺失突变的非基因重组大豆。该非基因重组大豆以高含量含有油酸。此外，对通过本发明得到的非基因重组型大豆进行细致观察，结果可知其具有以下的(a)～(e)的至少1个特征(表现型)。 
(a)种子的表皮的褶皱与野生型相比未增加 
(b)未生成构成实质性问题的量的亚油酸 
(c)总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量与野生型相比实质上未降低 
(d)总贮藏蛋白质量与野生型相比实质上未降低 
(e)可育性与野生型相比未降低 
因此，本发明提供具有上述突变的大豆、优选还具有上述(a)～(e)的至少1个特征的非基因重组大豆(以下称作“本发明的大豆”)。 
在本发明中，“大豆”是指：大豆的植物个体的全部或一部分，除了指植物个体之外，有些情况下还指该植物个体的器官(种子等)、该植物个体来源的细胞或细胞器等部分结构体。 
在本发明中，“非基因重组大豆”或“非基因重组型大豆”是指：未经利用基因重组技术的遗传性质的改变的大豆育种、即大豆原种以及通过对原种采用非基因重组技术导入基因突变进行品种改良而得到的大豆品种。 
在本发明中，“野生型”或“野生型大豆”是指：已有的非基因重组大豆，且该大豆品种通过具有正常的生物学功能而生成ω-6脂肪酸不饱和化酶。作为野生型大豆的例子，可以列举出“Bay”、“MURAYUTAKA”以及“FUKUYUTAKA”，但不限于此。 
在上述表现性状中，特征(a)是指：从1个大豆个体收获的“表皮不具有褶皱的种子”占大豆种子的总粒数的比例为60％以上、65％以上、70％以上、75％以上或80％以上，优选81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上或95％以上。该特征可以通过肉眼观察大豆种子来确认。 
对于上述特征(b)，“未生成构成实质性问题的量的亚油酸”是指：生成的亚油酸未达到加速油脂的氧化、降低稳定性的水平。 
具体地，上述特征(b)是指：亚油酸相对于总脂肪酸量的比例(即亚油酸含有率)为50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下或4％以下。 
亚油酸含有率可以通过对提取至大豆的油脂进行常规的油脂分析来测定；例如可以通过在公知文献(Anai et al.，Breeding Science 58：447-452(2008))中记载的条件下的气相色谱分析等来进行测定。但，测定方法不限于此。通过这样测定本发明的大豆的种子的亚油酸含量，可以确认上述特征(b)。 
上述特征(c)是指：本发明的大豆的总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量与野生型大豆的总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量相比，为实质上同等程度以上；例如本发明的大豆的总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量是野生型大豆的总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量的70％以上，优选75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。 
总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量可以通过对大豆、优选大豆种子中所含的蛋白质进行常规的蛋白质分析来测定。例如，可以利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Westthern印记、ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)、各种色谱分析等进行测定。通过对这样测定得到的本发明的大豆以及野生型大豆的β-伴大豆球蛋白含量进行比较，可以 对上述特征(c)进行确认。 
上述特征(d)是指：本发明的大豆中含有的蛋白质量与野生型大豆中含有的蛋白质量相比，为实质上同等程度以上；例如，本发明的大豆中含有的蛋白质量是野生型大豆中含有的蛋白质量的70％以上，优选75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。大豆、优选大豆种子中含有的蛋白质量可以采用上述特征(c)的记载中描述的测定方法等进行测定。通过对这样测定的本发明的大豆以及野生型大豆中含有的蛋白质量进行比较，可以对上述特征(d)进行确认。 
上述特征(e)是指：在使本发明的大豆之间杂交的的情况下，受粉引起的受精率与野生型大豆相比，为实质上同等程度以上。这里，“为实质上同等程度以上”是指：本发明的大豆的受粉引起的受精率与野生型大豆的受粉引起的受精率相比，在70％以上、优选75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的范围。受粉引起的受精率可以通过使大豆的雄蕊与雌蕊接触来人工受粉，并以形成的大豆的子房数占受粉的花的个数的比例的形式求出。通过对这样求出的本发明的大豆以及野生型大豆的受精率进行比较，可以对上述特征(e)进行确认。 
此外，本发明的大豆以油酸含量高为特征，本发明的大豆的油酸含量占大豆中所含的总脂肪酸量的30％以上，优选50％以上、更优选70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上或81％以上，更优选81.5％以上，更优选81.6％以上。油酸含量可以通过对从大豆提取的脂肪酸进行常规的油脂分析来容易地测定。例如，可以通过在诸如公知文献(Anai et al.，Breeding Science 58：447-452(2008))记载的条件下的气相色谱分析等来测定。但，测定方法不限于此。 
1.突变基因 
本发明的大豆优选在GmFAD2-1b基因和/或GmFAD2-1a基因中包含功能缺失型突变。在本发明中，“包含突变基因”是指：大豆细胞内保持突变基因，这样的大豆优选将该突变基因保持在该大豆的基因组中、更优选不依赖基因重组操作、例如作为突变或与其它品种杂交的结果而将突变基因保持在 基因组中的、非基因重组型的大豆。 
保持GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的大豆的种子内的总FAD2活性显著降低，特别是保持GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变以及GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变这两者的大豆的种子内，FAD2的功能基本上完全丧失，因而油酸不被转化为亚油酸。 
在本发明中，“GmFAD2-1a基因”以及”GmFAD2-1b基因”均是编码大豆(Glycine max(L.)Merr.)的微粒体ω-6脂肪酸不饱和化酶(ω-6 fatty acid desaturase：FAD2)的基因。此外，“编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的基因”是指：由编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列的核苷酸序列构成的基因区域，即所称的开放阅读框区域。“开放阅读框(ORF)”是指：被翻译成蛋白质的DNA或者RNA的区域，在基因中，ORF是指位于起始密码子和终止密码子间的序列。 
ω-6脂肪酸不饱和化酶是催化大豆内油酸转化成亚油酸的反应的酶，作为编码该酶的基因，确认有GmFAD2-1a、GmFAD2-1b、GmFAD2-2a、GmFAD2-2b以及GmFAD2-2c，这其中，已知仅GmFAD2-1a以及GmFAD2-1b在发生阶段的种子中特异性表达(Anai et al.，Breeding Science58：447-452(2008))。GmFAD2-1a和GmFAD2-1b是分别位于连锁群LGO和LGI的基因，具有作为GenBank Accession No.AB188250.1和AB188251.1登录的碱基序列。它们在ORF碱基序列方面显示94％的同源性，包含5个残基的不同氨基酸。 
编码FUKUYUTAKA来源的野生型ω-6脂肪酸不饱和化酶的GmFAD2-1b基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，此外，该酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。此外，FUKUYUTAKA来源的野生型GmFAD2-1a基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：14，野生型GmFAD2-1a酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO：15。 
在本发明中，“功能缺失型突变(loss of function mutation)”是指：该基因编码的蛋白质等失去其生物学功能的突变，可以是完全失去功能的无效等位基因(amorph)型，也可以是部分失去功能的亚等位基因(hypomorph)型，优选FAD2功能完全缺损的无效等位基因型。此外，交配型可以是纯合型，也可以是杂合型，优选纯合交配型。这种情况下，完全失去功能是指：实质上无法确认到FAD2的功能，例如指：将野生型的功能活性定未100％的情况下， 突变体仅显示10％以下、优选5％以下、更优选3％以下、更优选1％以下、最优选0.1％以下的功能活性。此外，部分失去功能是指：与野生型相比，突变体仅显示90％以下、优选70％以下、更优选60％以下、更优选50％以下、更优选40％以下、最优选30％以下的功能活性。 
对于GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因没有特殊限制，只要GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1b基因编码的FAD2丧失其FAD2活性即可；优选是导入了选自编码FAD2的GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1b基因中的错义突变、无义突变、移码突变以及无效突变中的任何突变的功能缺失型突变基因。 
GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变优选在编码FAD2的氨基酸序列中的包含于选自以下(1)～(8)中的区域中的氨基酸残基的密码子中产生。 
(1)由第58位～第79位的氨基酸残基构成的区域 
(2)由第88位～第108位的氨基酸残基构成的区域 
(3)由第180位～第194位的氨基酸残基构成的区域 
(4)由第229位～第251位的氨基酸残基构成的区域 
(5)由第254位～第277位的氨基酸残基构成的区域 
(6)由第109位～第114位的氨基酸残基构成的区域 
(7)由第141位～第149位的氨基酸残基构成的区域 
(8)由第319位～第326位的氨基酸残基构成的区域 
所述FAD2的氨基酸序列优选是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，(1)～(8)的区域的氨基酸序列如下。 
(1)第58位～第79位的氨基酸Leu Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Ser Leu Ala Phe Ile Phe Tyr Ile Ala Thr Thr Tyr Phe His(SEQ ID NO：16) 
(2)第88位～第108位的氨基酸：Ile Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Val Leu Gln Gly Cys Ile Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala(SEQ ID NO：17) 
(3)第180位～第194位的氨基酸：Leu Gly Arg Ala Ala Ser Leu Leu Ile Thr Leu Thr Ile Gly Trp(SEQ ID NO：18) 
(4)第229位～第251位的氨基酸Ile Tyr Val Ser Asp Val Ala Leu Phe Ser Val Thr Tyr Leu Leu Tyr Arg Val Ala Thr Met Lys Gly(SEQ ID NO：19) 
(5)第254位～第277位的氨基酸：Trp Leu Leu Cys Val Tyr Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Thr Ile Thr Tyr Leu Gln(SEQ ID NO：20) 
(6)第109位～第114位的氨基酸His Glu Cys Gly His His(SEQ ID NO：21) 
(7)第141位～第149位的氨基酸：Trp Lys Ile Ser His Arg Arg His His(SEQ ID NO：22) 
(8)第319位～第326位的氨基酸：His Val Ala His His Leu Phe Ser(SEQ ID NO：23) 
上述(1)～(8)中，(1)～(5)所示的区域是FAD2的跨膜区域中所含的区域，(6)～(8)所示的区域是该FAD2的组氨酸盒子中所含的区域。跨膜区域是对FAD2的结构稳定化而言重要的部位，而组氨酸盒子是与金属离子的结合部位、是对FAD2酶的活性化而言重要的部位。因此，可以认为，在这些区域产生突变的情况下，FAD2酶丧失其活性。所述突变优选在上述(1)～(8)的氨基酸区域中的(1)～(3)的区域发生。 
本发明的大豆中发生的功能缺失型突变是错义突变、无义突变、移码突变、无效突变或它们的组合，优选编码选自所述(1)～(8)中的区域中所含的氨基酸残基的密码子中发生的突变是错义突变。作为因错义突变而发生的氨基酸取代，可以列举出例如亲水性氨基酸到疏水性氨基酸的取代、或者疏水性氨基酸到亲水性氨基酸的取代。作为亲水性氨基酸的例子，可以列举出Gly、Thr、Ser、Tyr、Cys、Gln以及Asn。另一方面，作为疏水性的氨基酸残基的例子，可以列举出Val、Pro、Leu、Trp、Leu、Phe、Ala、Met以及Ile。 
更优选地，GmFAD2-1b基因中的突变是编码FAD2酶的氨基酸序列中的第103位和/或第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变。例如，所述第103位的错义突变是甘氨酸的密码子到甘氨酸以外的19种氨基酸(Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)的密码子的取代而引起的，更优选甘氨酸的密码子(GGT、GGC、GGA、GGG)到缬氨酸的密码子(GTT、GTC、GTA、GTG)的取代而引起的；所述第189位的错义突变是苏氨酸的密码子到苏氨酸以外的19种氨基酸(Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Gly、Trp、Tyr、Val)的密码子的取代而引起的，更优选苏氨酸的密码子(ACT、ACC、ACA、ACG)到脯氨酸的密码子(CCT、CCC、CCA、CCG)的取代而引起的；或者，还可以包含所述第103位的突变和所述189位的突变的组合。 
最优选，GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因具有SEQ ID NO：3或5所示的碱基序列。SEQ ID NO：3是野生型的GmFAD2-1b基因的碱基序列(SEQ ID NO：1)的第308位的碱基被从鸟嘌呤(G)取代为胸腺嘧啶(T)而得到的功能缺失突变型GmFAD2-1b基因的碱基序列，通过该取代，SEQ ID NO.3的碱基序列编码的FAD蛋白质具有野生型的FAD的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第103位的氨基酸残基被从甘氨酸取代成缬氨酸而得到的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：5是野生型的GmFAD2-1b基因的碱基序列(SEQ ID NO：1)的第565位的碱基被从腺嘌呤(A)取代成胞嘧啶(C)而得到的功能缺失突变型GmFAD2-1b基因的碱基序列，通过该取代，SEQ ID NO.5的碱基序列编码的FAD蛋白质具有野生型的FAD的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的第189位的氨基酸残基被从苏氨酸取代成脯氨酸而得到的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。 
这里，“FAD2活性”是指：催化大豆细胞、优选大豆种子细胞内油酸转化成亚油酸的反应的活性。 
ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的第103位以及第189位的氨基酸残基分别是将GmFAD2-1b基因的起始密码子编码的甲硫氨酸定为第1位的氨基酸残基、向羧基末端侧依次查数氨基酸残基时的第103位以及第189位的氨基酸残基。因此，编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的第103位以及第189位的氨基酸残基的密码子分别是指：由将位于GmFAD2-1b基因的开放阅读框的5’末端的核苷酸定为1位的核苷酸时的307～309位的核苷酸以及565～567位的核苷酸的碱基序列构成的密码子。 
在本发明中，“错义突变”是指：通过核酸序列的密码子内的碱基的变化或取代，该密码子编码的氨基酸的种类发生变化的突变。 
在本发明中，“无义突变”是指：通过核酸序列的密码子内的变化或取代，该密码子变化成终止密码子、处于该密码子3’侧的ORF区域变得不被翻译的突变。无义突变也称终止突变。 
在本发明中，“移码突变”是指：通过碱基的插入或缺失，处于该插入或缺失部位的3’侧的区域中密码子的阅读框发生偏移的突变。 
在本发明中，“无效突变”是指：编码该蛋白质的核苷酸序列完全缺失、或即使存在核苷酸序列也不表达功能性蛋白质的突变。 
在野生型FAD2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中，第103位的氨基酸残 基是甘氨酸。与此相对，本发明的某方式中，就FAD2而言，在通过FAD2的氨基酸序列的第103位的氨基酸残基中包含错义突变而FAD2活性丧失、特别是通过该错义突变而FAD2的氨基酸序列的第103位的氨基酸残基(甘氨酸)被取代成甘氨酸以外的19种氨基酸例如缬氨酸时(SEQ ID NO：4)，更具体地在编码FAD2的碱基序列中、与第103位的氨基酸的对应的密码子的碱基序列是“GTC”时(SEQ ID NO：3)，GmFAD2-1b基因无法生成功能性FAD2。 
此外，在野生型FAD2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中，第189位的氨基酸残基是苏氨酸。在本发明的某方式中，就FAD2而言，在通过FAD2的氨基酸序列的第189位的氨基酸残基中包含错义突变而FAD2活性丧失、特别是通过该错义突变而FAD2的氨基酸序列的第189位的氨基酸残基(苏氨酸)被取代成苏氨酸以外的19种氨基酸例如脯氨酸时(SEQ ID NO：6)，更具体地在编码FAD2的碱基序列中、与第189位的氨基酸对应的密码子的碱基序列是“CCA”时(SEQ ID NO：5)，GmFAD2-1b基因无法生成功能性FAD2。 
即，在具有SEQ ID NO：1所示的野生型GmFAD2-1b基因的第308位的核苷酸残基从鸟嘌呤取代成胸腺嘧啶的单碱基多态(Single Nucleotide Polymorphism：SNP)时(SEQ ID NO：3)或具有第565位的腺嘌呤取代成胞嘧啶的SNP时(SEQ ID NO：5)，FAD2的第103位的氨基酸残基被从甘氨酸取代成缬氨酸、或第189位的氨基酸被从苏氨酸取代成脯氨酸，因此，可以说由这样的序列构成的GmFAD2-1b基因是功能缺失型突变基因。在本发明中，GmFAD2-1b基因只要所编码的FAD2功能缺失即可，核苷酸序列的第308位或第565位以外的核苷酸可以因缺失、插入或取代等而突变。即，可以是与由SEQ ID NO：3或5所示的碱基序列的互补碱基序列构成的核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有FAD2活性的蛋白质的基因的功能缺失型突变基因。优选地，GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或5所示的序列具有85％以上的同源性、更优选具有90％以上、更优选95％以上、更优选98％以上、最优选99％以上的同源性。具有这样的突变的基因也包含在本发明中。 
SEQ ID NO：3所示的碱基序列是FH00ES04E11系统来源的突变型GmFAD2-1b基因的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：1所示的野生型GmFAD2-1b基因的第308位的核苷酸被从鸟嘌呤取代成胸腺嘧啶的突变。 另一方面，SEQ ID NO：5所示的碱基序列是E015B12系统来源的突变型GmFAD2-1b基因的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：1所示的野生型GmFAD2-1b基因的第565位的核苷酸被从腺嘌呤取代成胞嘧啶的突变。 
“严格条件”是指：例如、盐(钠等)浓度为150～900mM、且温度为55～75℃的条件，优选盐(钠等)浓度为250～450mM、且温度为62～70℃的条件。 
这里，“具有FAD2活性的蛋白质”或“功能性FAD2”是指：具有与催化大豆细胞、优选大豆种子细胞内油酸转化成亚油酸的反应的内质网型Omega-6脂肪酸不饱和化酶(FAD2)同一活性的蛋白质。因此，“不表达具有FAD2活性的蛋白质”是指：作为结果，不生成具有FAD2活性的蛋白质，例如因编码该蛋白质的核苷酸序列不存在、编码该蛋白质的具有上述催化剂功能的结构域的氨基酸序列的核苷酸不存在、编码所述蛋白质的核苷酸序列虽存在但该核苷酸序列不能转录、或作为编码所述蛋白质的核苷酸序列的转录产物的信使RNA(mRNA)不能翻译等各种原因，不表达具有FAD2活性的蛋白质。 
FAD2的活性可以例如使用作为酵母的酿酒酵母(S.cerevisiae)来测定。S.cerevisiae不具有亚油酸等多元不饱和脂肪酸的合成能力，可以测定其细胞内因重组表达作为对象的GmFAD2-1b基因而获得的亚油酸量，作为该GmFAD2-1b基因编码的FAD2的活性量。使用S.cerevisiae进行测定的详细情况记载于Anai，T et al.(Plant Science，106，1615-1623(2005))，其适用于本发明。 
2种以上核苷酸序列或氨基酸序列的同源性可以通过确定测定同源性的对象序列中的作为基准的序列(例如SEQ ID NO：3或5所示的序列)、并针对该基准序列比对其他序列，来测定。这样的比对可以通过使用多阵列算法来进行，作为使用这样的算法的计算机软件，可以列举出可从欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute：EBI)获得的ClustalW等。 
GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变可以通过对Bay、ORERICH50(オレリツチ)或FUKUYUTAKA等的大豆品种按常规方法实施X射线照射ゃ甲磺酸乙酯(EMS)等诱变剂处理来获得。例如，在通过X射线照射导入突变的情况下，通过对干燥种子以100Gy～300Gy的照射量照射1次以上，能够导入突变。此外，在进行EMS处理的情况下，通过进行1次以上的使用0.1重量％～0.5重量％的浓度的EMS的30分～24小时的EMS曝露，可以导入突变。在进行EMS处理的情况下，如用上述浓度进行处理，则能够将对GmFAD2-1b基因附近的其他基因的影响最小化，主要对目的区域导入突变。
本发明的大豆优选除了GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变之外，还具有GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变。这是因为：作为在种子内表达的编码FAD2的基因，仅鉴定出GmFAD2-1a以及GmFAD2-1b，在这两个基因丧失功能的情况下，在大豆种子中，油酸向亚油酸的转化显著降低，油酸含量变得非常高。 
在本发明中，“GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变基因”是指：GmFAD2-1a所编码的FAD2丧失功能即可，没有特殊限制，优选GmFAD2-1a基因中导入选自错义突变、无义突变、移码突变以及无效突变中的任何突变而得到的功能缺失型突变基因，更优选GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同，最优选与M23大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同。 
“错义突变”、“无义突变”、“移码突变”、“无效突变”的说明如上述。 
在本发明中，作为“M23大豆的GmFAD2-1a基因的突变”，可以列举出例如Anai et al.，Breeding Science58：447-452(2008)中记载的M23大豆的GmFAD2-1a基因的突变。具体地是在使用被设计成扩增包含作为M23的亲品种的Bay的GmFAD2-1a基因的ORF区域的核酸序列的以下引物： 
5’-attgatagcccctccgttcccaaga-3'(SEQ ID NO:7) 
5'-atacacacaaagtcattacgcggcaa-3'(SEQ ID NO:8) 
进行聚合酶链反应(PCR)，对其PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，使得使用亲品种的基因组DNA作为模板链的情况下能够检测到的约1.3Kbp的条带在使用M23的基因组DNA作为模板链的情况下检测不到的突变，且是野生型GmFAD2-1a基因的ORF全体的核苷酸缺失的突变。(参照特开2004-3号公报以及Anai et al.，Breeding Science58：447-452(2008))。关于PCR以及琼脂糖凝胶电泳，可以参照以下：Sambrook，Fritsch and Maniatis，”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press。 
在本发明中，作为“KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变”，可以列举出例如Anai et al.，Breeding Science58：447-452(2008)中记载的KK21大豆的GmFAD2-1a基因的移码突变。有报告称，KK21的突变显示于M23的突变等同的效果(Anai et al.，Breeding Science 58：447-452(2008))。具体地是指：野生型GmFAD2-1a基因的ORF(SEQ ID NO：14)的232位的胸腺嘧啶碱基缺失、缺失部位3’侧的区域发生框移的突变。该突变的存在可以例如这样检测：使用以下的引物组： 
5’-attgatagcccctccgttcccaaga-3’(SEQ ID NO：9) 
5’-attgtgagtgtgacgagaagagaaac-3’(SEQ ID NO：10) 
进行PCR反应，扩增出GmFAD2-1a基因的碱基序列的一部分，然后将经纯化的DNA片段作为模板，使用例如以下的引物： 
5’-gggtctagcaaaggaaacaacaatgggaggt-3’(SEQ ID NO：11) 
进行测序，确认ORF的232位的胸腺嘧啶碱基的缺失。关于测序法，可以参照以下：Sambrook，Fritsch and Maniatis，”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press。 
GmFAD2-1a基因编码的FAD2的活性也可以像GmFAD2-1b基因所编码的FAD2的活性那样，使用酵母S.cerevisiae来测定。Anai，T et al.(Plant Science，106，1615-1623(2005))。 
GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变也可以像GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变那样，通过对Bay、ORERICH50或FUKUYUTAKA等大豆品种实施X射线照射、或者EMS等诱变剂处理来导入。 
2.本发明的大豆的制作方法 
本发明的大豆可以通过以下(i)～(iv)的任何步骤来制作。 
(i)使具有GmFAD2-1a基因的突变的大豆品种与具有GmFAD2-1b基因的突变的大豆品种杂交的步骤 
(ii)对具有GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的步骤 
(iii)对具有GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的步骤 
(iv)对野生型大豆品种实施诱变剂或X射线处理，诱发GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的步骤 
上述步骤(i)的具体例如图8所示。在图8中，通过使作为GmFAD2-1a基因突变大豆品种的KK21与作为GmFAD2-1b基因突变大豆品种的B12杂交，制造超高油酸大豆。但是，步骤(i)中使用的大豆品种不限于GmFAD2-1a基因突变大豆品种以及GmFAD2-1b基因突变大豆品种。 
上述步骤(ii)的具体例如图9所示。图9示出了通过对作为GmFAD2-1a基因突变大豆品种的BC3F4实施EMS处理，来制造超高油酸大豆的步骤。但是，步骤(ii)中使用的大豆品种不限于GmFAD2-1a基因突变大豆品种。 
上述步骤(iii)的具体例方法可以列举出将图9所示的GmFAD2-1a基因突变大豆品种替换成B12或E11等GmFAD2-1b基因突变大豆品种。但是，可使用的大豆品种不限于在步骤(iii)中使用的GmFAD2-1b基因突变大豆品种。 
上述步骤(iv)示出了通过对野生型大豆(例如FUKUYUTAKA)实施EMS处理，对GmFAD2-1b以及GmFAD2-1a两基因诱发功能缺失型突变，来制造超高油酸大豆的步骤。但是，在步骤(iv)中野生型大豆不限于FUKUYUTAKA。 
作为GmFAD2-1a基因突变大豆品种的例子，可以列举出ORERICH50、M23以及KK21；作为GmFAD2-1a基因突变大豆品种的例子，可以列举出E015B12或FH00ES04E11系统(以下分别称作“B12”或“E11”)。这些大豆品种中，KK21以及B12在2010年4月22日分别以保藏号“FERM BP-11249”以及“FERM BP-11248”国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。 
上述M23、KK21、B12、K21x B12以及E11各系统的种子保藏在佐贺大学农学部( 840-8502佐贺市本庄町1番地)。 
3.用途 
在本发明中，“药物”是指：用于通过施用于人、动物等对象，来进行对象的疾病的诊断、治疗或预防的物，包括准标准药物(医薬部外品)，只要具有这样的效能即可。已知大豆中所含的异黄酮对雌激素受体显示激动剂作用，可用作骨疏松症的治疗药。此外，因为本发明的大豆中富含油酸，因此作为包含本发明的大豆或其处理物的药物，除了传统的大豆的效能之外，还可以考虑以利用降低油酸血中胆固醇水平为目的的药物。作为这样的药物的对象疾病，可以列举出高脂血症、动脉硬化症、糖尿病等。 
“大豆的处理物”是指：对大豆实施例如酶处理、粉末化、干燥、加热、冻结、纯化等处理而得到的物。 
在本发明中，“食品”是指：以营养素的摄取、嗜好为目的而饮用食用的物。大豆自古被作为食品摄取。本发明的大豆可以作为枝豆这样的生鲜食品食用，也可以作为纳豆这样的发酵食品食用，还可以作为干燥豆、味噌、酱油、豆腐、豆腐皮、豆乳、炒豆粉这样的加工食品饮用食用。本发明的大豆可以作为非基因重组大豆而获得，因而可以期待将其用于饮用食用时消费者的抵触少。此外，本发明的大豆中富含油酸，因而可以期待作为食品摄取时血中胆固醇水平降低，可以认为对生活习惯病的预防有效。或者，还可以在用于获得这样的效果的滋补品、健康功能食品、特定保健用食品中使用本发明的大豆。 
在本发明中，“饲料”是指：作为饵料给予饲养动物的物，“饲养动物”包括家畜、家禽、养殖鱼、宠物等。大豆广泛用作牛、猪、鸡等家畜、家禽用饲料、宠物食品。在作为饲料摄取本发明的大豆的情况下，因其高油酸含量，可以期待血中胆固醇水平降低，可以认为对饲养动物的健康维系以及健康促进有贡献。除此之外，可以期待食用肉、鸡蛋中的油酸含量的增加，也可以期待食用它们时的效果。 
在本发明中，“大豆油”是指：从大豆或其处理物采集的油脂。大豆油除了用作油炸食品用油、色拉油之外，还广泛作为人造奶油、蛋黄酱的原料使用。此外，除了食用以外，因其透明性好，还被用作大豆油墨。从本发明的大豆提取的大豆油为高油酸含量，因而不仅可以对摄取者的健康促进做出贡献，还可以实现在高温使用的情况下对氧化非常稳定的优势效果。 
此外，从本发明的大豆提取的大豆油的油酸含有率高，还可以以血中胆固醇水平的降低为目的，作为药物用、食品用或饲料用的材料而使用。 
在本发明中，“燃料”是指：通过引发化学反应而产生能量的物。本发明中的燃料没有特殊限制，只要是能够以大豆作为原料生产的燃料即可，作为优选的例子，可以列举出生物柴油。生物柴油是指从生物来源的油制备的柴油发动机用燃料。在从传统的大豆这样的富含亚油酸等多元不饱和脂肪酸的原料制备生物柴油的情况下，存在的问题是容易因加热而产生淤渣。然而，在从本发明的大豆制备生物柴油的情况下，因为一元不饱和脂肪酸的油酸的含有率高，所以不易产生淤渣，可以期待提供对氧化稳定的高品质的生物柴 油。关于生物柴油燃料的制造方法以及利用方法，可以利用“生物柴油燃料的制造-利用指南”(日本全国生物柴油燃料利用推进协议会、2008年5月30日发行)中记载的方法。 
4.品种杂交 
具有本发明的大豆的特征的新种的非基因重组大豆可以通过使本发明的大豆品种之间、或者本发明的大豆品种与其他非基因重组大豆品种杂交来制作。这样得到的大豆也以高含量含有油酸，此外，具有以下的(a)～(e)的至少1个特征。 
(a)种子的表皮的褶皱与野生型相比未增加 
(b)未生成构成实质性问题的量的亚油酸 
(c)总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量与野生型相比实质上未降低 
(d)总贮藏蛋白质量与野生型相比实质上未降低 
(e)可育性与野生型相比未降低 
优选通过使本发明的大豆品种使其他非基因重组大豆品种杂交，能够制作具有GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变(以及GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变)的新种的非基因重组大豆。例如，通过使本发明的大豆品种与对特定害虫和/或栽培条件具有抗性的其他非基因重组大豆品种杂交，能够制作油酸含量高、且对特定的害虫和/或栽培条件具有抗性的新种的非基因重组大豆。 
在本发明中，“杂交”是指：遗传构成不同的2个体间的杂交，作为其结果形成杂种。作为杂交方法，优选回交。为了在通过杂交获得的新种大豆中实现高油酸含量，有必要使GmFAD2-1b基因(以及GmFAD2-1a基因)编码的FAD2的活性基本完全丧失，因而，有必要通过将该新种大豆与本发明的大豆品种进行回交，来获得GmFAD2-1b基因突变(以及GmFAD2-1a基因突变)的纯合体。“回交”是指：通过使具有突变的亲A和不具有突变的亲B(Bay以及FUKUYUTAKA等现有大豆品种)所生的子与亲B(Bay以及FUKUYUTAKA等现有大豆品种)进行杂交，来获得保持突变型基因、且具有亲B的特性的后代的方法。 
5.筛选方法 
本发明的大豆优选在GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1b基因中具有功 能缺失型突变，因此通过检测它们中任何基因(或两基因)的突变，能够筛选上述油酸高含量大豆、或者上述具有(a)～(e)的至少1个特征的大豆。 
作为GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因的检测方法，可以列举出包括： 
(a)使用包含本发明的大豆所具有的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位的碱基序列的寡核苷酸探针、和/或被设计成对所述基因的碱基序列及其互补序列中的至少一个进行扩增时的扩增片段中包含所述突变部位的寡核苷酸引物，对被检大豆的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因进行扩增处理和/或杂交处理的步骤；以及 
(b)通过对所述处理物进行分析，检测突变部位的步骤的方法。 
作为这样的检测方法的具体例，可以列举出PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法等公知方法，特别是在功能缺失型突变是SNP的情况下，可以列举出Invader法、TILLING法，但不限于此。 
在PCR法的情况下，优选制作3’末端部分具有与突变部位的碱基序列互补的序列的引物。如果这样设计的引物，则在作为模板的样品具有突变的情况下，引物完全与模板杂交，聚合酶延伸反应得以进行；而在模板不具有突变的情况下，引物的3’末端的核苷酸与模板发生错配，因而延伸反应不发生。因此，使用这样的引物进行PCR扩增、并通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳等分析，如果能够确认指定大小的扩增产物，则可以判断作为样品的模板具有突变；而扩增产物不存在的情况下，可以判断模板不具有突变。对于PCR以及琼脂糖凝胶电泳，可以参照以下：Sambrook，Fritsch and Maniatis，”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press。 
TaqMan PCR法是利用了使用荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸和Taq DNA聚合酶进行的PCR反应的方法(Livak，K.J.Genet.Anal.14，143(1999)；Morris T.et al.，J.Clin.Microbiol.34，2933(1996))。 
测序法是通过对含突变的区域进行PCR扩增、并使用Dye Terminator等进行DNA序列的测序，来解析突变的有无的方法(Sambrook，Fritsch and Maniatis，”Molecular Cloning：A Laboratory Manual”2nd Edition(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。 
DNA微阵列是通过将核苷酸探针的一端阵列状地固定于支持体上而得到的，包括DNA芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。作为DNA芯片等的DNA微阵列试验，可以列举出GeneChip试验(参照Affymetrix公司；美国专利第6,045,996号、同第5,925,525号、以及同第5,858,659号)。GeneChip技术利用了附于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列。 
Invader法是组合了SNP等基因多型的各等位基因特异性的2种报告探针以及1种Invader探针对模板DNA的杂交，和利用具有识别DNA的结构并切断这样的特殊内切核酸酶活性的Cleavase酶进行的DNA切断的方法(Livak，K.J.Biomol.Eng.14，143-149(1999)；Morris T.et al.，J.Clin.Microbiol.34，2933(1996)；LyamicheV，V.et al.，Science，260，778-783(1993)等)。 
TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法是通过PCR扩增和CEL I核酸酶处理对突变导入后的突变体集团的基因组中的突变错配进行筛选的方法。根据TILLING法，例如通过使用以下的引物组，对样品中的含GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因的ORF的区域进行PCR扩增，并对其PCR产物进行CEL I核酸酶处理，可以确认突变的有无。 
GmFAD2-1b基因的情况： 
5’-tctgtcacttccctccattcattttg-3’(SEQ ID NO：12) 
5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
GmFAD2-1a基因的情况： 
5’-attgatagcccctccgttcccaaga-3’(SEQ ID NO：7) 
5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
CEL I核酸酶是特异性切断双链DNA的错配部分的内切核酸酶。在样品的GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因中包含突变的情况下，上述PCR产物中产生错配部分；而在不含突变的情况下，不产生错配。因此，在存在突变的情况下，PCR产物的错配配对部位被切断；而在不存在突变的情况下，PCR产物不被切断。因此，通过对CEL I核酸酶处理后的PCR产物用琼脂糖电泳等进行分析、并比较核酸序列的长度，能够容易地确认突变的有无。CEL I核酸酶的详情可以参照以下的文献：Oleykowski et al.，Nucleic Acids Research，vol.26，No.20，4597-4602(1998)。 
在上述示例的突变检测方法中，被制作成GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变部位的寡核苷酸，可作为探针或引物使用。因此，本发明提供被设计成包含GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变部位的寡核苷酸。 
在采用Invader法检测GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的情况下，所用的引物或者探针设计成SNP部位存在于该引物或者探针的碱基序列的3’或者5’端，或设计成存在于互补序列的3’或者5’端，或设计成存在于前2者(引物或者探针、或互补序列)的3’或者5’端起4个碱基以内、优选2个碱基以内。或者，设计成寡核苷酸的碱基序列全长的中央存在SNP。“中央”是指：使得SNP的碱基距5’端的碱基数与距3’端的碱基数基本相同的中心部的区域，在寡核苷酸的碱基数是奇数的情况下，“中央”优选是中心部的5个碱基、更优选中心部的3个碱基、更优选最中心部的1个碱基。此外，在寡核苷酸的碱基数是偶数的情况下，“中央”优选中心部的4个碱基、更优选中心部的2个碱基。 
此外，在将本发明的寡核苷酸在Invader法中作为等位基因探针使用的情况下，该寡核苷酸优选是与包含所述功能缺失型突变部位的GmFAD2-1b基因序列或者GmFAD2-1a基因、或其互补序列杂交的片段，和不杂交的片段(flap部分)通过所述功能缺失型突变部位的基因序列或其互补序列结合而成。 
在使本发明的寡核苷酸与样品中的核酸分子杂交的情况下，该杂交反应可在严格条件下进行。 
本发明的寡核苷酸的碱基序列的长度优选被设计成至少10个碱基、更优选10～200个碱基、更优选15～150个碱基、最优选18～80个碱基。 
该寡核苷酸序列可以作为用于检测被检基因的探针使用，此外，可以作为正向(有义)引物或反向(反有义)引物使用。 
如上设计的寡核苷酸引物或寡核苷酸探针可以采用公知的手段、方法来化学合成，一般地可以使用市售的化学合成装置来合成。 
而且，探针中可以预先添加荧光标记(例如FITC、FAM、VIC、Redmond Dye等)以及荧光标记的猝灭剂，来实现作业的自动化。 
6.微阵列 
此外，通过将本发明的寡核苷酸的一端固定于玻璃、硅、凝胶等支持体， 可以制作微阵列。寡核苷酸的阵列例如可以通过组合固相化学合成法与半导体产业中使用的光刻制造技术而成的光照射化学合成法(Affymetrix公司)来制造。为了明确芯片的化学反应部位的界面，通过利用光刻掩模进行特定的化学合成步骤，可以构建寡核苷酸探针附于阵列的指定位置而得到的高密度阵列。 
7.试剂盒 
此外，本发明的其他方式中，提供包含使用本发明的寡核苷酸和/或该寡核苷酸制作的微阵列的GmFAD2-1b基因或GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变检测用试剂盒。这样的试剂盒中除了包含使用本发明的寡核苷酸或该寡核苷酸制作的微阵列以外，还可以包含检测反应用的溶液、对照用寡核苷酸、检测反应利用的容器、使用说明书等。 
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。但这些实施例以本发明的示例为目的，并不是对本发明进行限定。以下的实施例以及比较例中的％表示质量％。 
实施例
[实施例1] 
1.植物材料： 
作为材料使用的大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种如下。 
(i)“Bay”； 
(ii)“ORERICH50”； 
(iii)“BC3F4系统”(通过使“M23系统”回交“FUKUYUTAKA”而导入了GmFAD2-1a基因的缺失突变的品种)。 
将(i)～(iii)的大豆品种的种子在0.3％EMS水溶液中浸渍一夜后，于流水中涮洗8小时，将由此得到的大豆M1种子播种于苗圃，采用常规方法栽培M1个体。对于保持可育性的植物体，每个个体回收1粒M2种子并保存。翌年，将保存的M2种子再度播种于苗圃，栽培M2个体。此时，对栽培的M2个体按个体赋予系统编号，从绿叶提取DNA，并按个体回收充分成熟、干燥的M3种子，合起来于-20℃的冰箱中保存。 
2.DNA的提取： 
DNA的提取采用对CTAB法(Murray and Thompson(1980)Nucleic Acids Res.8：4321-4325)进行部分改动而得到的方法进行。具体地，将约100mg 的绿叶在液体氮中粉碎，向其中加入300μl的2％CTAB溶液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，2％CTAB)，65℃保温30分钟后，通过离心分离沉淀植物残渣，回收上清。将该上清通过氯仿提取除蛋白，向该提取物中加入1ml的1％CTAB溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)，1％CTAB)，通过离心分离沉淀DNA-CTAB复合体。将所得沉淀在含终浓度5μg/ml的RNaseA的200μl的1M NaCl中溶解后，加入300μl的2-丙醇，通过离心分离沉淀DNA。将所得沉淀悬浮于100μl的硅藻土悬浮液(50g/l硅藻土、50mM Tris-HCl(pH7.5)，7M胍HCl，10mM EDTA)，使DNA结合于硅藻土。将硅藻土用70％乙醇水溶液洗涤2次后，使用1/10浓度的TE缓冲液〔1mM Tris-HCl(pH8.0)，0.2mM EDTA(pH8.0)〕洗脱DNA。 
3.突变体的筛选： 
将混合8个体的量而得到的池DNA作为模板，制备了包含GmFAD2-1b基因特异性的以的引物组以及Pfu DNA聚合酶的PCR反应液。 
正向引物：5’-tctgtcacttccctccattcattttg-3’(SEQ ID NO：12) 
反向引物：5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
靶标基因区域的扩增如下进行：95℃、30秒；65℃、1分钟；72℃、2分钟的循环进行40次。 
将所得PCR产物于95℃、热变性5分钟后，以2℃/秒的速度冷却至85℃，并保温1分钟。然后，以0.1℃/秒的速度冷却至25℃，并保温1分钟，在以最高速冷却至4℃并保温。 
然后，加入反应缓冲液(5x：1M HEPES-NaOH(pH6.5)、50mM KCl、15mM MgCl2、0.05％Triton X-100〕以及按Yang等(Biochemistry 39：3533-3541(2000))制备的CEL I核酸酶，37℃、保温10分钟，由此切断具有错配的DNA片段。然后，加入含终浓度0.5％的SDS和1x GelRed溶液的电泳用样品缓冲液，停止反应，并通过1.5％琼脂糖电泳选择出靶标序列发生了突变的突变体。 
4.突变部位的鉴定： 
以筛选得到的突变体的DNA作为模板，使用筛选中使用的特异性引物组(SEQ ID NO：12以及13)，再度进行了GmFAD2-1b基因的PCR扩增。 
5’-tctgtcacttccctccattcattttg-3’(SEQ ID NO：12) 
5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
对于通过PCR扩增得到的DNA片段的碱基序列，采用直接测序法进行了鉴定。 
5.鉴定结果： 
从EMS处理后的Bay来源的3626个系统、ORERICH50来源的3360个系统、作为FUKUYUTAKA×M23的BC3F4系统来源的1782个系统、总计8768个系统的M2个体中，得到了GmFAD2-1b基因上中发生了碱基取代的4个系统的突变体。这其中，有2个系统中发生了不伴随氨基酸变化的沉默突变，对于剩下的2个系统，可知随着碱基取代而发生了氨基酸的取代。这其中，Bay来源的突变系统“E015B12系统”中，GmFAD2-1b基因的碱基序列的第565位的碱基从A取代成C，其结果，可知FAD2的氨基酸序列的第189位的氨基酸残基从苏氨酸变化成脯氨酸。此外，BC3F4系统来源的突变系统“FH00ES04E11系统”中，GmFAD2-1b基因的碱基序列的第308位的碱基从G取代成T，其结果，可知FAD2的氨基酸序列的第103位的氨基酸残基从甘氨酸变化为缬氨酸。 
6.突变基因的评价： 
对于确认了FAD2的氨基酸序列的变化的“E015B12系统”以及“FH00ES04E11系统”的突变基因，将其克隆至酵母表达载体pYES2/CT。然后，制作了分别将包含野生型GmFAD2-1b基因(FUKUYUTAKA来源)、突变型的GmFAD2-1a基因(BC3F4系统来源)、突变型的GmFAD2-1b基因(E015B12系统以及FH00ES04E11系统来源)的酵母表达载体导入酿酒酵母(INVSc1株)而得到的株，在含2％半乳糖、且不含尿嘧啶的SC培养基中20℃培养72小时，从而诱导导入基因的表达。然后，从收集菌体得到的重组酵母细胞以及突变体种子的粉末，采用硫酸-甲醇法制备脂肪酸甲基酯，按照非专利文献1的记载使用气相色谱进行脂肪酸组成的分析。分析结果如图1～3所示。 
此外，以气相色谱的结果为依据，进行了含野生型GmFAD2-1b的大豆、含GmFAD2-1a突变型基因的大豆、含GmFAD2-1b和GmFAD2-1a两突变型基因的大豆的脂肪酸组成的比较。比较结果如表1所示。 
表1.不同系统间的油酸含量比较 
由脂肪酸组成分析的结果可知：E015B12以及FH00ES04E11突变系统中发生的氨基酸取代突变显著地降低了GmFAD2-1b基因产物的酶活性。特别是，对于从FH00ES04E11系统分离的突变型GmFAD2-1b基因的产物，可知酶活性降低至完全不能合成亚油酸的程度(参照图1以及表1)。 
而且，可知在FH00ES04E11系统中，油酸含量增加至79.6％。与在基准品种FUKUYUTAKA(油酸含量：20.3％)中导入GmFAD2-1a基因的缺失突变而得到的大豆(BC3F4系统(油酸含量：33.3％))中的油酸含量增加约13％左右的效果相比较，该结果可以确认BC3F4系统与FH00ES04E11系统之间得到了约46.3％的油酸含量的增加，表明获得了极好的效果。 
[实施例2] 
1.GmFAD2-1b突变体大豆以及GmFAD2-1a突变体大豆的杂交： 
通过使实施例1中制作的E015B12系统与KK21系统杂交，制作了GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因中具有功能缺损型突变的大豆“KK21x B12”系统。具体地，按以下的规程进行了杂交。 
杂交前日的下午，打开预定于翌日开花的KK21系统的花蕾，取除全部的雄蕊，同时注意不要弄伤雌蕊，为了防止干燥、外部花粉的混入，进行了套袋。杂交当日的上午9时～11时之前，确认B12系统的开花，从当日刚开花后的花取出花粉，使花粉附着于前日除去雄蕊的KK21的花的雌蕊的尖端。对于杂交作业结束的花，为了防止干燥、目的外花粉的混入，迅速进行了套袋，2日后除去袋。 
2.双重突变系统的选择： 
播种通过上述杂交得到的“KK21x B12”系统的F1种子，以从发芽的植物体的绿叶提取的DNA作为模板，使用以下的引物进行了GmFAD2-1a突变基因以及GmFAD2-1b突变基因的PCR检测た。 
GmFAD2-1a突变基因扩增用 
FW引物：5’-atattacacattcagcaaaacaactga-3’(SEQ ID NO：24) 
RV引物：5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
GmFAD2-1b突变基因扩增用 
FW引物：5’-tctgtcacttccctccattcattttg-3’(SEQ ID NO：12) 
RV引物：5’-gggaagcttatacacaaagtcattacgcggcaa-3’(SEQ ID NO：13) 
PCR反应的条件与实施例1的“突变体的筛选”相同。按照前述的突变体的筛选的规程，进行了突变基因的检测，确认了KK21和B12来源的基因均以杂合的方式携带。对于从该F1个体得到的F2种子，同样进行播种，从发芽的植物体的绿叶按个体提取DNA，进行了突变基因的确认。其结果，得到了图4(上部分是对KK21来源的突变型GmFAD2-1a基因、下部分是对B12来源的突变型GmFAD2-1b基因的分析结果，两部分中分析的试样的顺序是对应的)所示的双重突变系统。 
3.突变体大豆的限制酶切断模式的确认： 
除了上述的方法以外，双重突变系统的选择还可以如下地进行检测：对于KK21系统来源的GmFAD2-1a以及B12系统或E11系统来源的GmFAD2-1b基因，使用前述的双重突变系统的选择中使用的引物组采用PCR法进行扩增后，通过突变序列特异性的限制酶切断模式的变化来进行检测。具体地，通过以下的处理进行各系统来源的突变基因的检测。 
图5中，部分(A)显示将KK21来源的GmFAD2-1a突变基因用BsaXI进行处理的切断模式，野生型的基因不被切断，是约1.3kbp；与之相对，突变基因有一处被切断，产生约1.0kbp和0.3kbp的2个片段。部分(B)显示将E11来源的GmFAD2-1b突变基因用Bsr I进行处理的切断模式，野生型的基因被切断，产生约1.0kbp和0.4kbp的2个片段；与之相对，突变基因不被该处理切断，为约1.4kbp。此外，部分(C)显示将B12来源的GmFAD2-1b突变基因用FokI进行处理的切断模式，野生型的基因不被切断，为约1.4kbp；与之相对，可以确认突变基因产生约0.7kbp的条带。 
4.突变体大豆的蛋白质组成分析： 
对作为野生型大豆的“Bay”以及“MURAYUTAKA”、以及作为突变体大 豆的“KK21”、“B12”、KK21与B12的杂交世代(KK21x B12(2系统))以及E11中所含的蛋白质的组成用SDS-PAGE进行了分析。具体地，进行了以下的处理。 
对于用电动磨粉碎而得到的大豆种子粉末10mg，加入500ul的样品缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，2％SDS，10％甘油，5％2-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝)，100℃加热10分钟。然后，1500rpm离心分离10分钟，将所得上清按常规方法使用12.5％的SDS-PAGE进行分离，用考马斯亮蓝染色显现多肽的条带，进行了品种间的比较。 
如图6所示，KK21、B12、KK21x B12以及E11中的突变体系统，在蛋白质的组成方面与野生型系统(Bay以及MURAYUTAKA)未确认有显著差异。此外，作为大豆的主要蛋白质的β-伴大豆球蛋白以及大豆球蛋白的含量方面，突变体系统以及野生型系统中未确认有差异(图6)。 
5.突变体大豆的脂肪酸组成分析： 
对作为野生型大豆的“Bay”以及“FUKUYUTAKA”、以及作为突变体大豆的KK21、B12、KK21x B12(2系统)以及E11中所含的脂肪酸的组成用气相色谱进行了分析。具体地，从各系统的大豆种子的粉末采用硫酸-甲醇法制备了脂肪酸甲基酯，按照非专利文献1的记载进行了气相色谱分析。分析结果如表2以及图7所示。 
表2 
如表2所示，GmFAD2-1b以及GmFAD2-1a两基因中具有功能丧失的大豆系统(KK21x B12以及E11)中，油酸含量超过80％。KK21x B12以及E11是分别采用不同制作步骤得到的系统。因此，可以证明：与系统无关，只要GmFAD2-1b以及GmFAD2-1a两基因功能丧失，即可获得高油酸含量大豆。 
此外，如图7所示，突变体以及野生型的大豆中，未检测到不同种类的 脂肪酸的峰。因此，可以确认，即使在丧失GmFAD2-1b基因或者GmFAD2-1a基因、或这两个基因的功能的情况下，也不会生成与野生型大豆不同的种类的脂肪酸。 
6.突变体大豆的形态观察： 
对于作为野生型大豆的Bay、GmFAD2-1a基因中有突变的M23、KK21以及BC3F4、GmFAD2-1b基因中有突变的B12、以及GmFAD2-1a基因以及GmFAD2-1b基因这两基因中有突变的E11，用肉眼进行了大豆种子的形态观察。 
大豆种子的形态观察的结果可以判明：M23以及具有M23来源的GmFAD2-1a突变基因的系统(BC3F4以及E11)中，相对于从平均每个个体收获的大豆种子的总数，具有褶皱的大豆种子的比例高(参照表3)。另一方面，即使是突变大豆系统，不具有M23来源的GmFAD2-1a突变基因的KK21以及B12中，具有褶皱的大豆种子的比例与作为野生品种的Bay程度等同(参照表3)。 
表3 
工业实用性 
通过使用本发明的GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变基因作为标记，能够筛选高油酸含量大豆。此外，通过使用本发明的大豆，能够容易地获得油酸含量高的大豆油；通过使本发明的大豆与其他品种的大豆杂交，能够制作种子中的油酸含量高、且兼具其他特性的大豆品种。 
保藏号 
<保藏表示> 
FERM BP-11248：2010年4月22日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。 
识别表示：B12 
FERM BP-11249：2010年4月22日国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。 
识别表示：KK21 
SEQ ID NO：1：野生型GmFAD2-1b 
SEQ ID NO：3：突变型GmFAD2-1b 
SEQ ID NO：5：突变型GmFAD2-1b 
SEQ ID NO：7：合成DNA 
SEQ ID NO：8：合成DNA 
SEQ ID NO：9：合成DNA 
SEQ ID NO：10：合成DNA 
SEQ ID NO：11：合成DNA 
SEQ ID NO：12：合成DNA 
SEQ ID NO：13：合成DNA 
SEQ ID NO：14：野生型GmFAD2-1a 
SEQ ID NO：24：合成DNA 
序列表 

Claims (14)

1.一种非基因重组型油酸高含量大豆的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使具有GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变的大豆品种与具有GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变的大豆品杂交的步骤；
其中，GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同；且GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变是编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的第103位和/或第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变。
2.一种非基因重组型油酸高含量大豆的筛选方法，该方法包括：
(a)使用包含编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因中导入了功能缺失型突变的非基因重组型油酸高含量大豆所具有的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位的碱基序列的寡核苷酸探针、和/或制作的寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物使得对所述基因的碱基序列及其互补序列中的至少一个进行扩增时的扩增片段中包含所述突变部位，对被检大豆的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因进行扩增处理和/或杂交处理的步骤；以及
(b)检测所述基因的突变部位的步骤；
其中，GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同；且GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变是编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的第103位和/或第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变。
3.一种寡核苷酸，其被制作成包含编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的GmFAD2-1b基因以及GmFAD2-1a基因中导入了功能缺失型突变的非基因重组型油酸高含量大豆所具有的GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位的碱基序列；
其中，GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同；且GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变是编码ω-6脂肪酸不饱和化酶的氨基酸序列中的第103位和/或第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其被制作成该寡核苷酸的5’末端或者3’末端或中央的碱基是GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的突变部位。
5.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸，其具有10～200个碱基的长度。
6.将权利要求3～5中任一项所述的寡核苷酸固定在支持体而得到的微阵列。
7.一种GmFAD2-1a基因或GmFAD2-1b基因的功能缺失型突变检测用试剂盒，其包含权利要求3～5中任一项所述的寡核苷酸和/或权利要求6所述的微阵列。
8.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述非基因重组型油酸高含量大豆中的油酸含量为大豆的总脂肪酸量的75%以上。
9.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述非基因重组型油酸高含量大豆具备以下的(a)～(e)的特征中的至少1个：(a)种子的表皮的褶皱与野生型相比未增加；
(b)未生成构成实质性问题的量的亚油酸；
(c)总贮藏蛋白质中的β-伴大豆球蛋白含量与野生型相比实质上未降低；
(d)总贮藏蛋白质量与野生型相比实质上未降低；
(e)可育性与野生型相比未降低。
10.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述编码第103位的氨基酸残基的密码子的错义突变是由从甘氨酸的密码子到缬氨酸的密码子的取代引起的。
11.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述编码第189位的氨基酸残基的密码子的错义突变是由从苏氨酸的密码子到脯氨酸的密码子的取代引起的。
12.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述非基因重组型油酸高含量大豆具有由SEQ ID NO：3或5所示的碱基序列构成的基因。
13.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，GmFAD2-1a基因的功能缺失型突变与M23大豆或KK21大豆的GmFAD2-1a基因的突变相同。
14.权利要求1所述的制造方法、权利要求2所述的筛选方法、权利要求3所述的寡核苷酸、权利要求6所述的微阵列或权利要求7所述的试剂盒，其中，所述非基因重组型油酸高含量大豆通过使保藏号为FERM BP-11249的KK21大豆与保藏号为FERM BP-11248的B12大豆杂交而得到。
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Two high-oleic-acid soybean mutants,M23 and KK21,have disrupted microsomal omega-6 fatty acid desaturase,encoded by GmFAD2-1a;Toyoaki Anai et al;《Breeding Science》;20081231;第450页左栏倒数第一段，第451页左栏倒数第2段 *

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