CN102731623A - 鼠源性单克隆抗体3d8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了治疗汉滩病毒(HTNV)感染引起的肾综合征出血热(HFRS)的中和性单克隆抗体3D8所识别的HTNV-GP特异性的B细胞表位及该表位的关键氨基酸残基序列。所述的B细胞表位,其氨基酸序列为882GFLCPEFPGSFRKKC896。可应用于研究3D8中和单克隆抗体治疗肾综合征出血热的机制,或制备治疗肾综合征出血热的药物以及制备新型的针对汉滩病毒76-118株的疫苗,或作为靶蛋白用于开发新型汉滩病毒76-118株相关诊断试剂盒。该发明在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于汉滩病毒的防治技术领域,具体涉及肾综合征出血热(HFRS)治疗性单抗3D8识别的特异性糖蛋白(glycoprotein,GP)表位肽及其应用。
背景技术
汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)是《禁止生物武器公约》议定书核查范围的病原微生物中一种重要的病毒,属于布尼亚病毒科汉坦病毒属(Hantavirus)。汉坦病毒属病毒均为单股负链RNA有包膜病毒,基因组包括大(L)、中(M)、小(S)三个片段,其中L片段编码RNA聚合酶,M片段编码包膜糖蛋白1和2(glycoprotein 1,G1/Gn和glycoprotein 2,G2/Gc),S片段编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。1978年李镐汪等首先分离出的HTNV 76-118株是HTNV的代表株[1],也是在我国引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的主要病原体之一。
HFRS是一种以发热、出血和急性肾功能损害为特征的急性传染病,典型病例可有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过,同时存在有大量轻型非典型病例。人群对HTNV有较普遍的易感性,在人口密集,带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。全球每年HFRS发病人数达10万例,死亡率在2%~10%左右,90%以上病例发生在我国,已成为我国目前死亡人数最多的传染病之一。
HFRS在我国分布广,发病率和病死率较高,并且新疫区仍不断出现,在广大农村、城镇和林区部分疫点还时有爆发,严重危害我国人民的生命和健康,威胁和影响工农业生产、经济开发、外贸及旅游事业的发展,是国家重点防治的传染病之一。
然而对于HFRS的治疗,目前尚无特效药物,主要采取综合性对症治疗,如支持治疗,控制血压,控制体液平衡以及透析治疗等。近年来,早期治疗除了对症和支持治疗外,特别强调抗病毒疗法。据报道早期(5病日内)应用病毒唑和(或)干扰素、特异性免疫球蛋白和免疫血清可程度不同地缩短退热时间,加速尿蛋白转阴,提高越期率,降低病死率。由于汉坦病毒是HFRS的始动病因,而免疫病理损伤则是继发性的,因而早期清除患者体内病毒对减轻病理损害,阻断病情发展具有重要意义。因此,努力开发新的高效特异性抗病毒药物是HFRS和其他病毒性疾病治疗研究中亟待解决的问题。特异性单抗是现代生物技术领域中研究开发最多的一类新型药物。目前单抗对感染动物的实验性治疗已涉及到许多病毒性疾病,特别是一些危害严重的急性病毒病,如汉坦病毒、脑炎病毒、呼吸道合胞病毒等。这些实验研究充分证明,单抗与一般的抗病毒药物相比,具有高度特异性,保护效果确切,而且有可能只需一次给药即可取得明显疗效。其对感染动物的保护机制主要是单抗对病毒的直接作用,包括中和病毒的作用和直接抑制病毒复制的作用。截至2010年底,共有30种单抗药物被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床治疗,其中主要是针对肿瘤、移植排斥反应及自身免疫性疾病等,仅有1种为抗病毒感染性疾病的药物。随着对病毒抗原变异及其免疫逃逸机制的深入理解,以及抗体制备技术的发展,抗病毒单抗药物的研发成为病毒性疾病药物研发的主要方向之一。
鼠源性单克隆抗体3D8(以下简称3D8单抗)和3G1两株鼠源性单克隆抗体是由申请人和武汉生物制品研究所共同研制的“注射用抗肾综合征出血热病毒单克隆抗体”[2],其I期临床试验结果[3]表明,该单抗药物安全性和耐受性良好。在国内肾综合征出血热(HFRS)高发疫区的8家医院先后进行的II期临床试验(多中心、随机、双盲、安慰剂平行对照)和III期临床试验(多中心、开放、病毒唑平行对照)结果表明[4],采用该单抗药物治疗HFRS早期患者,安全性好,疗效确切,优于常规药物治疗。该单抗药物有望在近期获得国家一类新药证书,成为我国批准上市的第一种治疗病毒性疾病的单抗药物[4]。
然而对于3G1及3D8单抗所识别的抗原表位以及其发挥中和活性的机制,目前尚不完全清楚,采用噬菌体展示肽库法鉴别出一个3G1单抗识别的抗原表位,而对于3D8单抗识别的抗原表位尚不明了。
以下是申请人检索的相关参考文献:
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【3】.Xu R,Yang XY,Yang DF,Zou CY,Gong PL,et al.(2009)Phase I evaluation of the safety and pharmacokinetics of a single-doseintravenous injection of a murine monoclonal antibody against Hantaan virus inhealthy volunteers.Antimicrob Agents Chemother 53:5055-5059。
【4】.徐志凯(2011)重视单克隆抗体在病毒性疾病治疗中的研究与应用,中国病毒病杂志,1∶401-404。
发明内容
本发明的目的在于,提供HFRS治疗性鼠源性单克隆抗体3D8所识别的一个抗原表位肽以及该表位上的关键氨基酸残基,可应用于HTNV多肽药物或疫苗的制备。
为了实现上述任务,本发明采取如下的技术解决方案:
一种鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽,其特征在于,其氨基酸序列为882GFLCPEFPGSFRKKC896。
其中,氨基酸序列中的885C,893R,894K,895K和896C为其关键氨基酸残基序列。
上述鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽的检测方法,其特征在于,首先合成281条重叠多肽,每条合成肽长度为15个氨基酸,相邻肽重叠11个氨基酸,通过间接ELISA法和Dot blot法进行肽扫描,检测合成肽对3D8单抗的反应性,最终将该表位肽精确定位为:882GFLCPEFPGSFRKKC896,其中,885C,893R,894K,895K和896C为其关键氨基酸残基。
同时,序列比对结果显示,882GFLCPEFPGSFRKKC896中的885C,893R,894K,95K和896C为引起肾综合征出血热的汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、普马拉病毒(PUUV)和多布拉伐病毒(DOBV)所特有并保守的B细胞表位。
本发明所鉴定出的肾综合征出血热治疗性单克隆抗体3D8所识别的HTNV-GP特异的B细胞表位,可用于制备治疗或预防汉滩病毒感染的药物或疫苗,或作为靶蛋白用于开发汉滩病毒76-118株相关诊断试剂盒,还可以用于研究3D8中和单克隆抗体治疗肾综合征出血热的机制,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1是合成的281条重叠15肽与3D8单抗反应性分析。其中,图1-1表示间接ELISA法检测28组混合肽与3D8单抗的反应;图1-2表示Dot blot法检测28组混合肽与3D8单抗的反应;图1-3表示G221和3D8单抗的反应;图1-4表示G221与3D8单抗的竞争反应;图1-5表示G221R1和3D8单抗的反应;图1-6表示丙氨酸定点扫描突变后的G221R1与3D8单抗的反应。
图2是图1(包括图1-1~图1-6)中所鉴定的B细胞表位的序列保守性及特异性分析。
具体实施方式
本发明应用的肽扫描技术,具有可以直接确定线性表位的优势,通过以下技术方案来实现:
重叠多肽的合成:根据UniProtKB/Swiss-Prot数据库登录号:P08668-1(Hantaan virus glycoprotein sequence,1135aa)合成重叠多肽,每条合成肽长度为15aa,相邻肽重叠11aa,计281条。委托西安联美生物科技有限公司合成。合成肽纯度>85%(HPLC、MS),合成肽干粉于-20℃保存。
鼠源性中和抗体HTNV GP特异性单克隆抗体3D8,由申请人的微生物学教研室提供。
通过间接ELISA法和Dot blot法进行肽扫描技术,筛选出与3D8单抗反应的B细胞表位肽。
以下是发明人给出的实施例:
用肽扫描技术对单抗3D8所识别的HTNV-GP特异的B细胞表位精确定位:
合成重叠多肽,每条合成肽长度为15aa,相邻肽重叠11aa,计281条。委托西安联美生物科技有限公司合成。合成肽纯度>85%(HPLC、MS)。将281条HTNV-GP合成肽分成28组,其中G1~G10为组1,G11~G20为组2,G21~G30为组3,……,G261~G270为组27,G271~G281为组28。取等体积合成肽贮存液混合,单个合成肽浓度为0.1mM。
用间接ELISA法和Dot blot法进行肽扫描,检测合成肽对3D8单抗的反应性。其中,间接ELISA法是在孔ELISA板上包被合成肽,包被浓度10μM,包被量为1nmol。包被条件为4℃72小时以上,封闭前在37℃继续包被2小时。用PBS-T洗涤2次后,每孔加300μL含5%FCS的PBS-T(抗体稀释液),37℃封闭2小时。用上述抗体稀释液1∶2500稀释3D8单抗,每孔加入100μL,37℃反应1.5小时。用PBS-T洗涤3次后,加入二抗,用上述抗体稀释液1∶2500稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG至1∶2500,每孔加入100μL,37℃反应1小时。PBS-T洗涤3次后显色,每孔加入100μLTMB,45~60分钟后,每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应。酶标仪450nm处测定OD值。Dot blot法是按顺序滴加混合肽5μL或游离肽1μL于NC膜,待其自然干燥。将点样后的NC膜浸入含10%FCS的TBS-T(抗体稀释液)中,室温封闭1~2小时。封闭后的NC膜与3D8单抗(用上述的抗体稀释液1∶4000稀释)4℃过夜反应。用TBS-T洗涤NC膜5次,每次10分钟。NC膜孵育二抗,用上述抗体稀释液1∶2500稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG,室温避光反应1小时。
用TBS-T洗涤NC膜5次,每次10分钟,洗膜后ECL成像。
用竞争ELISA法检测被筛选出的肽与3D8单抗反应的特异性。在孔ELISA板上分别包被G221(筛出的与3D8单抗有阳性反应的肽)及对照肽,包被量为1nmol。包被条件为4℃72小时以上,封闭前在37℃继续包被2小时。用PBS-T洗涤2次后,每孔中加入300μL含5%FCS的PBS-T(抗体稀释液),37℃封闭2小时。用上述抗体稀释液1∶2500稀释3D8单抗,混合游离G221合成肽或对照肽与3D8单抗,每孔加入100μL抗原-抗体混合物,37℃反应1.5小时。用PBS-T洗涤3次后,加入二抗,用上述抗体稀释液1∶2500稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG至1∶2500,每孔加入100μL,37℃反应1小时。PBS-T洗涤3次后显色,每孔加入100μLTMB,45~60分钟后,以每孔50μL 2M H2SO4终止反应。酶标仪450nm处测定OD值。
经过肽扫描法检测,发现G221R1882GFLCPEFPGSFRKKC896为3D8单抗特异识别的B细胞表位,该表位中的885C,893R,894K,895K and896C为关键氨基酸残基序列,并且是引起HFRS的HTNV、SEOV、PUUV和DOBV病毒所特有并保守的B细胞表位。
Claims (7)
1.一种鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽,其特征在于,其氨基酸序列为882GFLCPEFPGSFRKKC896。
2.如权利要求1所述的鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽,其特征在于,其中,氨基酸序列中的885C,893R,894K,895K和896C为其关键氨基酸残基序列。
3.权利要求1所述的鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽的检测方法,其特征在于,首先合成281条重叠多肽,每条合成肽长度为15个氨基酸,相邻肽重叠11个氨基酸,通过间接ELISA法和Dotblot法进行肽扫描,检测合成肽对3D8单抗的反应性,最终将该表位肽精确定位为:882GFLCPEFPGSFRKKC896,其中,885C,893R,894K,895K和896C为其关键氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的间接ELISA法,包括如下步骤:
用PBS-T洗涤2次后,每孔加入300μL含5%FCS的抗体稀释液PBS-T,37℃封闭2小时;
用上述抗体稀释液1∶2500稀释3D8单抗,每孔加入100μL,37℃反应1.5小时;
用PBS-T洗涤3次后,加入二抗,用上述抗体稀释液1∶2500稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG至1∶2500,每孔加入100μL,37℃反应1小时;
PBS-T洗涤3次后显色,每孔加入100μLTMB,反应45~60分钟,每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应;
用酶标仪在450nm处测定OD值。
5.如权利要求3所述方法,其特征在于,所述的Dot blot法包括如下步骤:
在NC膜上标记点样位置;
按顺序滴加待测肽1nM于各点样位置,待其自然干燥;
将点样后的NC膜浸入含10%FCS的抗体稀释液TBS-T中,室温封闭1小时~2小时;
封闭后的NC膜与3D8单抗(用上述的抗体稀释液1∶4000稀释)4℃过夜反应;
用TBS-T洗涤NC膜5次,每次10分钟;
NC膜孵育二抗,用上述抗体稀释液1∶2500稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG,室温避光反应1小时;
TBS-T洗涤NC膜5次,每次10分钟,ECL成像。
6.权利要求1所述的鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽用于制备汉滩病毒多肽疫苗的应用,或用于制备治疗肾综合征出血热的药物的应用。
7.权利要求1所述的鼠源性单克隆抗体3D8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽用于研究3D8中和单克隆抗体治疗肾综合征出血热的机制,或作为靶蛋白用于开发汉滩病毒76-118株相关诊断试剂盒。
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