CN102731649A

CN102731649A - 一种鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体、及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102731649A
Application number: CN2012101969278A
Authority: CN
Inventors: 朱建国; 李本强; 王曼; 张艳玲
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: CN102731649B

Abstract

本发明涉及一种利用分子生物学手段制备鸡源性抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。ELISA实验证明，获得的抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体能与鸡新城疫病毒特异性结合；利用病毒蚀斑减少实验对单链抗体抗病毒活性进行测定，单链抗体的试验组与阴性对照组相比，蚀斑数减少50%以上，显示了单链抗体一定的体外抗病毒活性，可以用于鸡新城疫的预防、诊断和/或治疗。

Description

一种鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体、及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及其用途，所述单链抗体能与鸡新城疫病毒特异性结合并具有一定的体外抗病毒活性。

背景技术

鸡新城疫是新城疫病毒引起的禽类急性、高度接触性和致死性的传染病，对我国乃至世界养禽业的危害及其严重，被国际兽医局确定为A类传染病，也是我国禽肉出口检疫的重要疾病之一。对于病毒性传染病，目前尚没有特异性治疗药物。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗病毒药物的潜力，受到该领域高度重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体，该单链抗体能够与鸡新城疫病毒特异性结合，且具有一定的抗病毒活性，能够用于鸡新城疫的诊断、预防和/或治疗。

一种鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为（GCCAGAGCCACCTCCGCC）。

上述单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种编码所述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的基因，其具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。

为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步涉及酶切位点和识别序列，优选的进一步含有内切酶位点NotI、NcoI和识别序列。其中NcoI：CCATGG NotI：GCGGCCGC。

本发明的再一目的是提供一种含有编码上述单链抗体的基因的表达载体。上述表达载体为原核表达载体，优选为pOPE101-XP载体。

本发明的再一目的是提供一种制备上述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的方法，包括以下步骤：

（1）采用RT-PCR直接从ND GA/VA疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；

（2）利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体基因；

（3）将步骤（2）的鸡源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒；

（4）将步骤（3）的原核表达载体pOPE101-XP转化入E.coli JM109感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），培养、表达单链抗体；

（5）分离纯化步骤（4）所得培养产物即获得所述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体。（按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行）

需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料,所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。

本发明的再一目的是提供上述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体在用于制备鸡新城疫的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。

本发明的再一目的是提供上述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体在用于制备鸡新城疫的预防、治疗药物中的应用。

本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从ND（新城疫）GA/VA疫苗株免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因。利用SOE-PCR（重组链延伸反应）法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒并转入大肠杆菌表达，间接ELISA筛选原核表达的抗NDV单链抗体的阳性克隆，测序后进行Clustalw多序列比较，并利用蚀斑减少试验证明该单链抗体具有抗新城疫病毒的活性。

本发明的有益效果是：抗鸡新城疫病毒的基因工程抗体能与鸡新城疫病毒特异性结合，具有一定的体外抗病毒活性，能够用于鸡新城疫的诊断和治疗。

附图说明：

图1是实施例1的pOPE101-XP重组载体的结构图。

具体实施方式：

实施例1 鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的制备

1：将鸡新城疫疫苗（Bio ND VG/GA购自梅里亚集团）按使用说明免疫鸡（罗曼母鸡，4月龄、体重1.5kg，购自上海思甜家禽养殖专业合作社），用常规（参照F.M.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》）ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，收获鸡脾脏，经匀浆研磨后，用Trizol法（TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司）提取总RNA。以提取的总RN为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒（cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司）的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。

2：根据GenBank已公布的鸡抗体编码基因可变区序列(AJ298107.1)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物（表1），其中VH1F和VH1R用于扩增VH区；VL1F和VL1R用于扩增VL区；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL2R、VL2F用于VL基因加入酶切位点和Linker序列。其中，VH2F、VL2R分别含有NotI和NcoI酶切位点；VH2R、VL2F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小

3：VH和VL基因的扩增

以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因；VL1F、VL1R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物（25μM）各1μL，ddH₂O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因（根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作）。

4：ScFv基因的获得

分别以VH和VL基因为模版，VH2R、VL2F为引物PCR扩增带有Linker的重链可变区和轻链可变区基因，PCR条件同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因（含有Linker序列的VH和VL基因）。通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VH和VL基因连接为ScFv基因，并加入NotI和NcoI酶切位点。

5：ScFv基因原核表达质粒的构建

根据常规分子克隆方法（参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》），ScFv基因和pOPE101-XP载体分别经NotI和NcoI双酶切后，将ScFv基因插入pOPE101-XP载体（常州安比森生物科技有限公司提供），构建重组表达质粒（参见图1），并将其转化E.coli JM109感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），得到重组表达宿主。转化的克隆进行菌液PCR鉴定和质粒双酶切鉴定。

6：ScFv的诱导表达

将鉴定后的阳性克隆在含Amp+（终浓度为100μM）的LB液体培养基中培养至菌液OD600至0.6。将菌液分为三份，分别为诱导组、TES处理组和非诱导组。诱导组和TES处理组在菌液中加入IPTG(终浓度100μM)，于30℃诱导4h，收集菌液。菌液经离心收集沉淀，一份为诱导组，另一份用冰冷的TES(50mmol/LTrils-HCl，1mmol/L EDTA,250g/L Sucrose)重悬，冰上放置15min，离心收集上清为TES处理组。根据默克公司的《pET System Manual》进行分离纯化。

实施例2 抗原特异性ScFv的间接ELISA筛选

取纯化的NDV（鸡新城疫病毒F48E9由中国农科院上海畜牧兽医研究所馈赠）用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，5%脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(含0.1%Tween20，以下同)洗涤3次；取TES处理菌液上清50μL，与4%脱脂奶粉溶液50μL混匀后加入上述包被好的NDV，37℃反应2h，PBST洗涤；加入Myc-Tag Mouse mAb（Myc-标签鼠单克隆抗体购自RayBioTech公司）100μL(1:2000)37℃反应2h，PBST洗涤；加入Peroxidase-conjugated Affinipure GoagtAnti-Mouse IgG（购自Abmart公司）100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST洗涤；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设未诱导菌液上清为表达阴性对照，BSA为抗原阴性对照。间接ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。阳性克隆经3次重复性试验验证（参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》），同时设传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒等，为抗原对照验证单链抗体的特异性。证明单链抗体A能够识别鸡新城疫病毒，但不与鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒等发生交叉免疫反应。

实施例3 对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其由726个核苷酸及据此推测的244个氨基酸组成，所述核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

实施例4 利用病毒蚀斑减少实验对单链抗体抗病毒活性进行测定

病毒蚀斑减少实验共分三组,每组9个重复。第一组为实验组,将经过预实验测定了最适抗病毒浓度的单链抗体无菌处理后用细胞培养基1：1稀释，分别与100TCID50新城疫病毒液混合，37℃作用1h；第二组为阴性对照组，只加相同剂量的抗体稀释液（细胞培养基）与100TCID50病毒液混合。两组分别接种培养在细胞瓶里24h的BHK21细胞中，同时设第三组为空白对照，为与上述两组培养条件一直的细胞瓶。37℃培养2h，将琼脂覆盖层加温45℃,加入各细胞瓶，放置待琼脂凝固后，翻转培养于37℃，逐日观察，结果如下：

1试验组:单链抗体保护组细胞，少数细胞发生一些形态变化，基本上维持原形状。平均蚀斑数为2.5个。与阴性对照组相比，蚀斑数减少50%以上。

2阴性对照组，细胞出现颗粒增多，细胞变圆，出现肿胀，贴壁细胞大面积脱落，很多细胞融合形成合胞体。平均蚀斑数为5.5个。

3空白对照组：正常的BHK21细胞，贴壁细胞，有点梭形，细胞生长良好，细胞膜界限清晰。无病毒蚀斑。

结果显示试验组与阴性对照组相比，蚀斑数减少50%以上。说明单链抗体具有一定的抗新城疫病毒活性，可以用于鸡新城疫病毒的诊断和治疗。

Claims

1.一种鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。

2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于其具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1所述的单链抗体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点NotI、NcoI，其中NcoI为CCATGG，NotI为GCGGCCGC。

6.含有权利要求3-5任一项所述的基因的表达载体。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述载体为原核表达载体。

8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述载体为pOPE101-XP载体。

9.一种制备如权利要求1所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的方法，包括以下步骤：

（4）将步骤（3）的原核表达载体pOPE101-XP转化入E.coli JM109感受态细胞，培养、表达单链抗体；

（5）分离纯化步骤（4）所得培养产物即获得所述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体。

10.如权利要求1或2所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体在用于制备鸡新城疫的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。

11.如权利要求1或2所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体在用于制备鸡新城疫的预防和/或治疗药物中的应用。