ES2524385A2 - Composición farmacéutica y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH - Google Patents

Composición farmacéutica y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH Download PDF

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ES2524385A2 ES201430954A ES201430954A ES2524385A2 ES 2524385 A2 ES2524385 A2 ES 2524385A2 ES 201430954 A ES201430954 A ES 201430954A ES 201430954 A ES201430954 A ES 201430954A ES 2524385 A2 ES2524385 A2 ES 2524385A2
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Abstract

Composición farmacéutica y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH. La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH, y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH, incluido el SIDA.

Description

P201430954
24-06-2014
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH
Campo
5 La presente invención se refiere a una composición farmacéutica y su uso para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH.
Antecedentes
La invención se refiere al área de la medicina y se puede usar para preparar
10 medicamentos destinados al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH, incluido el SIDA.
El tratamiento de enfermedades virales basado en dosis ultrabajas de anticuerpos contra el interferón es conocido en la técnica (RU 2192888 C1, A61K39/395, 11/20/2002). Sin embargo, el producto médico dado no puede ser suficientemente eficaz para el
15 tratamiento de las enfermedades asociadas con el VIH.
El efecto terapéutico de una forma extremadamente diluida (o forma ultrabaja) de anticuerpos potenciada por tecnología homeopática (forma activada-potenciada) ha sido descubierto por el Dr. Oleg I. Epshtein. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. no. 7.582.294 divulga un medicamento para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata o
20 prostatitis por administración de una forma homeopáticamente activada de anticuerpos contra el antígeno específico de próstata (PSA). Dosis ultrabajas de anticuerpos contra el interferón gamma han demostrado ser útiles en el tratamiento y la profilaxis de enfermedades de etiología viral. Véase la patente de EE.UU. no. 7.572.441, que se incorpora por referencia a la presente memoria en su totalidad.
25 La presente invención está dirigida a una composición farmacéutica y métodos para su uso en el tratamiento y prevención de las enfermedades causadas por el VIH o asociadas con el VIH, incluido el SIDA.
La solución al problema existente se presenta en forma de una composición farmacéutica para el tratamiento y la profilaxis (prevención) de enfermedades o afecciones causadas
30 por el VIH o asociadas con el VIH, que comprende una forma activada-potenciada de anticuerpos contra una proteína del VIH.
Sumario
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En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH. En una realización, la composición farmacéutica comprende además un vehículo sólido, en donde dicha forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH está impregnada sobre dicho vehículo sólido. En una variante, la composición farmacéutica está en forma de comprimido.
En una variante de este aspecto de la invención, la proteína del VIH es una poliproteína Gag-Pol del VIH.
En otra variante de este aspecto de la invención, la proteína del VIH es una enzima del VIH. Preferiblemente, la enzima del VIH es una proteasa del VIH. También está contemplado, que la enzima del VIH sea una integrasa del VIH (endonucleasa del VIH). También está contemplado que la enzima del VIH sea una transcriptasa inversa del VIH.
En otra variante de este aspecto de la invención, la proteína del VIH es la proteína P24 de la cápsida del VIH (proteína P24). También está contemplado, que la proteína del VIH sea la proteína P17 de la matriz (proteína P17).
Preferiblemente, la composición farmacéutica que incluye dicha forma activadapotenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH está en forma de una mezcla de diluciones homeopáticas C12, C30, y C200. Está específicamente contemplado que dicha mezcla de diluciones homeopáticas C12, C30, y C200 esté impregnada sobre un vehículo sólido.
La forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH puede ser un anticuerpo monoclonal, policlonal o natural. Está específcamente contemplado que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH sea un anticuerpo policlonal. La invención proporciona formas activadas-potenciadas de anticuerpos contra (un) antígeno(s) que tiene(n) las secuencias descritas en la memoria descriptiva y reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
En una variante, la composición farmacéutica incluye una forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH preparada mediante diluciones centesimales sucesivas, acopladas a la agitación de cada dilución. La agitación vertical está específicamente contemplada.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar y prevenir las enfermedades causadas por el VIH o asociadas con el VIH, comprendiendo dicho método administrar a un paciente que lo necesita un forma activada-potenciada de un anticuerpo
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contra una proteína del VIH. Preferiblemente, la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH se administra en forma de composición farmacéutica.
En una realización, la composición farmacéutica se administra en la forma de una forma de dosificación oral sólida que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y dicha forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH impregnada sobre dicho vehículo. En una variante, dicha forma de dosificación oral sólida es un comprimido. Se proporcionan variantes y realizaciones.
Según el aspecto del método de la invención, la composición farmacéutica se puede administrar en una o dos formas unitarias de dosificación, administrándose cada una de los formas de dosificación de una vez al día a cuatro veces al día. En una variante, la composición farmacéutica se administra dos veces al día, consistiendo cada administración en dos formas de dosificación oral. En una variante, la composición farmacéutica se administra en una a dos formas unitarias de dosificación, administrándose cada una de las formas de dosificación dos veces al día. Todas las variantes y realizaciones descritas con respecto al aspecto de la composición de la invención se pueden usar con el aspecto del método de la invención.
Descripción detallada
La invención se define haciendo referencia a las reivindicaciones adjuntas. En lo que respecta a las reivindicaciones, el siguiente glosario incluye las definiciones relevantes.
Tal como se emplea en la presente memoria, el término “anticuerpo” significa una inmunoglobulina que se une específicamente a, y es por ello definida como complementaria con, una organización espacial y polar particular de otra molécula. Los anticuerpos citados en las reivindicaciones pueden incluir una inmunoglobulina completa
o un fragmento de la misma, pueden ser naturales, policlonales o monoclonales y pueden incluir diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Sus fragmentos pueden incluir Fab, Fv y F(ab’)2, Fab’ y similares. El término “anticuerpo” en singular incluye el plural “anticuerpos”.
Se utiliza el término “forma activada-potenciada” o “forma potenciada”, respectivamente, en relación con los anticuerpos citados en la presente memoria, para identificar un producto de la potenciación homeopática de cualquier solución inicial de anticuerpos. “Potenciación homeopática” significa el uso de métodos de homeopatía para impartir potencia homeopática a una solución inicial de la sustancia relevante. Aunque no se
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limita a ello, la ‘potenciación homeopática” puede implicar, por ejemplo, diluciones consecutivas repetidas combinadas con un tratamiento externo, en particular agitación vertical (mecánica). En otras palabras, una solución inicial de anticuerpo es sometida a dilución consecutiva repetida y a la agitación vertical múltiple de cada solución obtenida 5 de acuerdo con la tecnología homeopática. La concentración preferida de la solución inicial del anticuerpo en el disolvente, preferiblemente agua o una mezcla de agua-alcohol etílico, oscila entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente de 5,0 mg/ml. El procedimiento que se prefiere utilizar en la preparación de cada componente, es decir, la solución del anticuerpo, es utilizar la mezcla de tres diluciones acuosas o en agua-alcohol 10 de la solución matriz primaria (tintura madre) de anticuerpos diluidos 10012, 10030 y 100200 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones centesimales homeopáticas (C12, C30 y C200) o utilizar la mezcla de tres diluciones acuosas o en agua-alcohol de la solución matriz primaria de anticuerpos diluidos 10012 , 10030 y 10050 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones centesimales homeopáticas (C12, 15 C30 y C50). Se describen ejemplos de potenciación homeopática en las patentes de los Estados Unidos de América No. 7.572.441 y 7.582.294, que se incorporan por referencia a la presente memoria, en su totalidad y para los fines expuestos. Aunque se utiliza el término “forma activada-potenciada” en las reivindicaciones, en los ejemplos se utiliza el término “dosis ultrabajas”. El término “dosis ultrabajas” se convirtió en un término de la
20 técnica en el campo de la técnica creado por el estudio y uso de una forma de una sustancia diluida y potenciada homeopáticamente. El término “dosis ultrabaja” o “dosis ultrabajas” es totalmente compatible y básicamente sinónimo del término forma "activadapotenciada” utilizado en las reivindicaciones.
En otras palabras, un anticuerpo está en la forma “activada-potenciada” o “potenciada”
25 cuando están presentes tres factores. En primer lugar, la forma “activada-potenciada” del anticuerpo es el producto de un proceso de preparación ampliamente aceptado en la técnica homeopática. En segundo lugar, la forma “activada-potenciada” del anticuerpo debe tener actividad biológica determinada mediante métodos ampliamente aceptados en la farmacología moderna. Y, en tercer lugar, la actividad biológica exhibida por la forma
30 “activada y potenciada” del anticuerpo no se puede explicar por la presencia de la forma molecular del anticuerpo en el producto final del proceso homeopático.
Por ejemplo, se puede preparar la forma activada potenciada de los anticuerpos sometiendo a un anticuerpo inicial aislado en una forma molecular a múltiples diluciones consecutivas, acopladas a un impacto externo, tal como agitación mecánica. Se puede 35 igualmente llevar a cabo el tratamiento externo durante el curso de la reducción de la
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concentración, por ejemplo, mediante exposición a factores ultrasónicos, electromagnéticos, u otros factores físicos. V. Schwabe “Homeopathic medicines”, M., 1.967, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 7.229.648 y 4.311.897, que se incorporan por referencia a la presente memoria, en su totalidad y para los fines 5 expuestos, describen tales procesos, que son métodos de potenciación homeopática de amplia aceptación en la técnica homeopática. Este procedimiento da lugar a una disminución uniforme de la concentración molecular de la forma molecular inicial del anticuerpo. Este procedimiento se repite hasta lograr la potencia homeopática deseada. En el anticuerpo individual, se puede determinar la potencia homeopática requerida 10 sometiendo las diluciones intermedias a pruebas biológicas en el modelo farmacológico deseado. Aunque no se limita a ello, la ‘potenciación homeopática” puede implicar, por ejemplo, diluciones consecutivas repetidas combinadas con un tratamiento externo, en particular agitación vertical (mecánica). En otras palabras, una solución inicial de anticuerpo es sometida a dilución consecutiva repetida y a la agitación vertical múltiple de 15 cada solución obtenida de acuerdo con la tecnología homeopática. La concentración preferida de la solución inicial del anticuerpo en el disolvente, preferiblemente agua o una mezcla de agua-alcohol etílico, oscila entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente de 5,0 mg/ml. El procedimiento que se prefiere utilizar en la preparación de cada componente, es decir, la solución del anticuerpo, es utilizar la mezcla de tres diluciones 20 acuosas o en agua-alcohol de la solución matriz primaria (tintura madre) de anticuerpos diluidos 10012, 10030 y 100200 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones centesimales homeopáticas C12, C30 y C200, o la mezcla de tres diluciones acuosas o en agua-alcohol de la solución matriz primaria (tintura madre) de anticuerpos diluidos 10012 , 10030 y 10050 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones 25 centesimales homeopáticas C12, C30 y C50. También se proporcionan ejemplos de cómo obtener la potencia deseada, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de América No. 7.229.648 y 4.311.897, que se incorporan por referencia a la presente memoria para los fines expuestos. A continuación se describe con mayor detalle el procedimiento aplicable a la forma “activada-potenciada” de los anticuerpos descritos en
30 la presente memoria.
Ha habido una enorme controversia en relación con el tratamiento homeopático de los seres humanos. Aun cuando la presente invención se basa en procesos homeopáticos aceptados para obtener la forma “activada-potenciada” de los anticuerpos, no depende únicamente de la homeopatía en los seres humanos para demostrar su actividad. El 35 inventor de la presente solicitud ha descubierto, sorprendentemente, y ha sido ampliamente demostrado en los modelos farmacológicos aceptados, que el disolvente
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obtenido en última instancia a partir de múltiples diluciones consecutivas de una forma molecular inicial de un anticuerpo tiene una actividad definitiva no relacionada con la presencia de trazas de la forma molecular del anticuerpo en la dilución objetivo. La actividad biológica de la forma “activada-potenciada” del anticuerpo proporcionado por la 5 presente invención se ensaya en modelos farmacológicos de actividad ampliamente aceptados bien mediante experimentos in vitro apropiados, o bien in vivo en modelos animales. Los experimentos incluidos más adelante proporcionan evidencias de actividad biológica en estos modelos. Los estudios clínicos con seres humanos también proporcionan evidencias de que la actividad observada en el modelo animal se puede 10 trasladar bien a la terapia humana. Los estudios con seres humanos también han proporcionado evidencias de la disponibilidad de las formas "activadas potenciadas" descritas en la presente memoria para tratar enfermedades humanas específicas o trastornos ampliamente aceptadados como situaciones patológicas en la ciencia médica; la misma está asociada con mayor actividad antiviral y, posiblemente, acción 15 inmunotrópica, intensificación de la activación de linfocitos CD4 y enriquecimiento de
numerosos receptores en la superficie de las células CD4.
Así, se observa pérdida de carga viral como resultado de la represión de la entrada del
VIH en las células (que se muestra como un cambio en la actividad funcional de los
receptores CD4 a través de los cuales el VIH entra en las células); represión de la 20 replicación del VIH dentro de las células, activación de los procesos de transcripción de
ARNm de proteínas antivirales (proteína quinasa PKR, oligoadenilato sintetasa,
adenozima deaminasa), Mx, proteínas del MHC I y II, etc.). Así, el producto medicinal
reivindicado pose una alta eficacia preventiva con respecto al VIH, previniendo la
infección de las ce´lulas por el VIH y su replicación endocelular. Se puede usar o bien 25 para el tratamiento efectivo o en medidas preventivas de enfermedades crónicas virales,
incluida la prevención secundaria de la infección por el VIH.
Además, la forma “activada-potenciada” reivindicada de un anticuerpo abarca únicamente
las soluciones o preparaciones sólidas cuya actividad biológica no puede ser explicada
por la presencia de la forma molecular del anticuerpo remanente de la solución inicial de 30 partida. En otras palabras, aun cuando se contempla que la forma “activada-potenciada”
del anticuerpo puede contener trazas de la forma molecular inicial del anticuerpo, los
expertos en la técnica no podrían atribuir la actividad biológica observada en los modelos
farmacológicos aceptados a la forma molecular remanente del anticuerpo con un grado
de plausibilidad cualquiera debido a las concentraciones extremadamente bajas de la 35 forma molecular del anticuerpo remanente después de las diluciones consecutivas. Aun
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cuando la invención no está limitada por ninguna teoría específica, la actividad biológica de la forma “activada-potenciada’ de los anticuerpos de la presente invención no es atribuible a la forma molecular inicial del anticuerpo. Se prefiere la forma "activadapotenciada del anticuerpo en forma líquida o sólida en la que la concentración de la forma 5 molecular del anticuerpo está por debajo del límite de detección de las técnicas analíticas aceptadas, tales como la electroforesis capilar y la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia. Particularmente preferida es la forma “activada-potenciada” del anticuerpo en forma líquida o sólida en la cual la concentración de la forma molecular inicial del anticuerpo es inferior al número de Avogadro. En la farmacología de las formas 10 moleculares de las sustancias terapéuticas, una práctica común consiste en crear una curva de dosis-respuesta en la cual se representa el nivel de respuesta farmacológica frente a la concentración del fármaco activo administrada al sujeto o probada in vitro. El nivel mínimo del fármaco que produce una respuesta detectable es conocido como la dosis umbral. Específicamente se contempla y se prefiere que la forma “activada
15 potenciada” de los anticuerpos contenga el anticuerpo molecular, de haberlo, a una concentración inferior a la dosis umbral de la forma molecular del anticuerpo en el modelo biológico dado.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una forma activada-potenciada de anticuerpos contra una proteína del VIH, preparada según la 20 tecnología homeopática de potenciación mediante la dilución repetida y consistente y la acción externa intermedia de la agitación tal como se describe con mayor detalle más adelante en la presente memoria. La composición farmacéutica de la invención es particularmente útil para el tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH o asociadas con el VIH, incluido el SIDA. Tal como se muestra en los Ejemplos, la
25 composición farmacéutica de la invención posee un efecto terapéutico inesperado, que se manifiesta con particular eficiencia terapéutica en el tratamiento de enfermedades causadas por el VIH o asociadas con el VIH.
La composición farmacéutica de la invención expande el arsenal de preparaciones disponibles para el tratamiento y la profilaxis de las enfermedades causadas por el VIH o
30 asociadas con el VIH, incluido el SIDA.
La composición farmacéutica según este aspecto de la invención puede estar en forma líquida o en forma sólida. La forma activada potenciada de los anticuerpos incluida en la composición farmacéutica se prepara a partir de una forma molecular inicial del anticuerpo, de conformidad mediante un proceso aceptado en la técnica homeopática. 35 Los anticuerpos de partida pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales
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preparados de acuerdo con procesos conocidos, por ejemplo, conforme se describe en Immunotechniques, G. Frimel, M., “Meditsyna”, 1987, p. 9-33; “Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after” by Laffly E., Sodoyer R. – 2005 – Vol. 14. – N 1-2. P.33-55, ambos incorporados por referencia en la presente memoria.
Se puede obtener anticuerpos monoclonales, por ejemplo, haciendo uso de la tecnología del hibridoma. La etapa inicial del proceso incluye la inmunización basada en los principios ya desarrollados en el curso de la preparación del antisuero policlonal. Las demás etapas de trabajo implican la producción de células híbridas que generen clones de los anticuerpos con la misma especificidad. Su aislamiento individual es llevado a cabo utilizando los mismos métodos utilizados en la preparación del antisuero policlonal.
Se puede obtener anticuerpos policlonales a través de la inmunización activa de animales. Con tal fin, por ejemplo, se seleccionan los animales adecuados (por ejemplo, conejos) y los mismos reciben una serie de inyecciones del antígeno apropiado (una proteína del VIH). El sistema inmune de los animales genera los correspondientes anticuerpos, los cuales son extraídos de los animales de una manera conocida. Este procedimiento hace posible obtener un suero monoespecífico rico en anticuerpos.
Si se desea, se puede purificar el suero que contiene los anticuerpos, por ejemplo, mediante la utilización de cromatografía de afinidad, fraccionamiento por precipitación con sales o cromatografía de intercambio iónico. El suero purificado rico en anticuerpos resultante puede ser utilizado como material de partida para la preparación de la forma activada-potenciada de los anticuerpos. La concentración preferida de la solución inicial resultante del anticuerpo en el disolvente, preferiblemente agua o una mezcla de aguaalcohol etílico, oscila entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5,0 mg/ml.
El procedimiento que se prefiere utilizar en la preparación de cada componente del fármaco de combinación según la presente invención es utilizar la mezcla de tres diluciones en agua-alcohol de la solución matriz primaria de anticuerpos diluidos 10012 , 10030 y 10050 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones centesimales homeopáticas C12, C30 y C50, o diluidos 10012, 10030 y 100200 veces, respectivamente, lo que es equivalente a diluciones centesimales homeopáticas C12, C30 y C200. Para preparar una forma sólida de dosificación, se trata un vehículo sólido con la dilución adecuada obtenida a través del proceso homeopático. Para obtener una forma sólida de dosificación unitaria de la combinación de la invención, se impregna la masa del vehículo con cada una de las diluciones. Ambos órdenes de impregnación son adecuados para la preparación de la forma combinada de dosificación deseada.
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En una realización preferida, el material de partida para la preparación de la forma
activada potenciada que comprende la composición farmacéutica de la invención es un
anticuerpo policlonal generado en un animal contra el correspondiente antígeno, es decir,
una proteína del VIH. Para obtener la forma activada-potenciada de los anticuerpos
5 policlonales contra una proteína del VIH, se puede inyectar el antígeno deseado como
inmunógeno en un animal experimental, preferiblemente, conejos. Se pueden obtener
anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la totalidad de la molécula
de la poliproteína Gag-Pol del VIH de la siguiente secuencia:
SEQ ID NO:1
10 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg 15 10 15 Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys 16 20 25 30 Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala 15 31 35 40 45 Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile 46 50 55 60 Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 61 65 70 75 20 Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln 76 80 85 90 Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu 91 95 100 105 Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala 25 106 110 115 120 Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val 121 125 130 135 Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg 136 140 145 150 30 Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser 151 155 160 165 Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr 166 170 175 180 Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 35 181 185 190 195 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala 196 200 205 210 Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro 211 215 220 225 40 Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 226 230 235 240 Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro 241 245 250 255 Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu 45 256 260 265 270 Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile 271 275 280 285 Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe 286 290 295 300
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Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn 301 305 310 315 Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys 346 350 355 360 5 Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu 361 365 370 375 Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Ser Ala Thr 376 380 385 390 10 Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Ile Val 391 395 400 405 Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys 406 410 415 420 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly 15 421 425 430 435 His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Arg 436 440 445 450 Glu Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly Lys Ala Arg Glu Phe Ser Ser 451 455 460 465 20 Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Arg Arg Glu Leu Gln Val 466 470 475 480 Trp Gly Arg Asp Asn Asn Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg 481 485 490 495 Gln Gly Thr Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln 25 496 500 505 510 Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala 511 515 510 525 Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser 526 530 535 540 30 Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly 541 545 550 555 Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys 556 560 565 570 Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val 35 571 575 580 585 Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu 586 590 595 600 Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys 601 605 610 615 40 Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu 616 620 625 630 Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys 631 635 640 645 Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr 45 646 650 655 660 Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys 661 665 670 675 Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp 676 680 685 690 50 Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys 691 695 700 705 Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val 706 710 715 720 Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro 55 721 725 730 735
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Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val 736 740 745 750 Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser 751 755 760 765 5 Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile 766 770 775 780 Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu 781 785 790 795 Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His 10 781 785 790 795 Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys 796 800 805 810 Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys 811 815 820 825 15 Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr 826 830 835 840 Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser 841 845 850 855 Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu 20 856 860 865 870 Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu 871 875 880 885 Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro 886 890 895 900 25 Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu 901 905 910 915 Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln 916 920 925 930 Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg 30 931 935 940 945 Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln 946 950 955 960 Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys 961 965 970 975 35 Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr 976 980 985 990 Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn 991 995 1000 1005 Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro 40 1006 1010 1015 1020 Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg 1021 1025 1030 1035 Glu Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asn Arg Gly Arg 1036 1040 1045 1050 45 Gln Lys Val Val Thr Leu Thr Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu 1051 1055 1060 1065 Leu Gln Ala Ile Tyr Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val 1066 1070 1075 1080 Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala 50 1081 1085 1090 1095 Gln Pro Asp Gln Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln Ile Ile Glu 1096 1100 1105 1110 Gln Leu Ile Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala 1111 1115 1120 1125 55 His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser
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1126 1130 1135 1140 Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala 1141 1145 1150 1155 Gln Asp Glu His Glu Lys Tyr His Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala 5 1156 1160 1165 1170 Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val Ala Lys Glu Ile Val Ala 1171 1175 1180 1185 Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Met His Gly Gln 1186 1190 1195 1200 10 Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Asp Cys Thr His Leu 1201 1205 1210 1215 Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr 1216 1220 1225 1230 Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr Ala 15 1231 1235 1240 1245 Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr Ile 1246 1250 1255 1260 His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Gly Ala Thr Val Arg Ala 1261 1265 1270 1275 20 Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr 1276 1280 1285 1290 Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu 1291 1295 1300 1305 Lys Lys Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu His Leu Lys 25 1306 1310 1315 1320 Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg Lys 1321 1325 1330 1335 Gly Gly Ile Gly Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Val Asp Ile 1336 1340 1345 1350 30 Ile Ala Thr Asp Ile Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr 1351 1355 1360 1365 Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asn Pro 1366 1370 1375 1380 Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala 35 1381 1385 1390 1395 Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp Ile Lys Val Val Pro Arg Arg 1396 1400 1405 1410 Lys Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp 1411 1415 1420 1425 40 Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp Glu Asp 1426 1430 1435
Se pueden obtener anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la
molécula de la proteína P17 de la matriz (proteína P17) de la siguiente secuencia:
45 SEQ IDNO: 2
Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg 25 10 15 Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys 16 20 25 30 50 Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala 31 35 40 45
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Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile 46 50 55 60 Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu 61 65 70 75 5 Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln 76 80 85 90 Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu 91 95 100 105 Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala
10 106 110 115 120 Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val Ser Gln Asn Tyr 121 125 130 132
Se pueden obtener anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la
15 molécula de la proteína de la cápsida P24 (proteína P24) de la siguiente secuencia:
SEQ IDNO: 3
Pro Ile Val 133 135 Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg 20 136 140 145 150 Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser 151 155 160 165 Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr 166 170 175 180 25 Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 181 185 190 195 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala 196 200 205 210 Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro 30 211 215 220 225 Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 226 230 235 240 Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro 241 245 250 255 35 Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu 256 260 265 270 Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile 271 275 280 285 Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe 40 286 290 295 300 Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn 301 305 310 315 Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys 346 350 355 360
45 Lys Thr Ile 361 363
Se pueden obtener anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la molécula de la proteasa del VIH de la siguiente secuencia:
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SEQ IDNO: 4
Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg 489 490 495 Gln Gly Thr Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Val Thr Leu Trp Gln 5 496 500 505 510 Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala 511 515 510 525 Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser 526 530 535 540 10 Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly 541 545 550 555 Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys 556 560 565 570 Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val
15 571 575 580 585 Asn Ile 586 587
Se pueden obtener anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la
20 molécula de la proteína de la cápsida P24 (proteína P24) de la siguiente secuencia:
SEQ IDNO: 5
Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala 1148 1150 1155 Gln Asp Glu His Glu Lys Tyr His Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala 25 1156 1160 1165 1170 Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val Ala Lys Glu Ile Val Ala 1171 1175 1180 1185 Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Met His Gly Gln 1186 1190 1195 1200 30 Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Asp Cys Thr His Leu 1201 1205 1210 1215 Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr 1216 1220 1225 1230 Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr Ala 35 1231 1235 1240 1245 Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr Ile 1246 1250 1255 1260 His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Gly Ala Thr Val Arg Ala 1261 1265 1270 1275 40 Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr 1276 1280 1285 1290 Asn Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu 1291 1295 1300 1305 Lys Lys Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu His Leu Lys 45 1306 1310 1315 1320 Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg Lys 1321 1325 1330 1335 Gly Gly Ile Gly Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Val Asp Ile 1336 1340 1345 1350 50 Ile Ala Thr Asp Ile Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr 1351 1355 1360 1365
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Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asn Pro 1366 1370 1375 1380 Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala 1381 1385 1390 1395
5 Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp Ile Lys Val Val Pro Arg Arg 1396 1400 1405 1410 Lys Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp 1411 1415 1420 1425 Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp Glu Asp
10 1426 1430 1435
Se pueden obtener anticuerpos policlonales contra una proteína del VIH utilizando la
molécula de la transcriptasa inversa del VIH de la siguiente secuencia:
SEQ IDNO: 6
15 Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu 588 590 595 600 Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys 601 605 610 615 Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu
20 616 620 625 630 Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys 631 635 640 645 Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr 646 650 655 660
25 Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys 661 665 670 675 Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp 676 680 685 690 Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys
30 691 695 700 705 Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val 706 710 715 720 Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro 721 725 730 735
35 Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val 736 740 745 750 Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser 751 755 760 765 Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Asp Ile
40 766 770 775 780 Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu 781 785 790 795 Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln His 781 785 790 795
45 Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys 796 800 805 810 Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys 811 815 820 825 Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr
50 826 830 835 840 Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser 841 845 850 855
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Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu 856 860 865 870 Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu 871 875 880 885 5 Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro 886 890 895 900 Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu 901 905 910 915 Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln 10 916 920 925 930 Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg 931 935 940 945 Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln 946 950 955 960 15 Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys 961 965 970 975 Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr 976 980 985 990 Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn 20 991 995 1000 1005 Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro 1006 1010 1015 1020 Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg 1021 1025 1030 1035 25 Glu Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asn Arg Gly Arg 1036 1040 1045 1050 Gln Lys Val Val Thr Leu Thr Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu 1051 1055 1060 1065 Leu Gln Ala Ile Tyr Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val 30 1066 1070 1075 1080 Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala 1081 1085 1090 1095 Gln Pro Asp Gln Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln Ile Ile Glu 1096 1100 1105 1110
35 Gln Leu Ile Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala 1111 1115 1120 1125 His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser 1126 1130 1135 1140 Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu
40 1141 1145 1147
Se puede describir un procedimiento ilustrativo de la preparación de los anticuerpos
policlonales de partida contra una proteína del VIH como sigue. 7-9 días antes de tomar
las muestras de sangre, a los conejos se les administran entre 1-3 inyecciones
45 intravenosas del antígeno deseado, para incrementar el nivel de anticuerpos policlonales
en el torrente sanguíneo de los conejos. Tras la inmunización, se toman muestras de
sangre para determinar el nivel de anticuerpos. Típicamente, se alcanza el nivel máximo
de reacción inmune del antígeno soluble en un plazo de entre 40 y 60 días después de la
primera inyección del antígeno. Una vez concluido el primer ciclo de inmunización, los
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conejos son sometidos a un período de rehabilitación de 30 días, tras el cual se realiza una reinmunización con otras 1-3 inyecciones intravenosas.
Para obtener un antisuero que contiene los anticuerpos deseados, se toman muestras de sangre de los conejos inmunizados y se colocan en un tubo de centrifugación de 50 ml. Se retiran los coágulos de producto formados sobre los laterales del tubo con una espátula de madera, y se coloca una varilla en el coágulo del centro del tubo. La sangre se coloca luego en un refrigerador durante una noche a una temperatura de alrededor de 40°C. Al día siguiente, se retira el coágulo de la espátula y el líquido remanente es centrifugado durante 10 minutos a 13.000 revoluciones por minuto. El fluido sobrenadante es el antisuero objetivo. El antisuero obtenido generalmente es amarillo. Se agrega 20% de NaN3 (concentración en peso) al antisuero hasta alcanzar una concentración final de 0,02% y se le mantiene en estado congelado a una temperatura de -20°C o sin NaN3 a una temperatura de -70°C antes de utilizarlo. Para separar los anticuerpos objetivo contra la proteína del VIH del antisuero, es adecuada la siguiente secuencia de absorción en fase sólida:
Se diluyen 10 ml del antisuero de conejos dos veces con NaCl 0,15 M, después de lo cual se agregan 6,26 g de Na2SO4, se mezcla y se incuba durante 12-16 horas a 4°C. El sedimento se retira mediante centrifugación, se diluye en 10 ml de tampón de fosfato y se dializa contra el mismo tampón durante una noche a temperatura ambiente. Después de que se retira el sedimento, se aplica la solución a una columna de DEAE-celulosa equilibrada con tampón fosfato. Se determina la fracción de anticuerpos midiendo la densidad óptica del eluato a 280 nm.
Los anticuerpos en crudo aislados son purificados utilizando un método de cromatografía de afinidad fijando los anticuerpos obtenidos a la proteína del VIH localizada sobre la matriz insoluble del medio de cromatografía, con posterior elución mediante soluciones salinas acuosas concentradas.
La solución tampón resultante se utiliza como la solución inicial del proceso homeopático de dilución utilizado para preparar la forma activada potenciada de los anticuerpos. La concentración preferida de la solución matriz inicial de los anticuerpos policlonales de conejo anti-proteína del VIH purificados mediante antígeno es de 0,5 a 5,0 mg/ml, preferiblemente, de 2,0 a 3,0 mg/ml.
Se puede preparar la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra una proteína del VIH a partir de una solución inicial mediante potenciación homeopática, preferiblemente utilizando el método de disminución proporcional de la concentración por medio de
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diluciones seriadas de 1 parte de cada solución precedente (comenzando con la solución inicial) en 9 partes (para la dilución decimal) o en 99 partes (para la dilución centesimal) o en 999 partes (para la dilución milesimal) de un disolvente neutro, comenzando con una concentración de la solución inicial del anticuerpo en el disolvente, preferiblemente, agua 5 o una mezcla de agua-alcohol etílico, en el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5,0 mg/ml, acopladas a un impacto externo. Preferiblemente, el impacto externo implica múltiples agitaciones verticales (dinamización) de cada dilución. Preferiblemente, se utilizan recipientes individuales en cada dilución subsiguiente hasta alcanzar el nivel requerido de potencia, o el factor de dilución requerido. Este método
10 cuenta con amplia aceptación en la técnica de la homeopatía. Véase, por ejemplo, V. Schwabe “Homeopathic medicines”, M., 1.967, p. 14-29, incorporado por referencia en la presente memoria para los fines expuestos.
Por ejemplo, para preparar una dilución 12-centesimal (denominada C12), se diluye una parte de la solución matriz inicial de los anticuerpos contra una proteína del VIH con una 15 concentración de 3,0 mg/ml en 99 partes de un disolvente neutro acuoso o acuosoalcohólico (preferiblemente, alcohol etílico al 15%) y luego se agita verticalmente muchas veces (10 y más) para obtener la dilución centesimal 1ª (denominada C1). La 2ª dilución centesimal 2ª (C2) se prepara a partir de la dilución centesimal 1ª C1. Este procedimiento se repite 11 veces para preparar la dilución centesimal 12ª C12. Así, la dilución 20 centesimal 12ª C12 representa una solución obtenida mediante 12 diluciones seriadas de una parte de la solución matriz inicial de anticuerpos contra el interferón gamma con una concentración de 3,0 mg/ml en 99 partes de un disolvente neutro en recipientes diferentes, lo que es equivalente a la dilución homeopática centesimal C12. Se llevan a cabo procedimientos similares con el factor de dilución pertinente para obtener las 25 diluciones C30, C50 y C 200. Las diluciones intermedias se pueden probar en un modelo biológico adecuado para comprobar su actividad. La forma activada-potenciada preferida de la composición de la invención es una mezcla de diluciones C12, C30 y C50 o diluciones C12, C30 y C200. Cuando se utiliza la mezcla de diversas diluciones homeopáticas (principalmente centesimales) de la sustancia activa como componente 30 líquido biológicamente activo, cada componente de la composición (por ejemplo, C12, C30, C50, C200) se prepara de forma individual según el procedimiento anteriormente descrito que se obtiene la penúltima dilución (por ejemplo, hasta C11, C29 y C199, respectivamente) y luego se agrega una parte de cada componente en un recipiente de acuerdo con la composición de la mezcla y se mezcla con la cantidad necesaria del
35 disolvente (por ejemplo, con 97 partes en el caso de una dilución centesimal).
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Es posible utilizar la sustancia activa como una mezcla de diversas diluciones homeopáticas, por ejemplo, decimales y/o centesimales (D20, C30, C100 o C12, C30, C50 o C12, C30, C200, etc.), cuya eficiencia se determina experimentalmente evaluando la dilución en un modelo biológico adecuado, por ejemplo, en los modelos descritos en los ejemplos incluidos en la presente memoria.
En el curso de la potenciación y disminución de la concentración, se puede sustituir la agitación vertical por una exposición externa a ultrasonidos, un campo electromagnético o cualquier procedimiento similar de impacto externo aceptado en la técnica de la homeopatía.
Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención puede tener la forma de un líquido o de una forma sólida de dosificación unitaria. El vehículo líquido preferido es agua o una mezcla de agua-alcohol etílico.
Se puede preparar la forma sólida de dosificación unitaria de la composición farmacéutica de la invención impregnando un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable con la mezcla de las soluciones acuosas o acuosas-alcohólicas de la forma activada potenciada de los componentes activos. Alternativamente, el vehículo se puede impregnar de forma consecutiva con cada una de las diluciones necesarias. Ambos órdenes de impregnación son aceptables.
Preferiblemente, la composición farmacéutica en la forma sólida de dosificación unitaria se prepara a partir de gránulos del vehículo farmacéuticamente aceptable, previamente saturado con las diluciones acuosas o acuosas-alcohólicas de la forma activada potenciada de los anticuerpos contra una proteína del VIH. La forma sólida de dosificación puede ser cualquier forma conocida en la técnica farmacéutica, lo que incluye un comprimido, una cápsula, una pastilla y otras formas. Como ingredientes farmacéuticos inactivos se puede utilizar glucosa, sacarosa, maltosa, almidón, isomaltosa, isomalta y otros mono, oligo y polisacáridos utilizados en la producción de fármacos, al igual que mezclas tecnológicas de los ingredientes farmacéuticos inactivos que anteceden con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, isomalta, crospovidona, ciclamato sódico, sacarina sódica, ácido cítrico anhidro, etc.), incluidos los agentes lubricantes, disgregantes, aglutinantes y colorantes. Los vehículos preferidos son lactosa e isomalta. La forma de dosificación farmacéutica puede además incluir excipientes farmacéuticos tradicionales, por ejemplo, celulosa microcristalina, estearato de magnesio y ácido cítrico.
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Para preparar la forma sólida de uso oral, se impregnan gránulos de lactosa de 100-300 µm con soluciones acuosas o acuosas-alcohólicas de la forma activada-potenciada de los anticuerpos contra una proteína del VIH en una relación de 1 kg de la solución del anticuerpo por cada 5 ó 10 kg de lactosa (1:5 a 1:10). Para llevar a cabo la impregnación, los gránulos de lactosa son expuestos a irrigación por saturación en el lecho fluido en ebullición de una planta de lecho en ebullición (por ejemplo, “Hüttlin Pilotlab” de Hüttlin GmbH) y son posteriormente secados con un flujo de aire caliente a una temperatura inferior a 40°C. Se coloca la cantidad estimada de los gránulos secos (10 a 34 partes en peso) saturados con la forma activada potenciada de los anticuerpos en el mezclador y se mezcla con 25 a 45 partes en peso de lactosa pura “no saturada” (utilizada con el fin de disminuir los costes y simplificar y acelerar el proceso tecnológico sin disminuir la eficiencia del tratamiento), conjuntamente con 0,1 a 1 partes en peso de estearato de magnesio y 3 a 10 partes en peso de celulosa microcristalina. La masa de comprimido obtenida es uniformemente mezclada y comprimida por prensado directo en seco (por ejemplo, en una prensa de comprimidos Korsch – XL 400) para formar píldoras redondas de entre 150 y 500 mg, preferiblemente, de 300 mg. Luego de su compresión, se obtienen píldoras de 300 mg que son saturadas con una solución acuosa-alcohólica (3,06,0 mg/píldora) de la forma activada-potenciada de anticuerpos contra una proteína del VIH en forma de una mezcla de diluciones centesimales homeopáticas C12, C30 y C50 o una mezcla de diluciones centesimales homeopáticas C12, C30 y C200.
Aun cuando la invención no está limitada por una teoría específica, se cree que la forma activada potenciada de los anticuerpos aquí descrita no contiene la forma molecular del anticuerpo en una cantidad suficiente para tener una actividad biológica atribuible a esta forma molecular. La actividad biológica del fármaco de combinación (composición farmacéutica) de la invención está ampliamente demostrada en los ejemplos adjuntos.
Preferiblemente, la combinación de la invención se administra de una vez al día a cuatro veces al día, preferiblemente dos veces al día, y cada administración incluye una o dos formas unitarias combinadas de dosificación.
La invención será ahora ilustrada haciendo referencia a los ejemplos adjuntos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1.
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La evaluación de la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de los anticuerpos policlonales de conejo contra la proteína p24 de la nucleocápsida del VIH (proteína P24) (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50), se llevó a cabo usando las células mononucleares de la sangre periférica humana infectadas con la cepa VIH-LAI in vitro. Como producto de comparación se usó azidotimidina (Sigma -AZ169-100 mg, Lot 107 K1578).
Las células mononucleares de sangre periférica humana fueron aisladas de la sangre de un donante sano seronegativo por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las células se estimularon durante 3 días con 1 µg/ml de fitohemaglutinina P y 5 UI/ml de interleuquina-2 humana recombinante en medio RPMI1640 (DIFCO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (el complemento fue eliminado calentándose durante 45 minutos a 56°C), 1% de solución de antibióticos (PSN de Gibco que contiene 50 µg/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de neomicina).
A fin de evaluar la actividad antirretroviral, los productos se colocaron en un pocillo 15-30 minutos después de la infección de las células con la cepa VIH-1-LAI a una dosis de 100 TCID50 (50 µl de inóculo de la cepa VIH-1-LAI). Los fluidos sobrenatantes utilizados para evaluar el efecto de los productos sobre la inhibición de la replicación del VIH también se recogieron en el día 7 después de la infección de las células.
Antes de colocarlos en un pocillo, que contenía 150 µl de cultivo celular, la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteína p24 se diluyó con el medio RPMI1640 (DIFCO) en una dilución cuádruple (hasta obtener una dilución de ¼) hasta un volumen final de 50 µl. La azidotimidina se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) para obtener una concentración 8 nM.
La eficacia de los productos se estableció por la inhibición de la replicación del VIH que fue evaluada por la actividad de la transcriptasa inversa del VIH en el fluido sobrenadante de las células mononucleares de sangre periférica humana usando el kit VIH RT RetroSys fabricado por INNOVAGEN (Lot 10-059C). El fluido sobrenadante de las células, al cual no se le inocularon los productos de prueba o azidotimidina, se usó como control para calcular el porcentaje de inhibición de la replicación del VIH (véase la Tabla 1).
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Tabla 1.
Actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos a la proteína p24 usando células mononucleares de sangre periférica infectadas con la cepa VIH-1-LAI in vitro
Día 7 63±17
— 58±7
5 Así, este modelo experimental demostró la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteína p24 de la nucleocápsida del VIH (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50).
Ejemplo 2 (macrófagos; transcriptasa inversa; régimen de prevención)
Lista de abreviaturas:
10 -TCID50 significa 50% de Dosis Infectiva de Cultivo de Tejidos.
La evaluación de la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteína p24 de la nucleocépsida del VIH (proteína P24) (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50), se realizó usando macrófagos obtenidos de las células mononucleares de sangre periférica humana e infectadas con la
15 cepa VIH-1-Ba-L in vitro. La azidotimidina (Sigma -AZ169-100 mg, Lot 107 K1578) se usó como producto de comparación.
Los macrófagos de sangre periférica humana se obtuvieron de las células mononucleares de sangre periférica humana aisladas de la sangre de un donante sano seronegativo por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las células mononucleares 20 de sangre periférica humana se cultivaron durante 3 días en el medio RPMI1640 (DIFCO), suplementado con 10% de suero fetal de ternera (el complemento se eliminó calentando durante 45 minutos a 56°C), 1% de solución de antibióticos (PSN de Gibco que contenía 50 µg/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de neomicina), 15 ng/ml de GM-CSF (factor estimulador de colonias granulocítico
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macrofágico). Entonces las células se transfirieron a placas de cultivo (150000 células/pocillo en una placa de 48 pocillos), se cultivaron durante 7 días junto con 1 ng/ml de GM-CSF (factor estimulador de colonias granulocítico -macrofágico) y 10 ng/ml de M-CSF (factor estimulador de colonias macrofágico) de tal modo que las células se
5 diferenciaron completamente en macrófagos.
A fin de evaluar la actividad antirretroviral, se colocaron los productos en un pocillo 24 horas antes de la infección de las células con la cepa VIH-1-Ba-L a una dosis de 1000 TCID50 (100 µl de inoculo de la cepa VIH-1-Ba-L), así como en los días 3, 7, 10, 14, 17 después de la infección. Los fluidos sobrenadantes utilizados para evaluar el efecto de los
10 productos sobre la inhibición de la replicación del VIH también se recogieron en los días 3, 7, 10, 14, 17 después de la infección de las células.
Antes de colocarlos en un pocillo, que contenía 750 µl de cultivo celular, la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteína p24 se diluyó con el medio RPMI1640 (DIFCO) en una dilución cuádruple (hasta obtener una dilución de ¼) hasta un volumen final de 250 µl. La
15 azidotimidina se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) para obtener una concentración 8 nM.
La eficacia de los productos se estableció por la inhibición de la replicación del VIH que fue evaluada por la actividad de la transcriptasa inversa del VIH en el fluido sobrenadante de las células mononucleares de sangre periférica humana usando el kit VIH RT
20 RetroSys fabricado por INNOVAGEN (Lot 10-059C). El fluido sobrenadante de las células, al cual no se le inocularon los productos de prueba o azidotimidina, se usó como control para calcular el porcentaje de inhibición de la replicación del VIH (véase la Tabla 2).
Tabla 2.
25 Actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteína p24 usando macrófagos de sangre periférica humana infectada con la cepa VIH-1-Ba-L in vitro
ón de la actividad de la iptasa inversa del VIH
respecto al control)
Día 21
27±5
— 41±1
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Así, este modelo experimental demostró la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteína p24 de la nucleocápsida del VIH (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50).
Ejemplo 3.
5 La evaluación de la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteasa del VIH-1 (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50) (a la que se hará referencia de aquí en adelante como “dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1), se llevó a cabo usando células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con la cepa VIH-1-LAI in
10 vitro. La azidotimidina (Sigma -AZ169-100 mg, Lot 107 K1578) se usó como producto de comparación).
Las células mononucleares de sangre periférica humana se aislaron de la sangre de un donante sano seronegativo por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las células se estimularon durante 3 días con 1 µg/ml de fitohemaglutinina P y
15 5 UI/ml de interleuquina-2 humana recombinante en medio RPMI1640 (DIFCO), suplementado con 10% de suero fetal de ternera (el complemento se eliminó calentando durante 45 minutos a 56°C), 1% de solución de antibióticos (PSN de Gibco que contenía 50 µg/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de neomicina).
A fin de evaluar la actividad antirretroviral, se colocaron los productos en un pocillo 15-30
20 minutos después de la infección de las células con la cepa VIH-1-LAI a una dosis de 100 TCID50 (50 µl de inoculo de la cepa VIH-1-LAI). Los fluidos sobrenadantes utilizados para evaluar el efecto de los productos sobre la inhibición de la replicación del VIH también se recogieron en el día 7 después de la infección de las células.
Antes de colocarlos en un pocillo, que contenía 150 µl de cultivo celular, la dosis ultrabaja
25 de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1 se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) en una dilución cuádruple (hasta obtener una dilución de ¼) hasta un volumen final de 50 µl. La azidotimidina se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) para obtener una concentración 8 nM.
La eficacia de los productos se estableció por la inhibición de la replicación del VIH que
30 fue evaluada por la actividad de la transcriptasa inversa del VIH en el fluido sobrenadante de las células mononucleares de sangre periférica humana usando el kit VIH RT RetroSys fabricado por INNOVAGEN (Lot 10-059C). El fluido sobrenadante de las células, al cual no se le inocularon los productos de prueba o azidotimidina, se usó como
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control para calcular el porcentaje de inhibición de la replicación del VIH (véase la Tabla 3).
Tabla 3.
Actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1 usando células mononucleares de sangre periférica humana infectadas con la cepa VIH-1-LAI in vitro
Día 7 60±4
-
— 58±7
Así, este modelo experimental demostró la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteasa del VIH-1 (una mezcla de
10 diluciones homeopáticas C12+C30+C50).
Ejemplo 4 (macrófagos; transcriptasa inversa; régimen de prevención)
Lista de abreviaturas:
-TCID50 significa 50% de Dosis Infectiva de Cultivo de Tejidos.
La evaluación de la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos
15 policlonales de conejo contra la proteasa del VIH-1 (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50) (a la que se hará referencia de aquí en adelante como “dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1), se realizó usando macrófagos, obtenidos de las células mononucleares de sangre periférica humana e infectados con la cepa VIH-1-Ba-L in vitro. La azidotimidina (Sigma -AZ169-100 mg, Lot
20 107 K1578) se usó como producto de comparación.
Los macrófagos de sangre periférica humana se obtuvieron de las células mononucleares de sangre periférica humana aisladas de la sangre de un donante sano seronegativo por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Las células mononucleares de sangre periférica humana se cultivaron durante 3 días en medio RPMI1640 (DIFCO),
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suplementado con 10% de suero fetal de ternera (el complemento se eliminó calentando durante 45 minutos a 56°C), 1% de solución de antibióticos (PSN de Gibco que contenía 50 µg/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de neomicina), 15 ng/ml de GM-CSF (factor estimulador de colonias granulocítico -macrofágico). Entonces las células se transfirieron a placas de cultivo (150000 células/pocillo en una placa de 48 pocillos), se cultivaron durante 7 días junto con 1 ng/ml de GM-CSF (factor estimulador de colonias granulocítico -macrofágico) y 10 ng/ml de M-CSF (factor estimulador de colonias macrofágico) de tal modo que las células se diferenciaron completamente en macrófagos.
A fin de evaluar la actividad antirretroviral, se colocaron los productos en un pocillo 24 horas antes de la infección de las células con la cepa VIH-1-Ba-L a una dosis de 1000 TCID50 (100 µl de inoculo de la cepa VIH-1-Ba-L), así como en los días 3, 7, 10, 14, 17 después de la infección. Los fluidos sobrenadantes utilizados para evaluar el efecto de los productos sobre la inhibición de la replicación del VIH también se recogieron en los días 3, 7, 10, 14, 17 después de la infección de las células.
Antes de colocarlos en un pocillo, que contenía 750 µl de cultivo celular, la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1 se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) en una dilución cuádruple (hasta obtener una dilución de ¼) hasta un volumen final de 250 µl. La azidotimidina se diluyó con medio RPMI1640 (DIFCO) para obtener una concentración 8 nM.
La eficacia de los productos se estableció por la inhibición de la replicación del VIH que fue evaluada por la actividad de la transcriptasa inversa del VIH en el fluido sobrenadante de las células mononucleares de sangre periférica humana usando el kit VIH RT RetroSys fabricado por INNOVAGEN (Lot 10-059C). El fluido sobrenadante de las células, al cual no se le inocularon los productos de prueba o azidotimidina, se usó como control para calcular el porcentaje de inhibición de la replicación del VIH (véase la Tabla 4).
Tabla 4.
Actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos contra la proteasa del VIH-1 usando macrófagos de sangre periférica humana infectados con la cepa -1-Ba-L in vitro
ón de la actividad de la iptasa inversa del VIH respecto al control)
Día 21
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-
34±4
—
41±1
Así, este modelo experimental demostró la actividad antirretroviral de la dosis ultrabaja de anticuerpos policlonales de conejo contra la proteasa del VIH-1 (una mezcla de diluciones homeopáticas C12+C30+C50).
Lo que se reivindica es:

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composición farmacéutica que comprende una forma activada-potenciada de
    un anticuerpo contra una proteína del VIH, en la que la proteína del VIH es la proteína 5 P24 de la cápsida del VIH.
  2. 2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH está en forma de una mezcla de diluciones homeopáticas C12, C30, y C50 impregnadas sobre
    10 un vehículo sólido.
  3. 3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH está en forma de una mezcla de diluciones homeopáticas C12, C30, y C200 impregnadas
    15 sobre un vehículo sólido
  4. 4. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH es un anticuerpo monoclonal, policlonal o natural.
    20
  5. 5. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH es un anticuerpo policlonal.
    25 6. Un método para preparar la composición farmacéutica según la reivindicación 1, en el que la forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH está preparada mediante diluciones centesimales sucesivas acopladas a la agitación de cada dilución.
    30 7. El método según la reivindicación 6, en el que la composición farmacéutica según la reivindicación 1 se prepara proporcionando una una forma activada-potenciada de un anticuerpo contra la proteína P24 de la cápsida del VIH, preparada mediante dilución repetida consecutiva y agitación múltiple de cada una de las soluciones obtenidas de acuerdo con la tecnología homeopática, y luego o bien combinando las soluciones
    35 potenciadas mezclándolas, o, alternativamente, impregnando la masa de un vehículo con dicha solución combinada o con las soluciones de forma separada.
    29
    P201430954
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  6. 8.
    Uso de una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por el VIH.
  7. 9.
    El uso según la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad causada por el VIH es el SIDA.
  8. 10.
    El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que el medicamento se prepara para
    5
    10 que la composición farmacéutica sea administrada en una o dos formas unitarias de dosificación, para que cada una de las formas de dosificación sea adminstrada de una vez al día a cuatro veces al día.
    15
    30
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