CN102747053B - 细胞色素p450 bm-3变体酶及其编码基因和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞色素P450BM-3变体酶及其编码基因和用途，该变体酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，它在细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶的基础上增加了三个突变位点，即第168位的天冬氨酸(GAT)突变为亮氨酸(CTT)，第435位的谷氨酸(GAA)突变为苏氨酸(ACG)，第445位的缬氨酸(GTG)突变为丙氨酸(GCG)。与父本酶和原始酶相比，本发明变体酶具有与底物更高的亲和力，催化吲哚生成靛蓝的效率更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种变体酶，尤其涉及一种细胞色素P450 BM-3变体酶及其编码基因和用途。
背景技术
靛蓝是一种具有悠久历史的天然染料，无论是古埃及木乃伊穿着的一些服装，还是我国马王堆汉墓出土的蓝色麻织物，它们的颜色都来自靛蓝。靛蓝之所以得到人们长期、广泛的青睐，最关键的一点在于它具有其它染料无法比拟的染着牢固度和耐光坚牢度，因此，靛蓝也被称为“染料之王”。
在远古时代，靛蓝主要从含有靛蓝的植物(如菘蓝、蓼蓝、木蓝等)中获得。到了19世纪中叶，由于天然靛蓝的生产无法满足纺织工业迅猛发展的需求，人们开始尝试采用化学方法合成靛蓝。1897年，德国巴斯夫生产的合成靛蓝问世，并以生产简便、原料充足、纯度高、易贮运、使用方便等优点，得以迅速普及，最终使得应用了几千年历史的植物靛蓝黯然失色，于20世纪60年代退出了历史舞台。20世纪80年代后，随着社会文明程度的提高和环保意识的增强，天然靛蓝重新获得了人们的关注和重视。
采用化学方法合成靛蓝时，需要使用对呼吸道、中枢神经及肝脏均有毒害、可导致人体中毒的苯胺和邻苯二甲酸酐。这不仅影响了所合成的靛蓝的安全性，而且也对环境具有污染。由于而今不可能再大量种植与粮食作物争地的产靛蓝植物，人们把生产天然靛蓝的希望寄托于靛蓝的生物制备技术，试图通过那些能催化吲哚转化为靛蓝的生物催化剂实现靛蓝的绿色制备。利用生物催化剂进行靛蓝的生物制备具有生产成本低、生产条件温和、能耗低、产生的有害废物少、产品安全等优点，对保护环境、维持生态平衡等具有明显优势，所以，生物法生产靛蓝取代靛蓝的化学合成得到了很多研究者的认同和重视。
目前，已经发现了一系列能催化吲哚生产靛蓝的生物催化剂，其中最受关注的是一种细胞色素P450BM-3酶。在P450酶系中，细胞色素P450BM-3酶是从巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中发现的具有中长链脂肪酸羟基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在条件下，可以迅速催化链长为C12～C18的饱和脂肪酸末位羟基化，将单个氧插入到不活泼的碳氢键中。
2000年，德国斯图加特大学技术生化研究所R.D.Schmid领导的科研小组，通过定向进化技术获得了具有三个突变位点、能够催化吲哚生成靛蓝的细胞色 素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶，这使细胞色素P450BM-3酶第一次获得了催化靛蓝产生的能力(“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst”Chemistry-A European Journal，LiQ S，Schwaneberg U，Fischer P，Schmid R D.2000，6：1531～1536)。但是，该变体酶催化吲哚生产靛蓝的活力还较低，因此有必要通过进一步的蛋白质改造，提高细胞色素P450BM-3酶对吲哚的亲和力和催化活力，提高靛蓝生物制备的效率。
公开号分别为“CN 1900285A”、“CN 1900286A”、“CN 1900287A”的中国专利公开了三种细胞色素P450BM-3酶的变体基因，该三种变体基因分别将第168位天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子、将168位天冬氨酸的密码子突变为亮氨酸的密码子、将435位谷氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子，该三种变体基因编码的细胞色素P450BM-3酶与底物亲和能力较低。
发明内容
本发明提供了一种细胞色素P450BM-3变体酶，解决了现有变体酶与底物亲和力较小，热稳定性差，催化吲哚生成靛蓝的效率较低的问题。
一种细胞色素P450BM-3变体酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)变体酶或细胞色素P450BM-3(D168L/E435T/V445A)。
本发明通过定点突变，在细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶的基础上引入了三个突变位点，即168位点由天冬氨酸(D)突变为亮氨酸(L)，435位点由谷氨酸(E)突变为苏氨酸(T)，445位点由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，该突变位置序号为蛋白不包括起始密码子编码氨基酸的顺序号。
本发明还提供了一种编码所述细胞色素P450BM-3变体酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
该基因通过如下方法获得：
首先，本发明根据细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶基因的血红素域部分设计两对定点突变引物，以质粒pET28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)为模板，进行PCR扩增，扩增完成后，用Dpn I消化模板质粒，将扩增产物转入大肠杆菌(E.coli)BL21中，筛选获得突变体。
抽取质粒，经测序可知，突变酶P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)基因上的编码第168位氨基酸的碱基序列由“GAT”突变为“CTG”，编码第435位氨基酸的碱基序列由“GAA”突变为“ACG”，同时该质粒命名为：质粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)。
接着，同样根据细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶基因的血红素域部分设计饱和定点突变引物，以质粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)为模板，进行PCR扩增，扩增完成后，用用Dpn I消化模板质粒。
将扩增产物转入大肠杆菌(E.coli)BL21中，筛选获得突变体，抽取质粒，经测序可知，其中一个突变体基因编码第445位氨基酸的碱基序列由“GTG”突变“GCG”。
本发明又提供了包含所述基因的表达盒、重组载体以及转化子。
所述重组载体的原始载体为pET-28a、、pET-29、pET-30、pET-34或pRSET。
所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)BL21、大肠杆菌(E.coli)BLR、大肠杆菌(E.coli)Origami、大肠杆菌(E.coli)NovaBlue或大肠杆菌(E.coli)Rosetta。
本发明提供了所述细胞色素P450BM-3变体酶在催化吲哚转化生成靛蓝中的应用。
本发明所获得的变体酶的酶学参数较父本细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶有显著改善，转化数(Kcat)相对父本提高了2.6倍，催化效率(Kcat/KM)是父本的1.5倍；与细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶相比，增加更为显著，转化数(Kcat)是其18.4倍，催化效率(Kcat/KM)是其13.0倍；说明本发明变体酶对底物吲哚具有更高的催化活力。
具体实施方式
一、质粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L 188Q)
本发明所使用的质粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)由德国斯图加特大学R.D.Schmid教授惠赠，它是将细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶基因插入原始载体pET-28a(+)的启动子下游制得，其中突变基因的序列和重组质粒的结构已记载在中国专利00810943.5、中国专利200610052588.0和文献(“Directed Evolution of the Fatty-Acid Hydroxylase P450 BM-3 into an Indole-Hydroxylating Catalyst.Chemistry-A European Journal.2000，6(9)：1531-1536”)中。重组质粒的构建方法可以参考现有的一般质粒构建方法。利用该质粒的目的是为了得到细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶基因，对载体无特异性要求。
二、定点突变PCR引物设计和PCR扩增产物的获得
根据细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)基因的血红素域部分设计如下两对定点突变引物，分别在基因第168位点引入亮氨酸突变，在第435位定点引入苏氨酸突变：
第一对引物：
上游引物：5’-TTTTACCGACTGCAGCCTCATCC-3’
下游引物：5’-GAGGCTGCAGTCGGTAAAAGCTG-3’
第二对引物：
上游引物：5’-CGAGCTGGATATTAAAACGACTTTAACG-3’
下游引物：5’-CGTTAAAGTCGTTTTAATATCCAGCTCG-3’
PCR反应体系为50μl：
即向250μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，各15pmol的上游引物和下游引物，大约2ng的模板质粒pET28a+P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，2.5U高保真pfu聚合酶，终浓度7mM的MgCl2溶液，Pfu缓冲液5μl，最后用无菌蒸馏水加至总体积50μl。
PCR程序为：
95℃预变性2min后进入扩增循环，即在95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延长5min，共循环20次，然后72℃延伸5min，得到定点突变PCR产物。
三、突变文库的构建
将上述获得的定点突变PCR产物，经过DpnI消化模板基因，获得突变基因文库；将所获突变基因文库转化至大肠杆菌(E.coli)BL21化学感受态细胞中，涂布到含有50ng/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
四、突变体文库的筛选及质粒测序
从平板上挑取单菌落，接种于5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于温度为37℃，转速为200rpm条件下培养过夜，然后提取质粒，进行基因测序。
结果从待测基因中发现了一个突变基因，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示，该基因编码第168位氨基酸残基的密码子由编码天冬氨酸(GAT)突变为编码亮氨酸(CTT)，第435位氨基酸残基的密码子由编码谷氨酸(GAA)突变为编码苏氨酸(ACG)，因此该基因编码的细胞色素P450 BM-3酶为五位点突变酶： 细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
五、五位点突变细胞色素P450BM-3变体酶的分离纯化
将携带有细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶基因的大肠杆菌(E.coli)BL21接种到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于温度为37℃，转速为200rpm条件下培养过夜。
取上述过夜培养物接种到100ml新鲜的含50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，接种量为2％，于温度为37℃，转速为180rpm条件下培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导，调节培养温度为30℃，转速为150rpm，继续诱导8小时后结束诱导。
将上述诱导培养液于转速为5000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌生理盐水洗涤2遍，在冰浴条件下超声破胞，破胞条件为：功率300瓦，3s工作，6s间歇，90个循环；超声破胞后的破胞液在转速为15000rpm，温度为4℃下离心30min，上清即为粗酶液。
粗酶液用金属螯合亲和层析(IMAC)纯化，其中金属螯合介质为Ni-NTA介质，透过的纯酶在去除咪唑之后，可以进行比活力测定及酶学参数的测定。
父本细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶的制备方法同上，区别在于采用携带质粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的大肠杆菌(E.coli)进行诱导培养。
六、五位点突变酶催化吲哚生成靛蓝比活力及酶学参数的测定
比活力定义为每分钟每纳摩蛋白催化底物吲哚所得到靛蓝的量，单位为μmol靛蓝/(nmol蛋白·min)。
测定方法：于1ml的100mM pH8.2的Tris-Cl反应体系中加入1nmol的纯酶、终浓度5mM的吲哚，置于37℃保温10min后，加入0.4mg NADPH启动反应，反应于温度为37℃水浴，转速为150rpm避光条件下进行，反应10min后立即取出，迅速加入6M KOH终止反应，于分光光度计上测定波长为670nm下的光吸收值即为靛蓝的光吸收情况，并根据靛蓝摩尔消光系数ε＝3900M-1·cm-1计算出靛蓝的浓度。
由此计算出的细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶对靛蓝的比活力为21.7μmol/(nmol·min)，而细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶对靛蓝的比活力为2.8μmol/(nmol·min)，故上述 变体酶的比活力提高了7.0倍。
其他酶学参数通过对酶动力学曲线的测定获得，反应条件为于1ml的100mM pH8.2的Tris-Cl反应体系中加入lnmol的纯酶、终浓度1～8mM的吲哚，置于37℃保温10min，加入0.4mg NADPH启动反应，反应在温度为37℃水浴，转速为150rpm避光条件下进行，反应10min后立即取出，迅速加入6M KOH终止反应，于分光光度计上测定波长为670nm处的光吸收值即为靛蓝的光吸收情况，根据靛蓝摩尔消光系数ε＝3900M-1·cm-1计算出靛蓝的浓度。
结果发现：细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶对靛蓝的KM值为1.72mM，显著低于父本酶P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的2.09mM，表明突变酶对底物具有更高的亲和力；细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)变体酶的转化数(Kcat)为28.15min-1，是父本(4.04min-1)的7.0倍；变体酶的催化效率(Kcat/KM)为16.37mM-1·min-1，是父本(1.93mM-1·min-1)的8.5倍。
七、饱和突变PCR引物设计和PCR扩增产物的获得
根据细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶基因的血红素域部分设计饱和定点突变引物，具体为：
上游引物：5’-GGCTTTNNNGTAAAAGCAAAATCG-3’，
下游引物：5’-TTTTACNNNAAAGCCTTCAGGTTT-3’。
PCR反应体系为50μl：
即向250μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，各15pmol的上游引物和下游引物，大约2ng的模板质粒pET28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)，2.5U高保真pfu聚合酶，终浓度7mM的MgCl2溶液，Pfu缓冲液5μl，最后用无菌蒸馏水加至总体积50μl。
PCR程序为：
95℃预变性2min后进入扩增循环，即在95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延长5min，共循环20次，然后72℃延伸5min，得到定点饱和突变PCR产物。
八、突变文库的构建
将上述获得的定点突变PCR产物，经过Dpn I消化模板基因，获得突变基因文库；将所获突变基因文库转化至E.coli BL21化学感受态细胞中，涂布到含有50ng/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
九、突变体文库的筛选及质粒测序
从平板上挑取单菌落，用牙签接菌于每孔装有1ml LB液体培养基(含有50ng/ml卡那霉素)的96微孔板中，于温度为37℃，转速为200rpm条件下培养过夜；
取50ul上述过夜培养物转接到一块新的每孔装有1ml LB液体培养基(含有50ng/ml卡那霉素)的96微孔板中，于温度为37℃，转速为200rpm条件下培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度0.5mM的IPTG诱导，于温度为30℃，转速为180rpm条件下诱导12小时；
加入终浓度0.5mM的吲哚，于温度为30℃，转速为180rpm条件下反应10小时后，于转速为10000rpm条件下离心1分钟以收集菌体，用二甲基亚砜萃取菌体上的色素，在分光光度计上测定波长为670nm处的光吸收值，即靛蓝的光吸收情况，挑选吸收值大于父本的菌株提取质粒进行测序。
结果从待测基因中发现了一个突变基因，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，该基因编码第445位氨基酸残基的密码子由编码缬氨酸(GTT)突变为编码丙氨酸(GCG)，因此该基因编码的细胞色素P450BM-3酶为六位点突变酶：细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)变体酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
十、六位点突变细胞色素P450BM-3变体酶的分离纯化
将携带有细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)酶变体基因的大肠杆菌接种到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于温度为37℃，转速为200rpm条件下培养过夜；
取上述过夜培养物接种到100ml新鲜的含50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，接种量为2％，于温度为37℃，转速为180rpm条件下培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导，调节培养温度为30℃，转速为150rpm，继续诱导8小时后结束诱导；
将上述诱导培养液于转速为5000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌生理盐水洗涤2遍，在冰浴条件下超声破胞，破胞条件为：功率300瓦，3s工作，6s间歇，90个循环；超声破胞后的破胞液在转速为15000rpm，温度为4℃下离心30min，上清即为粗酶液。
粗酶液用金属螯合亲和层析(IMAC)纯化，其中金属螯合介质为Ni-NTA介质，透过的纯酶在去除咪唑之后，可以进行比活力测定及酶学参数的测定。
十一、六位点突变酶催化吲哚生成靛蓝比活力及酶学参数的测定
按照上述方法进行测试，结果如下：
细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)变体酶对靛蓝的比活力为46.7μmol/(nmol·min)，而父本细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶对靛蓝的比活力为2.8μmol/(nmol·min)，比活力提高116.7倍。
细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)变体酶的转化数(Kcat)为74.34min-1，是父本(28.15min-1)的2.6倍，细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶(4.04min-1)的18.4倍；本发明变体酶的催化效率(Kcat/KM)为25.11 mM-1·min-1，是父本(16.37mM-1·min-1)的1.5倍，是细胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶(1.93 mM-1·min-1)的13.0倍。
Claims (8)
1.一种细胞色素P450BM-3变体酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述细胞色素P450BM-3变体酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种包含如权利要求2或3所述基因的表达盒。
5.一种包含如权利要求2或3所述基因的重组载体。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，原始载体为pET-28a、pET-29、pET-30、pET-34或pRSET。
7.一种包含如权利要求2或3所述基因的转化子。
8.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌（E.coli）BL21、大肠杆菌（E.coli）BLR、大肠杆菌（E.coli）Origami、大肠杆菌（E.coli）NovaBlue或大肠杆菌（E.coli）Rosetta。
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| CN1900285A (zh) * | 2006-07-21 | 2007-01-24 | 浙江大学 | 能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Asp168His变体基因及其用途 |
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2012
- 2012-07-24 CN CN201210257003.4A patent/CN102747053B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1900285A (zh) * | 2006-07-21 | 2007-01-24 | 浙江大学 | 能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Asp168His变体基因及其用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 李红梅等.氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响.《高校化学工程学报》.2008,第22卷(第2期),摘要，第287页第1段. |
| 氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响;李红梅等;《高校化学工程学报》;20080430;第22卷(第2期);摘要，第287页第1段 * |
| 细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造;胡升等;《化工学报》;20091130;第60卷(第11期);2869-2875 * |
| 胡升等.细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造.《化工学报》.2009,第60卷(第11期),2869-2875. |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024038270A1 (en) * | 2022-08-16 | 2024-02-22 | Oxford University Innovation Limited | Oxidation of steroids |
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