CN102716117A - 柚皮素在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含黄酮类有机有效成分的医药配制品，特别是涉及柚皮素在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用。本发明所述的应用，其中体现所述用途的化合物柚皮素对视网膜光感受器细胞的光化学损伤具有保护作用，且能抗视网膜光感受器细胞的凋亡，可用于制备各种抗视网膜光感受器细胞凋亡药物，以利于提高人类的生存质量。

Description

柚皮素在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医用的配制品，具体涉及含黄酮类有机有效成分的医药配制品。

技术背景

光感受器细胞指的是能感受光刺激，并产生冲动传向中枢神经的感觉细胞。人类的光感受器细胞主要有两种，分别是视杆细胞和视锥细胞。如果光感受器细胞凋亡则难以再生和修复，将导致多种难治性的致盲疾病，如视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）和视网膜脱离等。

光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病可利用光动力疗法、玻璃体腔注射各种抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的药物等抑制新生血管形成、玻璃体视网膜手术等方法进行治疗。这些方法主要用于疾病的晚期，光动力疗法和玻璃体腔注射各种抗VEGF的药物可抑制病情进一步发展，但是操作复杂，需要定期到医院重复治疗。玻璃体视网膜手术使得各种复杂的视网膜脱离和DR得到了解剖上的完全复位，但由于疾病所致的光感受器细胞的凋亡尚无法逆转，从而也不能从根本上恢复患者的视功能。此外，还有基因治疗和视网膜移植术，这给光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病的治疗带来了新的希望，但是这些方法处于试验阶段，仍不成熟。

目前，延缓光感受器细胞凋亡的药物主要是与光感受器细胞代谢相关的物质，如：（1）维生素A、牛磺酸和二十二碳六烯酸（DHA），是目前用于干预RP异常生化代谢最常用的物质，这些物质在视网膜内含量高，参与光感受器细胞正常结构和功能维持及正常光电转化反应。研究发现大剂量的补充这些物质能够延缓RP等视网膜疾病的病程进展；2）神经营养因子如FGF、TGF等均能延缓光感受器细胞的凋亡，但作用持续时间不同，而且目前也是仅限动物试验阶段；（3）钙离子拮抗剂可以延缓rd鼠光感受器细胞凋亡的发展，但钙拮抗剂用于RP治疗的安全剂量如何确定，长期应用是否会对机体产生不良后果等，均待进一步研究。因此，对于光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病，急待一种安全有效的药物出现。

柚皮素的化学名称为4’,5,7-三羟基黄酮（naringenin，4’,5,7-trihydroxyflavanone），化学结构如下式（Ⅰ）所示。柚皮素是一种黄酮类化合物，它广泛存在于葡萄和西红柿等植物中。柚皮素毒性很小，实验浓度下均无细胞毒性，长期毒理试验证明药物无毒性。柚皮素药理作用广泛，如抗肿瘤、抗炎、止咳化痰和降糖等等。

现代药理作用研究表明，柚皮素在眼科方面具有以下功效：1）增加眼部血流量。50μl浓度为1%的柚皮素滴眼液能显著增加新西兰兔眼球的脉络膜、虹膜和睫状体的血流量。由于眼部血流量和视网膜功能密切相关，因此柚皮素增加眼部血流量的作用可能有助于改善眼球缺血缺氧所造成的视网膜损伤和新生血管的生成。2）逆转眼部缺血造成的视网膜功能降低。阻断中央视网膜和后睫状体动脉30min引起视网膜缺血引起闪光视网膜电流图b波消失。30min新让视网膜得到血液供应，则闪光视网膜电流图b波将缓慢恢复，4小时后b波的振幅可恢复到正常值的30%左右。给大鼠预先腹腔注射柚皮素（10mg/kg）能显著加快闪光视网膜电流图b波的恢复，并且4小时后使闪光视网膜电流图b值恢复到正常值的55%。这个结果表明柚皮素能有效改善视网膜缺血引起的视网膜功能损伤。3）抑制脉络膜新生血管的生成。GeorgeChiou教授发现，浓度为1%的柚皮素滴眼液能够显著降低激光诱发大鼠眼脉络膜新生血管的形成。与模型对照组相比，柚皮素滴眼后2周和4周（3次/日）对脉络膜新生血管形成的抑制率高达47%和51%。4）柚皮素具有抗氧化作用，能逆转氧化剂所引起的脐静脉内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的氧化损伤。5）眼部抗炎作用。LPS诱发Lewis大鼠葡萄膜炎，使房水中PGE₂、NO和细胞数量生成增多。玻璃体内注射0.4、4和40μg/kg体重的柚皮素可剂量依赖性抑制PGE₂和NO的生成，给药剂量为40μg/kg柚皮素也能减少进入房水中的细胞数量达38%。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供柚皮素的新用途，即在制药中的新应用。

现代医学研究表明，光感受器细胞凋亡是多种难治性的致盲疾病如RP、DR和视网膜脱离等的主要机制。基于上述思想，本发明人对柚皮素进行大量的研究发现，柚皮素可减轻N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）对大鼠造成的光感受器细胞的损伤，显著降低MNU所造成的视网膜光感受器细胞的凋亡。

因此，上述在制药中的新应用即为，柚皮素在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用。

上述应用中，所述的药物由柚皮素和医学上可接受的辅料组成，其中，所述的柚皮素在药物中的质量百分含量为0.5%～70%。

上述应用中，所述的药物可以是药学上常用剂型，如眼部外用制剂或口服制剂。

本发明所述的柚皮素是制药领域采用化合物，国内有很多厂商生产，如江苏恒远生物科技有限公司、上海微晶生物技术有限公司等。

本发明所述的应用，其中体现所述用途的化合物柚皮素对视网膜光感受器细胞的光化学损伤具有保护作用，且能抗视网膜光感受器细胞的凋亡，可用于制备各种抗视网膜光感受器细胞凋亡药物，以利于提高人类的生存质量。

此外，体现本发明所述用途的化合物柚皮素的分子小，不仅易被机体吸收，而且可透过角膜，特别适合开发眼部给药的新药，如滴眼液，市场巨大。

附图说明

图1为大鼠闪光视网膜电流图（FERG），其中，A图为MNU造模1天检测到的每组中随机一只动物左眼FERG，B图为MNU造模7天检测到的每组中随机一只动物左眼FERG。

图2为大鼠视网膜振荡电位图（OPs），其中，A图为MNU造模1天检测到的每组中随机一只动物左眼OPs，B图为MNU造模7天检测到的每组中随机一只动物左眼OPs。

图3为MNU造模14天的大鼠视网膜组织放大400倍的苏木精-伊红染色图。

图4为大鼠闪光视网膜电流图（FERG），其中，A图为MNU造模1天检测到的每组中随机一只动物左眼FERG，B图为MNU造模7天检测到的每组中随机一只动物左眼FERG。

图5为大鼠视网膜振荡电位图（OPs），其中，A图为MNU造模1天检测到的每组中随机一只动物左眼OPs，B图为MNU造模7天检测到的每组中随机一只动物左眼OPs。

图6为MNU造模14天的大鼠视网膜组织放大400倍的苏木精-伊红染色图。

具体实施方式

实施例1：（滴眼液）

1、取400ml注射用水，搅拌下加入10g聚卡波菲，溶胀2h以上，用浓度为2mol/L的NaOH溶液调pH值至6.0-6.5，热压灭菌消毒，作为溶液Ⅰ备用。

2、取400ml注射用水，加入羟丙基-β-环糊精150g，搅拌溶解，加入柚皮素10g超声2h溶解；然后加入2g泊洛沙姆407，超声0.5h溶解；加入1g依地酸二钠、2g氯化钠和0.1g苯扎氯铵，搅拌溶解，作为溶液Ⅱ备用；

3、不断搅拌下将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合均匀，加入注射用水定容至1000ml，最后用过滤除菌的浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.0-7.0，充分搅拌均匀并灌装100支。每毫升含有10mg柚皮素。

4、用法用量：每次一滴，每天三次。10-20天为一个疗程。

实施例2：（片剂）

1、制备片芯：将75g柚皮素和23g淀粉过80目筛，混匀，加入适量浓度为5%PVP K30水溶液制成软材，用16目筛制粒，置于60℃-70℃干燥后用16目筛整粒，加入羧甲基淀粉钠2g和硬脂酸镁0.5g，混匀后压制成1000片，每片含柚皮素75mg。

2、制备包衣液：取10g浓度为6％的HPMC乙醇液、0.20g吐温80、0.30g聚乙二醇6000和0.50g滑石粉，混匀；

3、包衣：将片芯放入包衣锅内，喷洒包衣液，控制包衣增重为5%；

4、用法用量：每次2-8片，每天1-3次。10-20天一个疗程。

实施例3：（口服混悬剂）

1、取5g柚皮素、200ml甘油和5g吐温80置于研钵中研磨成均匀糊状，制备出柚皮素糊状物备用；

2、将苯甲酸钠5g、柠檬酸20g、阿斯巴甜0.5g和草莓香精0.5g溶于适量纯净水中，制备出溶液Ⅰ；

3、取黄原胶20g用适量纯化水制成胶浆，边搅拌边加入柚皮素糊状物中，制备出溶液Ⅱ；

4、将溶液Ⅰ在搅拌下加入溶液Ⅱ中，搅匀，加纯净水至1000ml，搅匀即得。每毫升口服混悬剂含有5mg柚皮素。

5、用法用量：每次5-40ml，每天三次。10-20天为一个疗程。

实施例4：（口服混悬剂）

1、取10g柚皮素、200ml甘油和5g吐温80置于研钵中研磨成均匀糊状，制备出柚皮素糊状物备用；

2、将苯甲酸钠5g、柠檬酸20g、阿斯巴甜0.5g和草莓香精0.5g溶于适量纯净水中，制备出溶液Ⅰ；

3、取黄原胶20g用适量纯化水制成胶浆，搅拌加入柚皮素糊状物中，制备出溶液Ⅱ；

4、将溶液Ⅰ在搅拌下加入溶液Ⅱ中，搅匀，加纯净水至1000ml，搅匀即得。每毫升口服混悬剂含有10mg柚皮素。

5、用法用量：每次5-40ml，每天三次。10-20天为一个疗程。

实施例5：（口服混悬剂）

1、取20g柚皮素、200ml甘油和5g吐温80置于研钵中研磨成均匀糊状，制备出柚皮素糊状物备用；

2、将苯甲酸钠5g、柠檬酸20g、阿斯巴甜0.5g和草莓香精0.5g溶于适量纯净水中，制备出溶液Ⅰ；

3、黄原胶20g用适量纯化水制成胶浆，搅拌加入柚皮素糊状物中，制备出溶液Ⅱ；

4、将溶液Ⅰ在搅拌下加入溶液Ⅱ中，搅匀，加纯净水至1000ml，搅匀即得。每毫升口服混悬剂含有20mg柚皮素。

5、用法用量：每次5-40ml，每天三次。10-20天为一个疗程。

实施例6：柚皮素滴眼液对MNU诱导大鼠光感受器细胞凋亡的作用

1、试剂

柚皮素滴眼液：实施例1所制备的滴眼液；

溶剂对照品：制备工艺同实施例1，但不含柚皮素；

N-甲基-N亚硝脲（MNU）：sigma，N1517-1g，批号100M1436V；

速眠新注射液：批号：20110301，吉林省敦化市圣达动物药品有限公司；

复方托品卡胺滴眼液：批号：110901，沈阳兴齐制药有限公司；

盐酸丁卡因滴眼液：批号：110926，中山大学附属眼科医院；

1%羧丙甲纤维素滴眼液：批号：110912，中山大学附属眼科医院；

0.9%氯化钠注射液：规格250ml/瓶，批号：1104246A，佛山双鹤药业有限责任公司。

2、仪器：视觉电生理检查仪，型号为APS-2000AER，重庆康华瑞明科技有限公司。

3、实验动物：32只雄性SD大鼠，购买时体重为160～170g，造模时体重为200～210g，购于广州中医药大学实验动物中心。

3.1饲养环境：动物用不锈钢笼饲养，每笼8只，饲养于正常环境中，25-30℃，湿度60-80%。食盒上贴上标签，标签内容包括试验名称、性别、专题负责人、接收日期等相关内容。

3.2饲养条件：对大鼠的饲喂遵循“定时定量”的原则，其中，每只大鼠每日饲料消耗量为25g左右，每天分两次饲喂。大鼠饲料由广州中医药大学实验动物中心提供。饮用水为自来水，每天更换。

4、实验步骤

4.1动物分组

检疫结束后，用视觉电生理检查仪进行FERG检查，根据每只动物左右眼FERG b波振幅的平均值大小将动物随机分为4组，分别是正常对照组、模型对照组、柚皮素滴眼液预防组和柚皮素滴眼液治疗组，每组8只大鼠。

4.2给药剂量设计：实施例1所制备的滴眼液（每毫升含有10mg柚皮素），每次左右侧眼球各一滴，每日3次。

4.3造模用MNU配制：用分析天平精密称取300mg MNU，用30ml生理盐水溶解，涡旋仪涡旋1min，配成10mg/ml的MNU溶液。

4.4造模：模型对照组、柚皮素滴眼液预防组和柚皮素滴眼液治疗组分别单次快速腹腔注射MNU溶液，MNU的造模剂量为60mg/kg。

4.5给药方法

正常对照组：完全空白，不用MNU造模，也不用柚皮素滴眼液或溶剂对照品滴眼。

柚皮素滴眼液预防组：造模前，用柚皮素滴眼液滴眼给药，每次左右侧眼球各一滴，每日3次，连续1周。造模当天，柚皮素滴眼30min后进行MNU造模。MNU造模后照常给药，每日3次，连续给药2周。

柚皮素滴眼液治疗组：造模后12h第一次给药，每次左右侧眼球各一滴，每日3次，连续给药2周。

模型对照组：造模前，用不含柚皮素的溶剂对照品滴眼，每日3次，每次左右侧眼球各一滴，连续给1周。造模当天，滴眼30min后进行MNU造模。MNU造模后照常给药，每日3次，连续给2周。

4.6指标测定

4.6.1视网膜功能检查（FERG、OPs）

分别在造模后1天和造模后7天用视觉电生理检查仪检查视网膜功能，实验前将大鼠暗适应过夜，腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉（3%，0.6ml/kg），后肢外侧肌肉注射赛拉嗪注射液肌松（0.188ml/kg），再滴复方托品卡胺滴眼液散瞳（15min内散瞳2次，2次间隔时间为5min），速眠新注射液麻醉30min后用倍诺喜滴眼液局部麻醉角膜。视觉电生理检查仪的电极放置为：负极参考电极穿刺脸颊皮肤，地线电极穿刺大鼠尾巴，正极检测电极与角膜接触。正极放置好后滴羧丙甲纤维素滴眼液以保证电极与角膜接触良好。

FERG检测的主要参数为：闪光强度为0.006325cd*s/m2，低通频率为300Hz，高通频率为0.1Hz，刺激次数5次，刺激频率为0.05Hz。

OPs检测的主要参数为：闪光强度为0.006325cd*s/m2，低通频率为200Hz，高通频率为50Hz，刺激次数10次，刺激频率为0.05Hz。

4.6.2大鼠视网膜组织病理学检查：造模14天后，采用颈椎脱臼的方法处死大鼠，摘取大鼠左右眼球，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。每组随机取6个眼球进行常规石蜡制片，切片厚度约3-4μm，苏木精-伊红染色法染色，用光学显微镜（OLYMPUS）观察视网膜的损伤程度，并拍照。根据表1对视网膜光感受器细胞损伤进行评分。

表1MNU诱导视网膜光感受器细胞损伤评分表

5、结果处理：数据以

表示，用SPSS17.0版软件中的ANOVA方法进行统计学比较。P≤0.05者认为有显著性差异。

6、试验结果

6.1柚皮素滴眼液对大鼠视网膜功能的影响

图1为视觉电生理检查仪检测到的大鼠闪光视网膜电流图（FERG），图中a波为FERG的第一个波谷，反映视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞的电活动；b波为第五个波峰，起源于视网膜内核层，与视网膜双极细胞和müler细胞的电活动相关。横坐标表示潜伏期，反映a波和b波出现的时间，相应的细胞结构不完整则潜伏期延长；纵坐标表示振幅，a波的振幅为基础值到a波波谷的高度，b波振幅为a波波谷到b波波峰之间的高度。振幅反映a波和b波的相应细胞的功能大小，振幅大则细胞结构完整和功能强。与正常对照组比较，腹腔注射MNU的模型对照组的大鼠FERG a波和b波振幅降低（P≤0.001，图1和表2），潜伏期延长（P≤0.001，图1和表3），提示MNU造模后引发视网膜功能损伤。与模型对照组比较，柚皮素滴眼液预防组和治疗组的a波和b波潜伏期均显著缩短（P≤0.05，图1和表3），a波和b波振幅均显著增大（P≤0.05，图1和表2）。结果提示柚皮素滴眼液预防给药和治疗给药均能改善MNU对大鼠造成的大鼠光感受器细胞的损伤。

图2为视觉电生理检查仪检测到的大鼠视网膜振荡电位图（OPs）。OPs起源于视网膜无长突细胞和视网膜神经节细胞突触电位，是评价视网膜功能，尤其是内层血循环的一种客观有效的方法。OP₁和OP₂主要反映视椎细胞的功能，而OP₃和OP₄主要反映视杆细胞的功能。视网膜光感受器细胞正常的大鼠的OP₂为OPs图中最大的波峰，则OP₂相连的前一个波峰为OP₁，OP₂相连的后两个波峰分别为OP₃和OP₄。横坐标表示各波出现的潜伏期，潜伏期延长反映光感受器细胞结果不完整和有损伤；纵坐标表示振幅，各波的振幅是各波前一个波谷与该波波峰之间的高度。OPs的振幅反映各波相对应的光感受器细胞的功能，振幅大说明细胞结构完整和功能强。与正常对照组比较，模型对照组大鼠的OP₁、OP₂、OP₃、OP₄和OPS（振荡波总和）的振幅均显著降低（P≤0.05，图2和表4），而4个振荡波的潜伏期则延长（P≤0.05，图2和表5），提示MNU造模引起光感受器细胞（视椎细胞和视杆细胞）损伤。与模型对照组比较，柚皮素滴眼液预防组和治疗组能显著延长OP₁、OP₂、OP₃、OP₄和OPS的振幅（P≤0.05，图2和表4），同时缩短各振荡波对潜伏期（P≤0.05，图2和表5）。结果提示柚皮素滴眼液预防给药和治疗给药均能改善MNU对大鼠造成的大鼠光感受器细胞的损伤。

表2柚皮素滴眼液对FERG振幅的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表3柚皮素滴眼液对FERG潜伏期的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表4柚皮素滴眼液对OPs振幅的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表5柚皮素滴眼液对OPs潜伏期的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

6.2柚皮素滴眼液对大鼠视网膜组织病理的影响

如图3所示，视网膜组织病理结果显示，与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠的视网膜明显变薄，视神经细胞及神经纤维均明显萎缩，外核层（由光感受器细胞核组成）仅部分区域见单层细胞，视神经萎缩消失。而柚皮素预防组及治疗组则仅部分视网膜轻度变薄，散在外核层变性。根据表1的评分表得知，柚皮素滴眼液预防给药和治疗给药均能够显著减少MNU造成的视网膜外核层（由光感受器细胞核组成）损伤,使损伤范围显著缩小（表6）。结果提示柚皮素滴眼液能够显著防治MNU所造成的视网膜光感受器细胞凋亡，从而保护视网膜的功能。

表6柚皮素滴眼液对视网膜组织病理的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

实施例7：柚皮素口服混悬剂对MNU诱导大鼠光感受器细胞损伤的作用

1、实验试剂：实施例3、4和5所制备的0.5%、1.0%和2.0%三个浓度的柚皮素口服混悬剂；溶剂对照品为制备方法同实施例3，但是不含有柚皮素；其余试剂同实施例6。

2、实验仪器：视觉电生理检查仪，型号为APS-2000AER，重庆康华瑞明科技有限公司。

3、实验动物：40只雄性SD大鼠，购买时体重为160～170g，购于广州中医药大学实验动物中心，MNU造模时体重为200～210g。

4、动物饲养及饲养条件

4.1饲养环境：动物用不锈钢笼饲养，每笼8只，饲养于正常环境中，25-30℃，湿度60-80%。食盒上贴上标签，标签内容包括试验名称、性别、专题负责人、接收日期等相关内容。

4.2饲养条件：对大鼠的饲喂遵循“定时定量”的原则，每只大鼠每日饲料消耗量为25g左右，每天分两次饲喂。大鼠饲料由广州中医药大学实验动物中心提供。饮用水为自来水，每天更换。

5、实验步骤

5.1动物分组：检疫结束后，用视觉电生理检查仪进行FERG检测，根据每只动物左右眼FERG b波振幅的平均值大小将动物随机分为5组，分别为正常对照组、模型对照组、柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组，每组8只。

5.2给药剂量设计

柚皮素口服混悬剂低剂量组：25mg/kg体重大鼠，灌胃给予实施例3所制备的柚皮素口服混悬剂，给药体积为5ml/kg体重，每日一次。

柚皮素口服混悬剂中剂量组：50mg/kg体重大鼠，灌胃给予实施例4所制备的柚皮素口服混悬剂，给药体积为5ml/kg体重，每日一次。

柚皮素口服混悬剂高剂量组：100mg/kg体重大鼠，灌胃给予实施例5所制备的柚皮素口服混悬剂，给药体积为5ml/kg体重，每日一次。

5.3造模用MNU配制：用分析天平精密称取300mg MNU，加入30ml生理盐水溶解，涡旋仪涡旋1min，配成10mg/ml的MNU溶液。

5.4造模：模型对照组、柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组分别单次快速腹腔注射MNU溶液，MNU的造模的剂量为60mg/kg。

5.5给药方法

正常对照组：完全空白，不用MNU造模，也不用柚皮素滴眼液或溶剂对照品滴眼；

柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组：造模前连续灌胃给药1周，每日一次。造模当天，柚皮素口服混悬剂灌胃45min后进行MNU造模。MNU造模后继续灌胃给药，每日1次，连续给药2周。

模型对照组：灌胃给予等体积的溶剂对照品，每天给药一次，连续给1周。造模当天，灌胃给予溶剂对照品后45min再进行MUN造模。MNU造模后继续灌胃给予溶剂对照品，每天1次，连续给药2周。

5.6指标测定

5.6.1体重测定：造模前7天、造模当天、造模后1天、造模后7天对大鼠进行称重。

5.6.2视觉电生理检查仪检测视网膜功能，方法同实施例6。

5.6.3视网膜组织病理学检查，方法同实施例6。

6、结果处理：数据以表示，用SPSS17.0版软件中的ANOVA方法进行统计学比较。

P≤0.05者认为有显著性差异。

7、试验结果

7.1柚皮素口服混悬剂对大鼠体重的影响

如表7所示，造模前7天和造模当天柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组动物与正常对照组比较和模型对照组比较均无统计学差异（P≥0.05）。MNU造模后1天和7天，与正常对照组比较，模型对照组体重明显下降（P≤0.001）。与模型组比，柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组体重均显著增加（P≤0.05）。结果提示柚皮素口服混悬剂能逆转MNU对大鼠造成的体重下降。

表7柚皮素口服混悬剂对大鼠体重的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

7.2柚皮素口服混悬剂对大鼠视网膜功能的影响

图4为视觉电生理检查仪检测到的大鼠闪光视网膜电流图（FERG），a波反映视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞的电活动，b波起源于视网膜内核层，与视网膜双极细胞和müler细胞的电活动相关。横坐标表示潜伏期，反映a波和b波出现的时间，细胞结构完整则潜伏期短；纵坐标表示振幅，反映a波和b波的相应的细胞的功能，细胞结构完整则功能强和振幅大。如图4所示，腹腔注射MNU造模后造成大鼠FERG a波和b波振幅降低，潜伏期延长。与正常对照组比较，模型对照组的潜伏期显著延长（P≤0.001，图4和表9），振幅显著降低（P≤0.001，图4和表8），结果提示MNU造成了大鼠视网膜光感受器细胞的损伤。与模型对照组比较，造模后1天和7天，柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组的a波和b波振幅均显著增大（P≤0.05，图4和表8），潜伏期缩短（P≤0.05，图4和表9）。结果提示柚皮素口服给药能改善MNU对大鼠造成的大鼠视网膜光感受器细胞的损伤。

图5为视觉电生理检查仪检测到的大鼠视网膜振荡电位图（OPs）。OPs起源于视网膜无长突细胞和视网膜神经节细胞突触电位，是评价视网膜功能，尤其是内层血循环的一种客观有效的方法。OP₁和OP₂主要反映视椎细胞的功能，而OP₃和OP₄主要反映视杆细胞的功能。横坐标表示各波出现的潜伏期，潜伏期延长反映光感受器细胞结果不完整和有损伤；纵坐标表示各波的振幅，反映各波对应的光感受器细胞的功能，振幅减小说明细胞结构不完整和功能受损。与正常对照组比较，模型对照组大鼠的OP₁、OP₂、OP₃、OP₄和OPS（振荡波总和）的振幅均发生显著降低（P≤0.05，图5和表10），而4个振荡波的潜伏期则延长（P≤0.05，图5和表11），结果提示MNU造成了大鼠视网膜光感受器细胞的损伤。与模型对照组比较，造模后1天和7天，柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组均能显著升高振荡波的振幅（P≤0.05，图5和表10），同时缩短潜伏期（P≤0.05，图5和表11）。结果提示柚皮素口服给药能改善MNU对大鼠造成的大鼠视网膜光感受器细胞的损伤。

表8柚皮素口服混悬剂对FERG振幅的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表9柚皮素口服混悬剂对FERG潜伏期的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表10柚皮素口服混悬剂对OPs振幅的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

表11柚皮素口服混悬剂对OPs潜伏期的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

6.3柚皮素口服混悬剂对大鼠视网膜组织病理的影响

如图6所示，视网膜组织病理结果显示，与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠的视网膜明显变薄，视神经细胞及神经纤维均明显萎缩，外核层（由光感受器细胞核组成）全层受损伤，仅部分区域见单层细胞，视神经萎缩消失。而柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组仅部分视网膜轻度变薄，散在外核层变性。根据表1的评分表得知，柚皮素口服混悬剂低、中、高剂量组均能够显著减少MNU造成的视网膜外核层（由光感受器细胞核组成）损伤,使损伤范围明显缩小（表12）。结果提示柚皮素经口给药能够显著改善MNU所造成的视网膜光感受器细胞凋亡。

表12柚皮素口服混悬剂对视网膜组织病理的影响

与正常对照组比：^*P≤0.05,^**P≤0.01，^***P≤0.001；与模型对照组比：^aP≤0.05,^bP≤0.01，^cP≤0.001。

Claims (4)

1.柚皮素在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由柚皮素和医学上可接受的辅料组成。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的柚皮素在药物中的质量百分含量为0.5%～70%。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述药物是药学上常用的滴眼液或口服制剂。

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