CN102749408B - 一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 - Google Patents
一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102749408B CN102749408B CN201110101101.4A CN201110101101A CN102749408B CN 102749408 B CN102749408 B CN 102749408B CN 201110101101 A CN201110101101 A CN 201110101101A CN 102749408 B CN102749408 B CN 102749408B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- influenza vaccine
- hplc
- nonoxynol
- detection method
- subunit influenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理，(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线，(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种亚单位流感疫苗中裂解剂的检测方法，特别是使用高效液相色谱检测方法。
背景技术：
壬苯醇醚-9是一种非离子型表面活性剂，其化学名称为NonylphenylPolyethylene Glycol Ether。在亚单位流感疫苗生产过程中，需加入裂解剂壬苯醇醚-9，对全病毒进行裂解，再经纯化，得到亚单位疫苗。由于非离子性表面活性剂对细胞膜的侵害性，因此疫苗中的裂解剂残留量必须严格控制在一定的安全限量标准之内。以往国内报道过比色法测定裂解剂的方法，但是此方法受方法学限制，不是直接反映裂解剂含量，具有一定误差。
发明内容：
本发明提供一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理，
(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线，
(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，
(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量；
其中步骤(1)和步骤(2)之间，以及步骤(2)和步骤(3)之间的顺序可以互换；
其特征在于，HPLC检测采用的色谱柱是C4柱。
本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测采用的色谱柱是ThermoBioBasic-4C4柱。
本发明的检测方法，其特征在于步骤(1)的待检亚单位流感疫苗样品的处 理方法为：用4倍体积的甲醇沉淀后上清液作为待测样品。
本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的紫外检测器的波长为275nm。
本发明的的检测方法，其特征在于HPLC检测时采用体积比为80∶20的甲醇/水作为流动相，流速1ml/min。
本发明的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为-20℃～65℃。
本发明的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为37℃。
本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为22～37℃。
本发明的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为33℃。
优选的本发明的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理
取待检亚单位流感疫苗样品200μl，加入800μl甲醇，剧烈震荡30sec，37℃30min，14000rpm离心20min，吸取上清，0.45um滤膜过滤，得到测试液；
(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线
精密称取标准品壬苯醇醚-9250μg，用体积比为4∶1的甲醇/水溶解定容至100ml，即得2500μg/ml壬苯醇醚-9溶液，依次稀释定容为1000μg/ml、50μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、5μg/ml，按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚-9浓度对峰面积制作标准曲线；
(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测
步骤1得到的测试液用和制作标准曲线的同样条件进行HPLC测定，得到色谱图；
(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量
其中HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo BioBasic-4C4柱，4.6mm×150mm，5μm，定量环：20μl，流动相：体积比为80∶20的甲醇：水，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100μl。
本发明的检测方法，是根据以下实验进行设计的，
1.材料与方法
1.1仪器和药品
Hitachi L-2000高效液相色谱仪，L-2400紫外检测器，L-2130泵，EZSTART 色谱工作站；Mettler Toledo AL 204电子天平；Beckman Coulter Microfuge 22R台式高速离心机。
裂解剂标准品壬苯醇醚-9；甲醇为色谱纯；水为Milli-Q(Millipore)超纯水机制备，电阻率18.2MΩ·cm。
1.2色谱条件
色谱柱：Thermo BioBasic-4C4柱(4.6mm×150mm，5μm)，定量环：20ul，流动相：甲醇：水(80：20，v/v)，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100ul。
1.3亚单位流感疫苗处理方法
取亚单位流感疫苗200ul，加入800ul甲醇，剧烈震荡30sec，37℃30min，14000rpm离心20min，吸取上清，0.45um滤膜过滤，HPLC分析。
1.4专属性实验
取灭活流感病毒提取液，不加裂解剂，超声20min后按1.3方法处理后HPLC测定。
1.5标准曲线的制备
精密称取标准品250μg，用甲醇/水(4∶1，v/v)溶解定容至100ml，即得2500μg/ml壬苯醇醚-9溶液，依次稀释定容为1000μg/ml，250μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，5μg/ml，按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚-9浓度对峰面积制作标准曲线。
1.6回收率测定
1.6.1壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率
取灭活流感病毒提取液，加入壬苯醇醚-9PB溶液，使终浓度达6000μg/ml，混匀，4℃16小时(过夜)，依次进行5倍，25倍稀释，三个浓度分别按1.3方法处理后测定回收率。
1.6.2壬苯醇醚-9在亚单位流感疫苗中的回收率
取亚单位流感疫苗，加入一定量壬苯醇醚-9，按1.3方法处理后测定回收率。
1.7精密度测定
1.7.1日内精密度
取各浓度标准品溶液和亚单位流感疫苗连续进样五针，以峰面积计算相对标 准偏差(RSD％)。
1.7.2日间精密度
取各浓度标准品溶液和亚单位流感疫苗连续五天进样，以峰面积计算相对标准偏差(RSD％)。
1.8检测限和定量限
以十倍信噪比为最低检测限，以日内精密度和日间精密度均小于3％为定量限。
2.结果
2.1色谱谱图
250μg/ml壬苯醇醚-9甲醇/水标准品溶液保留时间(RT)为3.300min，理论塔板数为2702，谱图见图1。
专属性实验谱图见图2。
回收率测定1中5倍稀释病毒裂解液保留时间(RT)为3.307min，理论塔板数为2314，谱图见图3。
回收率测定2中壬苯醇醚-9，亚单位流感疫苗及壬苯醇醚-9加亚单位流感疫苗的谱图分别见图4，图5，图6，亚单位流感疫苗中的保留时间(RT)为3.280min，理论塔板数为2524。
2.2专属性实验
由谱图可知，在壬苯醇醚-9出峰时间内，经过甲醇沉淀处理的灭活全病毒提取液几乎无吸收。
2.3标准曲线制备
标准曲线见图7，强制过原点下，标准曲线方程为y＝0.000099066x，r2＝0.9999，在5μg/ml～2500μg/ml范围内呈线性关系。
2.4回收率测定
壬苯醇醚-9在全病毒提取液中的回收率见表1。
壬苯醇醚-9在亚单位流感疫苗中的回收率见表2。
2.5精密度测定
2.5.1日内精密度
日内精密度见表3。
2.5.2日间精密度
日间精密度见表4。
2.6检测限和定量限
5μg/ml标准品溶液的信噪比约为10，日内精密度和日间精密度均小于3％，本方法的检测限和定量限定为5μg/ml。
表1壬苯醇醚9在全病毒提取液中的回收率(n＝5)
表2壬苯醇醚9在亚单位流感疫苗中的回收率(n＝5)
表3日内精密度(n＝5)
表4日间精密度(n＝5)
本研究建立的方法回收率在100％左右，并且日间精密度和日内精密度均在3％以内，在5μg/ml～2500μg/ml范围内线性关系保持非常好，r2均在0.9999以上，使本方法的准确度非常高。
对不同浓度标准品溶液的全波长扫描实验确定275nm为最大吸收波长。
对甲醇/水在80∶20，85∶15，88∶12比例及流速0.5ml/min，1ml/min的研究结果，确定甲醇/水在80∶20和流速1ml/min下谱图显示最佳，理论塔板数在2500左右。
对室温22℃及柱温箱31℃，33℃，35℃，37℃的研究表明，随柱温升高，谱图形状几乎无变化，保留时间缩短，理论塔板数提高，最终确定本实验室采用33℃柱温。
对4倍甲醇沉淀在-20℃，37℃和65℃的沉淀研究表明，温度对沉淀的影响不大，从易操作角度确定沉淀温度为37℃。
以往在高效液相色谱(HPLC)的反相柱选择上，研究者的思维多局限在C18柱或部分在C8柱上，尤其在小分子的检测上，没有人想到采用C4柱去分析小分子物质，因此不论国内还是国外，针对流感疫苗中的裂解剂含量检测，在HPLC方法中没有研究者采用C4柱。实验表明，采用药典中壬苯醇醚检测方法中规定的C18柱，甲醇/水(88∶12，v/v)的流动相，为了保证所有组分的流出，检测一个标本需要40分钟，而且其峰宽扩展达4分钟，峰型复杂，积分困难，难以报告裂解剂总含量，保障不了结果的准确性和重复性，线性范围三篇文献报道仅分别为0.25～1mg/ml，0.5～3mg/ml和0.4～2mg/ml之间，无法满足疫苗生产中裂解剂检测的需要。而采用C4柱，甲醇/水(80∶20，v/v)的流动相检测一个标本仅需要6分钟，峰宽小于1分钟，谱图平滑清晰，裂解剂保留时间内无杂峰，易积分，结果的准确性和重复性都非常好，峰宽的缩短使峰高增加，提高了方法的检测限和定量限，在5μg/ml～2500μg/ml范围内线性关系保持非常好(更高浓度因无实际意义故未做)，远高于文献报道的线性范围，r2在0.9999以上。检测时间的缩短极大提高了检测效率，可以迅速给出送检标本结果，及时监测生产各环节中裂解剂含量，同 时流动相中甲醇浓度的降低使甲醇消耗显著降低。先进的有机溶剂样本柱前处理技术，使裂解剂回收率在100％左右，并使99％以上样本中的杂质被清除。本方法确定的线性范围从最低到最高达500倍，范围非常宽，满足生产各环节送检标本检测需要。总之，本方法简便，快速，准确，适用于实验室对裂解剂含量的常规检验。
附图说明：
图1250μg/ml壬苯醇醚-9甲醇/水标准品溶液，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图2专属性实验不含裂解剂病毒标本，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图3回收率测定中5倍稀释病毒裂解液标本，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图4壬苯醇醚-9PB溶液，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图5亚单位流感疫苗，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图6壬苯醇醚-9PB溶液+亚单位流感疫苗，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸光度(mAu)
图7壬苯醇醚-9标准曲线，横坐标是面积，纵坐标是壬苯醇醚-9的浓度(μg/ml)
具体实施方式：
步骤1、亚单位流感疫苗处理
取亚单位流感疫苗200ul，加入800ul甲醇，剧烈震荡30sec，37℃30min，14000rpm离心20min，吸取上清，0.45um滤膜过滤，得到测试液
步骤2、HPLC测定裂解剂标准品壬苯醇醚-9的标准曲线
精密称取标准品壬苯醇醚-9250μg，用甲醇/水(4∶1，v/v)溶解定容至100ml，即得2500μg/ml壬苯醇醚-9溶液，依次稀释定容为1000μg/ml，250μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，5μg/ml，按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚-9浓度对峰面积制作标准曲线。
步骤3、处理后的亚单位流感疫苗HPLC测定
步骤1得到的测试液用和制作标准曲线的同样条件进行HPLC测定，得到色谱图。
步骤4、用HPLC图谱比较法和归一法计算亚单位流感疫苗中裂解剂的含量。
其中HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo BioBasic-4C4柱(4.6mm×150mm，5μm)，定量环：20ul，流动相：甲醇：水(80∶20，v/v)，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100ul。
Claims (10)
1.一种亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理，
(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线，
(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测，
(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量；
其中步骤(1)和步骤(2)之间，以及步骤(2)和步骤(3)之间的顺序可以互换；
其特征在于，HPLC检测采用的色谱柱是C4柱，HPLC检测时采用体积比为80：20的甲醇/水作为流动相。
2.如权利要求1的检测方法，其特征在于HPLC检测采用的色谱柱是Thermo BioBasic-4C4柱。
3.如权利要求2的检测方法，其特征在于步骤(1)的待检亚单位流感疫苗样品的处理方法为：用4倍体积的甲醇沉淀后上清液作为待测样品。
4.如权利要求2的检测方法，其特征在于HPLC检测时的紫外检测器的波长为275nm。
5.如权利要求3或4的检测方法，其特征在于HPLC检测时流速1ml/min。
6.如权利要求5的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为-20℃～65℃。
7.如权利要求6的检测方法，其特征在于步骤1的沉淀温度为37℃。
8.如权利要求7的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为22～37℃。
9.如权利要求8的检测方法，其特征在于HPLC检测时的柱温为33℃。
10.如权利要求9的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)待检亚单位流感疫苗样品的处理
取待检亚单位流感疫苗样品200μl，加入800μl甲醇，剧烈震荡30sec，37℃30min，14000rpm离心20min，吸取上清，0.45um滤膜过滤，得到测试液；
(2)HPLC检测得到标准品壬苯醇醚-9的标准曲线
精密称取标准品壬苯醇醚-9 250μg，用体积比为4：1的甲醇/水溶解定容至100ml，即得2500μg/ml壬苯醇醚-9溶液,依次稀释定容为1000μg/ml、50μ g/ml、50μg/ml、25μg/ml、5μg/ml,按样品处理方法处理后HPLC测定，以壬苯醇醚-9浓度对峰面积制作标准曲线；
(3)处理后的待检亚单位流感疫苗样品的HPLC检测
步骤1得到的测试液用和制作标准曲线的同样条件进行HPLC测定，得到色谱图；
(4)计算亚单位流感疫苗中壬苯醇醚-9的含量
其中HPLC的色谱条件为：色谱柱：Thermo BioBasic-4C4柱，4.6mm×150mm，5μm，定量环：20μl，流动相：体积比为80：20的甲醇：水，流速：1ml/min，紫外检测器检测波长275nm，柱温：33℃，上样量：100μl。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110101101.4A CN102749408B (zh) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | 一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110101101.4A CN102749408B (zh) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | 一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102749408A CN102749408A (zh) | 2012-10-24 |
| CN102749408B true CN102749408B (zh) | 2015-08-19 |
Family
ID=47029769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110101101.4A Active CN102749408B (zh) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | 一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102749408B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104888212A (zh) * | 2015-02-09 | 2015-09-09 | 天士力金纳生物技术（天津）有限公司 | 一种流感病毒亚单位疫苗及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5380523A (en) * | 1993-08-17 | 1995-01-10 | University Of Kentucky Research Foundation | High energy coprecipitate of nonoxynol oligomer, PVP and iodine having contraceptive and potent anti-HIV properties |
| US6281251B1 (en) * | 1999-03-22 | 2001-08-28 | University Of Kentucky Research Foundation | Iodo-nonoxynol-9-derivatives and methods for their use |
| CN1701786A (zh) * | 2004-12-29 | 2005-11-30 | 贵州宏宇药业有限公司 | 壬苯醇醚泡沫剂的制备方法和质量控制方法 |
| US20080113443A1 (en) * | 2005-02-17 | 2008-05-15 | Gulati Poonam S | Polypeptide formulations and methods for making, using and characterizing them |
-
2011
- 2011-04-21 CN CN201110101101.4A patent/CN102749408B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5380523A (en) * | 1993-08-17 | 1995-01-10 | University Of Kentucky Research Foundation | High energy coprecipitate of nonoxynol oligomer, PVP and iodine having contraceptive and potent anti-HIV properties |
| US6281251B1 (en) * | 1999-03-22 | 2001-08-28 | University Of Kentucky Research Foundation | Iodo-nonoxynol-9-derivatives and methods for their use |
| CN1701786A (zh) * | 2004-12-29 | 2005-11-30 | 贵州宏宇药业有限公司 | 壬苯醇醚泡沫剂的制备方法和质量控制方法 |
| US20080113443A1 (en) * | 2005-02-17 | 2008-05-15 | Gulati Poonam S | Polypeptide formulations and methods for making, using and characterizing them |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| Determination of Triton X-100 in influenza vaccine by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis;Katja Heinig, C. Vogt;《Fresenius" Journal of Analytical Chemistry》;19970930;第359卷(第2期);202-206 * |
| High-Performance Liquid Chromatographic (HPLC) Analysis of Oligomeric Components of the Spermicide Nonoxynol-9;Brian A. Walter et al;《Pharmaceutical Research》;19910331;第8卷(第3期);409-411 * |
| HPLC法测定双保险避孕套中的壬苯醇醚含量;黎霜 等;《中国药师》;20040915;第7卷(第9期);688-690 * |
| HPLC法测定复方壬苯醇醚-9避孕栓主药含量;张颖 等;《天津药学》;20040828;第16卷(第4期);16-17 * |
| Universal Two-Dimensional HPLC Technique for the Chemical Analysis of Complex Surfactant Mixtures;Olivier P. Haefliger;《Analytical Chemistry》;20030201;第75卷(第3期);371-378 * |
| Validating a Reversed-Phase HPLC Method to Determine Residual Nonoxynol-9 on Pharmaceutical Process Equipment Using a Nonporous Silica Column-The authors developed and validated an HPLC method;Shifflet M J et al;《LC GC Magazine-North America-Solutions for Separation Scientists》;20010331;第19卷(第3期);312,314-317 * |
| 反相液相色谱保留机理的分子动力学研究;窦潇;《万方学位论文数据库》;20070814;全文 * |
| 高效液相色谱法测定壬苯醇醚凝胶中壬苯醇醚含量;倪南 等;《黑龙江科技信息》;20091215(第35期);340，44 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102749408A (zh) | 2012-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104535702A (zh) | 一种同时检测饮用水中多种痕量药物污染物的方法 | |
| CN103926355A (zh) | 野菊花uplc指纹图谱的构建方法 | |
| CN103645257A (zh) | 木瓜饮片的检测方法 | |
| CN106324128A (zh) | 中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法 | |
| CN105136951A (zh) | 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法 | |
| CN102435703A (zh) | 一种同时检测水中多种微囊藻毒素的方法 | |
| CN102590393B (zh) | 同时测定多维氨基酸咀嚼片中多种成分含量的方法 | |
| Gong et al. | Miniaturized ionic liquid dispersive liquid–liquid microextraction in a coupled-syringe system combined with UV for extraction and determination of danazol in danazol capsule and mice serum | |
| CN102749408B (zh) | 一种亚单位流感疫苗中裂解剂含量的检测方法 | |
| CN109856255A (zh) | 一种控制替格瑞洛中间体的异构体杂质含量的分析方法 | |
| CN104897814A (zh) | 采用dnph-硅胶吸附小柱结合hplc-uv检测大气醛酮浓度的方法 | |
| CN105699499A (zh) | 定量分析方法 | |
| CN105628825B (zh) | 基于upc2‑elsd测定蜂蜜中4种主要单糖和双糖含量的方法 | |
| CN104316637A (zh) | 高效液相色谱法测定阿哌沙班清洗残留量 | |
| CN101458235B (zh) | 苦参碱液相色谱测定方法 | |
| CN103926334A (zh) | 高效液相色谱法检测药物中残留有机溶剂的方法 | |
| CN103940918A (zh) | 一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法 | |
| CN104849381A (zh) | 基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定7种黄芪皂苷类成分的方法 | |
| CN102590408B (zh) | 一种冠心宁注射液中大分子物质的检测方法 | |
| CN102053120A (zh) | 一种液相色谱法测定环己酮肟含量的方法 | |
| CN103995062B (zh) | 一种高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质的方法 | |
| CN107894476B (zh) | 一种茴香酮的检测方法 | |
| CN106596768A (zh) | 氨基酸类表面活性剂中脂肪酸残留的液相检测方法 | |
| CN102798674B (zh) | 一种快速的硫酸依替米星中控检测方法 | |
| CN104458952A (zh) | 一种淫羊藿总黄酮中乙酸乙酯、正丁醇溶剂残留量的测量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee after: ZHONGYI ANKE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine Patentee before: TASLY JINNA BIOTECHNOLOGY (TIANJIN) CO., LTD. |