JP2006087422A - インジゴ還元酵素及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 インジゴをロイコインジゴに還元する酵素、特に、Bacillus cohniiが産生する新規なインジゴ還元酵素、該インジゴ還元酵素を産生する微生物であるBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)及び該微生物の培養物から調製するインジゴ還元酵素の製造方法、並びにインジゴ還元酵素の用途を提供する。
【選択図】 なし
Description
発酵工学雑誌、38巻、6号、293−299頁 発酵工学雑誌、38巻、7号、329−337頁 発酵工学雑誌、40巻、2号、77−84頁 発酵工学雑誌、40巻、3号、103−107頁
(1)Bacillus cohniiが産生のインジゴ還元酵素。
(2)Bacillus cohniiがBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)である上記(1)に記載のインジゴ還元酵素。
(3)Bacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)。
(4)Bacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)が保有のインジゴ還元酵素遺伝子。
(5)上記(4)に記載のインジゴ還元酵素遺伝子を発現させることにより製造されるインジゴ還元酵素。
(6)N末端アミノ酸配列が、配列番号1に記載の、Met Tyr Glu Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Ala Ala Asn X Leu Glu Pro Gly Ile Asp Gluである、上記(1)、(2)又は(5)のいずれかに記載のインジゴ還元酵素。
(7)天然藍染料及び/又は合成インジゴ染料を用いる染色工程において上記(1)、(2)又は(6)に記載のインジゴ還元酵素を用いることを特徴とする染色方法。
(8)上記(1)、(2)、(5)又は(6)に記載のインジゴ還元酵素と天然藍染料及び/又は合成インジゴ染料とからなる藍染め染色用キット。
(9)上記(1)、(2)、(5)又は(6)に記載のインジゴ還元酵素を有効成分として染毛効果を奏する量、含有することを特徴とする染毛剤。
(10)Bacillus cohniiの培養物から調製することを特徴とするインジゴ還元酵素の製造方法。
(11)Bacillus cohniiがBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)である上記(10)に記載のインジゴ還元酵素の製造方法。
インジゴ + 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)→ ロイコインジゴ + 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)
(b)至適pH:7.5付近
(c)至適温度:30℃付近
(d)pH安定性:pH6.5〜8.0で安定
(e)熱安定性:35℃以下で安定
(f)分子量:ゲルろ過により74kDa
(g)電子受容体特異性:2,6−ジクロロフェノールインドフェノールに対して特異性を有する。
(h)N末端アミノ酸配列 :Met Tyr Glu Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Ala Ala Asn X Leu Glu Pro Gly Ile Asp Glu(Xは未同定のアミノ酸)(配列番号1)
(1)菌の形態:桿菌
(2)グラム染色:+
(3)芽胞の形:卵円形
(4)芽胞の位置:中央
(5)菌体の膨順:−
2.生理学的性質
(1)カタラーゼ:+
(2)オキシダーゼ:+
(3)嫌気性寒天での生育:−
(4)VPテスト:−
(5)グルコースからの酸産生:+
(6)アラビノースからの酸生成:+
(7)キシロースからの酸生成:+
(8)マンニットからの酸生成:+
(9)カゼイン加水分解:+
(10)ゼラチン加水分解:+
(11)デンプン加水分解:+
(12)硝酸銀の還元:+
(13)ウレアーゼ:−
(14)2%NaClでの生育:+
(15)5%NaClでの生育:+
(16)7%NaClでの生育:+
(17)10%NaClでの生育:−
(18)40℃での生育:+
(19)45℃での生育:−
(20)50℃での生育:−
(21)SCD培地でのpH9,12の好気培養で発育良好
(22)GAM培地でpH12の嫌気培養で弱い発育
(1)培養
分離したBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)をSCD培地(15% トリペプトン、5% ソイペプトン、5% NaCl)200mlに植菌し、37℃で二昼夜振盪培養した。菌体を2Lの培地に植え継ぎ、さらに48時間振盪培養した。培養後、遠心分離により培地成分と菌体に分離し、8.4gの湿菌体を得た。
上記で得られた湿菌体を10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)25mlに懸濁した後、超音波により破砕した(処理時間:5分×3回)。菌体破砕後、遠心分離により固形物を沈殿させ、得られた上清を粗酵素抽出液として精製に用いた。
上記方法により得られた粗酵素抽出液を10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAE−トヨパールカラムにかけ、0〜0.5M NaClによる直線濃度勾配で溶出し、酵素の活性画分を集めた。こうして得られた粗酵素液を用いて本酵素の性質を以下のごとく調べた。
[活性測定試験]
インジゴ還元酵素の活性の測定は、インジゴカルミンを基質として35℃で反応を行い、インジゴカルミンの610nmでの吸光度変化を測定する。反応液は最終組成が、200mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.1mM NADH、0.1mM インジゴカルミンとなるように調製し、粗酵素液とイオン交換水を加えて総量1mlとする。具体的には、インジゴカルミンとNADH以外の反応液を試験管に調製し、パラフィルムで試験管口を塞いで、窒素ガスを3分間吹き込む。その後、素早く試験管口をパラフィルムで塞ぎ、35℃の恒温槽に5分間浸けた後、インジゴカルミンとNADHで反応を開始させ、減少する610nmの吸光度を測定する。ここでインジゴカルミンとNADHは、あらかじめ窒素ガスを5分間吹き込み、反応を開始させる時はマイクロシリンジを用いて添加する。
本発明の酵素の至適pHを求めるため、上述した活性測定試験において反応液中の緩衝液のpHを3.5から9.5まで変化させ(pH3.5−5.5:酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5−7.0:ビストリス塩酸緩衝液、pH7.0−8.0:ヘペス緩衝液、pH8.0−9.0:トリス塩酸緩衝液、pH9−9.5:グリシンナトリウム緩衝液)、それぞれのpHにおける酵素活性を測定した。結果を図1に示す。その結果、本酵素の至適pHは7.5付近であることが示された。次に本酵素のpH安定性を調べるために、本酵素を10mMの緩衝液(pH3.5−9.5)存在下、40℃で10分間保温し、その後pH7.0で残存活性を同様の方法で測定した。結果を図2に示す。その結果、本酵素はpH6.5〜8.0の間で安定であることが示された。
本酵素の至適温度を求めるため、上述した活性測定試験において反応時の反応温度を20℃から55℃まで変化させ、その時の反応性を調べた。結果を図3に示す。その結果、本酵素は反応温度の上昇とともに活性が増大し、40℃以上で顕著な活性の低下が認められた。次に、本酵素の熱安定性を調べるために、本酵素を20℃から55℃までの間の温度でそれぞれ10分間保温し、その後の残存活性を35℃で測定した。結果を図4に示す。その結果、本酵素は35℃まで安定であることが示された。
本酵素のNADH及びインジゴカルミンに対する見かけのKm値を、次のようにして求めた。上述した活性測定試験において、NADHの最終濃度を0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.08mM、0.1mMとして活性測定を行ったところ、NADHに対する見かけのKm値は0.18mMとなった。また、上述した活性測定試験において、インジゴカルミンの最終濃度を0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mMとして活性測定を行ったところ、インジゴカルミンに対する見かけのKm値は0.03mMとなった。
上述した活性測定試験のインジゴカルミンの代わりに、2,6−ジクロロフェノールインドフェノールを最終濃度が0.1mMになるように加え、605nmでの吸光度の経時的な減少を測定した。同様にして、本酵素に種々の電子受容体を共存させた場合の各電子受容体での活性を測定し、相対活性として表2に示した。その結果、表2に示すように2,6−ジクロロフェノールインドフェノールの活性が最も高く、本酵素は2,6−ジクロロフェノールインドフェノールに対して電子受容体特性を有することがわかった。
ゲルろ過クロマトグラフィーにより本酵素の分子量を求めた。0.2M NaClを含むTris/HCl緩衝液(pH7.5)で平衡化したSuperose6(Amersham Biosciences社製)を担体に用いた。また標準タンパクとしてフェリチン(分子量:44kDa)、アルドラーゼ(15.8kDa)、アルブミン(67kDa)、キモトリプシン(25kDa)、リボヌクレアーゼ(13.7kDa)を含むタンパク質分子量マーカー(Amersham Biosciences社製)を用いた。標準タンパクから検量線を作成し本酵素の分子量を求めたところ、74kDaであることが示された。
前記(3)の粗酵素液をSDS処理した後、SDSポリアクリルゲル電気泳動を行った。その間に、ろ紙をトランスファー緩衝液(10mM CAPS、NaOHでpH11に調整)に浸し、PVDF膜もメタノールで60秒間洗浄後、トランスファー緩衝液に浸しておいた。電気泳動終了後、重ねたゲルとPVDF膜をろ紙で挟み、転写装置にセットして20Vで1時間半通電させた。転写後、PVDF膜を超純水で5分間、2回洗浄した後、洗浄緩衝液(10mM ホウ酸、25mM NaCl、NaOHでpH8に調整)で5分間、2回洗浄し、更に超純水で5分間、2回洗浄を行った。続いて、Ponceau S染色液で5分間染色した後、脱色液でバンドが明確になるまで脱色を行った。このPVDF膜を自然乾燥させた後、分子量74kDaの目的バンド部分を切り出し、N末端アミノ酸配列の決定に供した。N末端アミノ酸配列の分析はプロテインシークエンサー(株式会社島津製作所製、PPSQ−10)を用いて行った。その結果、得られたN末端アミノ酸配列は、Met Tyr Glu Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Ala Ala Asn X Leu Glu Pro Gly Ile Asp Glu(Xは未同定のアミノ酸)であった。更に、前記N末端アミノ酸配列をコードするコドンとその縮重に基づき、次の合成ヌクレオチド、ATGTAYGARYTICCNCARYTICC(YはT又はC、RはA又はG、IはInosine、NはA,G,C又はT)をプローブとして作製した。尚、配列番号1は、上記N末端アミノ酸配列を示し、配列番号2は、上記合成ヌクレオチドの塩基配列を示す。
<インジゴ還元酵素遺伝子のクローニングとその発現による該酵素の量産>
これには公知の方法を用いることができる。例えば、Bacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)からゲノムDNAやmRNAを抽出・精製し、ゲノムDNAライブラリーやcDNAライブラリーを作成の後、そのライブリーからインジゴ還元酵素遺伝子を選別あるいはスクリーニングする。このスクリーニングは、インジゴ還元酵素のN末端アミノ酸配列、例えば配列番号1に記載のアミノ酸配列のコドンに基づく合成オリゴヌクレオチド(配列番号2)や、インジゴ還元酵素に対する抗体等をプローブあるいはマーカーとして用いる、サザンハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等により行うことができる。これにより得られたクローンが長いDNA断片の場合には、更に、サブクローニングを行うことにより、より短いDNA断片としてインジゴ還元酵素遺伝子を特定し、クローンとして得ることができる。得られたインジゴ還元酵素遺伝子クローン(DNA断片)につき、塩基配列を決定すると共に、その塩基配列に基づきコーディング領域(開始コドンから終止コドンまでの領域)を解読する。次いで、解読したインジゴ還元酵素遺伝子コーディング領域を含むDNA断片を大腸菌や枯草菌等のベクターに挿入連係することにより発現ベクターを構築の後、このベクターを宿主である大腸菌や枯草菌等に移入することにより形質転換体を得る。そして、この形質転換体を培養することによりインジゴ還元酵素を量産することができる。上記の詳しいプロトコルについては、例えば、常用のテキストMolecular Cloning A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., J. Sambrookら著, CSHL Press 2001年発行(http//www.MolecularCloning.com)に記載されている。
Claims (11)
- Bacillus cohniiが産生のインジゴ還元酵素。
- Bacillus cohniiがBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)である請求項1に記載のインジゴ還元酵素。
- Bacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)。
- Bacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)が保有のインジゴ還元酵素遺伝子。
- 請求項4に記載のインジゴ還元酵素遺伝子を発現させることにより製造されるインジゴ還元酵素。
- N末端アミノ酸配列が、配列番号1に記載の、Met Tyr Glu Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Ala Ala Asn X Leu Glu Pro Gly Ile Asp Gluである、請求項1、2又は5のいずれかに記載のインジゴ還元酵素。
- 天然藍染料及び/又は合成インジゴ染料を用いる染色工程において請求項1、2、5又は6に記載のインジゴ還元酵素を用いることを特徴とする染色方法。
- 請求項1、2、5又は6に記載のインジゴ還元酵素と天然藍染料及び/又は合成インジゴ染料とからなる藍染め染色用キット。
- 請求項1、2、5又は6に記載のインジゴ還元酵素を有効成分として染毛効果を奏する量、含有することを特徴とする染毛剤。
- Bacillus cohniiの培養物から調製することを特徴とするインジゴ還元酵素の製造方法。
- Bacillus cohniiがBacillus cohnii BC−001株(製評機構 受託番号 NITE P−15)である請求項10に記載のインジゴ還元酵素の製造方法。
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