CN102712603B - 放射性碘标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用放射性碘来标记目的生物学靶向分子(BTM)的新方法。亦提供用所述方法制备的新型放射性碘标记的BTM，以及包含所述放射性碘标记的BTM的放射性药物组合物。本发明亦提供可用于所述方法的放射性碘标记的中间体，以及用所述放射性碘标记的BTM在体内成像的方法。

Description

放射性碘标记方法
发明领域
本发明提供用放射性碘来标记目的生物学靶向分子(BTM)的新方法。亦提供用所述方法制备的新型放射性碘标记的BTM，以及包含所述放射性碘标记的BTM的放射性药物组合物。本发明亦提供可用于所述方法的放射性碘标记的中间体，以及用所述放射性碘标记的BTM在体内成像的方法。
发明背景
已知将放射性卤素并入有机分子的方法[Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]。对于123I-标记的放射性药物的情况，Eersels等[J.Lab.Comp.Radiopharm.，48，241-257(2005)]比较了4种主要的合成途径：
(i)氧化性放射性碘标记；
(ii)亲核性同位素交换；
(iii)亲核性非-同位素交换；
(iv)亲电子标记。
途径(iv)通常涉及使用有机金属前体，例如三烷基锡、三烷基甲硅烷基或有机汞或有机铊衍生物。其中，认为放射性碘去锡化(radioiododestannylation)途径成为优选的亲电子标记方法，因为在室温下有区域专一性的放射性碘标记的可能性。Eersels等推断没有可选择的放射性碘标记方法。
Ali等[Synthesis，423-445(1996)]综述了有机锡中间体在放射性药物合成中的用途。Kabalka等大量发表了关于利用有机硼烷前体以允许放射性同位素和放射性卤素标记[参见例如J.Lab.Comp.Radiopharm.，50，446-447和888-894(2007)]。
Nwe等[CancerBiother.Radiopharm.，24(3)，289-302(2009)]综述了“点击化学(clickchemistry)”在生物医学研究(包括放射化学)中的应用。如其中所指出，主要兴趣一直在PET放射性同位素18F(其次为11C)，加上适于SPECT成像的射电金属例如99mTc或111In的“点击螯合(clicktochelate)”方法。Li等[Bioconj.Chem.，18(6)，1987-1994(2007)]和Hausner等[J.Med.Chem.，51(19)，5901-5904(2008)]报道了18F点击-标记靶向肽，得到并入了18F-氟烷基-取代的三唑的产物。
WO2006/067376公开了用于标记载体的方法，所述方法包括在Cu(I)催化剂存在下，将式(I)化合物与式(II)化合物反应：
R*-L2-N3(II)
或
式(III)化合物与式(IV)化合物反应，以分别得到式(V)或(VI)缀合物
其中：
L1、L2、L3和L4各自为接头基团；
R*为包含放射性核的报告部分；
其中L1、L2、L3、L4和R*如上所定义。
WO2006/067376的R*为报告部分，其包含放射性核，例如正电子发射放射性核。认为适于此目的的正电子发射放射性核包括11C、18F、75Br、76Br、124I、82Rb、68Ga、64Cu和62Cu，其中优选11C和18。认为其它有用的放射性核包括123I、125I、131I、211At、99mTc和111In。
WO2007/148089公开了用于放射性标记载体的方法，所述方法包括在Cu(I)催化剂存在下，将式(I)化合物与式(II)化合物反应：
R*-L2-C≡N+-O-(II)
或式(III)化合物与式(IV)化合物反应，以分别得到式(V)或(VI)缀合物：
其中：
L1、L2、L3和L4各自为接头基团；
R*为包含放射性核的报告部分；
在WO2006/067376和WO2007/148089二者中，说明了将金属放射性核素适宜地并入到螯合剂中，例如，通过本领域技术人员已知方法直接并入。WO2006/067376和WO2007/148089二者都没有公开任何特别用于点击放射性碘标记的方法-特别是式(I)-(IV)化合物的哪种组合与接头基团L1、L2、L3、L4的哪种组合以及哪种类型的R*基团将是合适的。另外，WO2006/067376集中于18F，氟乙炔不会是用于放射性标记的有吸引力的中间体，因为其在-80℃沸腾，并且据报道其在液态不稳定易爆炸[Middleton，J.Am.Chem.Soc.，81，803-804(1959)]。
WO2006/116629(SiemensMedicalsolutongsUSA，Inc.)公开了制备对靶生物大分子具有亲和力的放射性标记的配体或底物的方法，所述方法包括：
(a)将包含以下的第一化合物与放射性试剂在足以用放射性试剂的放射性组分置换离去基团的条件下反应，以形成第一放射性化合物
(i)第一分子结构；
(ii)离去基团；
(iii)能够参与点击化学反应的第一官能团；和任选
(iv)所述第一官能团和所述分子结构之间的接头；
(b)提供第二化合物，其包含
(i)第二分子结构；
(ii)能够参与与第一官能团的点击化学反应的第二互补官能团，其中所述第二化合物任选包含所述第二化合物和所述第二官能团之间的接头；
(c)将所述第一放射性化合物的第一官能团与所述第二化合物的互补官能团通过点击化学反应，以形成放射性配体或底物；和
(d)分离所述放射性配体或底物。
WO2006/116629教导其中适用于用以下放射性同位素的方法：124I、18F、11C、13N和15O，且优选的放射性同位素为18F、11C、123I、124I、127I、131I、76Br、64Cu、99mTc、90Y、67Ga、51Cr、192Ir、99Mo、153Sm和201Tl。WO2006/116629教导可采用的其它放射性同位素包括：72As、74As、75Br、55Co、61Cu、67Cu、68Ga、68Ge、125I、132I、111In、52Mn、203Pb和97Ru。然而，WO2006/116629未提供任何关于如何将所述方法应用于放射性碘标记生物学分子的具体教导。
因此，仍需要放射性碘标记的备选方法。
发明内容
本发明提供用于放射性碘标记生物学靶向分子(BTM)的方法，所述方法使用点击放射性碘标记。所述方法具有的优势是其可在温和条件下实施并因此与各种各样的生物学分子相容一所述生物学分子可能包括这样的分子：其中由于在放射性碘标记反应条件下BTM不稳定致使用常规直接放射性碘标记方法可能不可行的分子。所述敏感性实例包括对常规放射性碘标记所必需的氧化条件不相容或不稳定。本方法提供放射性碘标记方法，其可在非-氧化条件下实施并因此对于对氧化易感的BTM的标记特别有利。
所述方法提供其中放射性碘直接与三唑或异唑杂芳环键合的产物。因此预期放射性碘标记的产物对于体内代谢脱碘表现出良好的稳定性，由此导致胃和/或甲状腺不必要地吸收放射性碘。因此，所述产物适合用作体内成像的放射性药物，这是重要的优势。
点击放射性碘标记方法可容易地适于用自动合成仪来使用。在该方面，可有利地利用所使用碘乙炔(H-≡-I)的挥发性(预计在大约1个大气压力为32℃但报告为60-80℃)以允使在放射性标记之前容易地蒸馏活性放射性碘物质，使得产物的放射化学纯度(RCP)最大化。这使得对于产物的进一步纯化过程(例如通过色谱法)的需要最小化。其亦与常规放射性碘标记方法形成对比，在常规放射性碘标记方法中，认为含有挥发性放射性碘的物质(例如分子碘I2)是不合乎需要的，这是由于放射性和/或辐射剂量丧失的风险增加。
发明详述
在第一方面，本发明提供放射性碘标记生物学靶向部分的方法，所述方法包括：
(i)提供式(Ia)或(Ib)化合物：
(ii)将所述式(Ia)或(Ib)化合物与式(II)化合物在点击环加成催化剂存在下反应，通过点击环加成分别得到式(IIIa)或(IIIb)缀合物：
其中：
I*为碘放射性同位素；
L1为可存在或不存在的接头基团；
BTM为生物学靶向部分。
术语“放射性碘标记”具有其常规含义，即其中用于放射性标记的放射性同位素为碘放射性同位素的放射性标记过程。
当不存在接头基团时，意指式(Ia)叠氮基或式(Ib)氧化腈官能团直接与BTM键合。
术语“生物学靶向部分”(BTM)意指给予后在哺乳动物身体体内特定位点选择性吸收或定位的化合物。所述位点可例如牵涉特定疾病状态或表明器官或代谢过程是如何发挥功能的。
术语碘放射性同位素具有其常规含义，即具有放射性的元素碘的同位素。合适的所述放射性同位素包括：123I、124I、125I和131I。当BTM用131I标记时，可将产物用作体内治疗应用的放射性药物，所述体内治疗应用例如当BTM为抗体或抗体片段时的放射性免疫疗法。
术语“点击环加成催化剂(clickcycloadditioncatalyst)”，意指已知催化第一方面的点击(炔加叠氮化物)或点击(炔加异腈氧化物)环加成反应的催化剂。本领域已知用于点击环加成反应的合适的所述催化剂。优选所述催化剂包括Cu(I)，其如下所述。合适催化剂的进一步详情由Wu和Fokin[Aldrichim.Acta，40(1)，7-17(2007)]和Meldal和Tornoe[Chem.Rev.，108，2952-3015(2008)]描述。
优选方面
用于第一方面的方法的优选前体为式(Ia)叠氮化物，因此优选产物为式(IIIa)三唑。
用于本发明的优选碘放射性同位素为适于用PET或SPECT体内医学成像的那些碘放射性同位素，优选123I、124I或131I，更优选123I或124I，最优选123I。
BTM可为合成或天然来源，但优选合成来源。术语“合成的”具有其常规含义，即与自天然来源例如自哺乳动物身体分离的对比为为人造的。所述化合物具有其制备及杂质概况可完全受控的优点。因此，天然来源的单克隆抗体及其片段在本文所用术语‘合成的’范围之外。
BTM分子量优选高达30,000道尔顿。更优选分子量为200-20,000道尔顿的范围，最优选300-18,000道尔顿，且特别优选400-16,000道尔顿。当BTM为非-肽时，BTM分子量优选高达3,000道尔顿，更优选200-2,500道尔顿，最优选300-2,000道尔顿，且特别优选400-1,500道尔顿。
生物学靶向部分优选包括：3-100聚体的肽、肽类似物、类胨或肽模拟物，其可为线性肽或环肽或其组合；单个氨基酸；酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂(包括部分激动剂)或酶抑制剂；受体结合化合物(包括受体底物、拮抗剂、激动剂或底物)；寡核苷酸或寡DNA或寡RNA片段。
术语“肽”意指包含两个或更多个由肽键(即连接一个氨基酸的胺与另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的氨基酸的化合物，其如下所定义。术语“肽模拟物”或“模拟物”指模拟肽或蛋白质的生物学活性但在化学性质上不再是肽的，即，其不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的生物学活性化合物。此处以更宽广的含义使用术语肽模拟物，以包括实际上不再完全为肽的分子，例如假肽、半肽和类胨。术语“肽类似物”指包含一个或多个氨基酸类似物的肽，其如下所述。亦参见“SynthesisofPeptidesandPeptidomimetics(肽和肽模拟物的合成)”，M.Goodman等，Houben-WeylE22c，Thieme。
术语“氨基酸”意即L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，其可为天然存在的或完全合成来源，并且可为光学上纯的，即单对映体并因此具手性，或为对映体混合物。本文使用氨基酸的常规3-字母或单字母缩写。优选本发明氨基酸为光学上纯的。术语“氨基酸模拟物”意即天然存在的氨基酸的合成类似物，其为电子等排体，即设计为模拟天然化合物的空间和电子结构。所述电子等排体为本领域技术人员所熟知，包括但不限于酯肽(depsipeptide)、逆转反向肽(retro-inversopeptide)、硫代酰胺、环烷或1，5-二取代四唑[参见M.Goodman，Biopolymers，24，137，(1985)]。已知放射性标记的氨基酸例如酪氨酸、组氨酸或脯氨酸为有用的体内成像剂。
当BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物时，其优选为非-肽，并且更优选为合成的。术语“非-肽”意指不包含任何肽键(即两个氨基酸残基之间的酰胺键)的化合物。合适的酶底物、拮抗剂、激动剂或抑制剂包括：葡萄糖和葡萄糖类似物；脂肪酸或弹性蛋白酶、血管紧张肽II或金属蛋白酶抑制剂。合适的合成受体结合化合物包括雌二醇、雌激素、黄体酮(progestin)、孕酮(progesterone)和其它类固醇激素；多巴胺D-1或D-2受体的配体，或多巴胺转运蛋白，例如莨菪烷；和血清素受体的配体。
BTM最优选为3-100聚体的肽或肽类似物。当BTM为肽时，其优选为4-30聚体的肽，最优选为5-28聚体肽。
当BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂或酶抑制剂时，优选所述本发明生物学靶向分子为合成的药物样小分子(即药物分子)。优选多巴胺转运蛋白配体为例如：莨菪烷；脂肪酸；多巴胺D-2受体配体；苯甲酰胺；苯丙胺(amphetamine)；苄胍、碘[123I]西尼(iomazenil)、苯并呋喃(IBF)或马尿酸。优选的莨菪烷衍生物为123I-CIT(DopascanTM)、123I-CIT-FP(DaTSCANTM)和123I-2β-甲氧羰基-3β-(4-氟苯基)-N-(1-碘代丙-1-烯-3-基)去甲莨菪烷(AltropaneTM)的E异构体。特别优选DopascanTM和DaTSCANTM。Morgan和Nowotnik[DrugNewsPerspect.，12(3)，137-145(1999)阐述了这些和其它莨菪烷试剂。优选脂肪酸为123I-BMIPP和123I-IPPA。优选苯丙胺衍生物为123I-IMP。优选苄胍为间-碘苄胍(MIBG)，即123I-MIBG。
当BTM为肽时，优选所述肽包括：
-促生长素抑制素、奥曲肽(octreotide)和类似物；
-结合ST受体的肽，其中ST指由大肠杆菌(E.coli)和
其它微生物产生的热稳定毒素；
-铃蟾肽；
-血管活性肠肽；
-神经降压肽；
-层粘连蛋白片段，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG；
-用于靶向白细胞聚集位点的N-甲酰基趋化肽；
-血小板因子4(PF4)及其片段；
-含RGD(Arg-Gly-Asp)的肽，其可例如靶向血管生成[R.Pasqualini等，NatBiotechnol.1997年6月；15(6)：542-6]；[E.Ruoslahti，KidneyInt.1997年5月；51(5)：1413-7]；
-α2-抗纤溶酶、纤连蛋白或β-酪蛋白、纤维蛋白原或血小板反应蛋白等的肽片段。α2-抗纤溶酶、纤连蛋白、β-酪蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白的氨基酸序列可参见以下参考文献：α2-抗纤溶酶前体[M.Tone等，J.Biochem，102，1033，(1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等，Gene，139，193，(1994)]；纤连蛋白[A.Gutman等，FEBSLett.，207，145，(1996)]；血小板反应蛋白-1前体[V.Dixit等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83，5449，(1986)]；R.F.Doolittle，Ann.Rev.Bi℃hem.，53，195，(1984)；
-为血管紧张肽底物或抑制剂的肽，例如：
血管紧张肽IIAsp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(E.C.Jorgensen等，J.Med.Chem.，1979，第22卷，9，1038-1044)
[Sar，Ile]血管紧张肽II：Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile(R.K.Turker等，Science，1972，177，1203)；
-血管紧张肽I：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu。优选BTM肽为RGD肽。更优选所述RGD肽包含以下片段：
最优选所述RGD肽为当BTM为式(A)肽时：
其中X1为-NH2或
其中a为1-10的整数。
在式A中，a优选为1。
当BTM为肽时，在肽的一个或两个末端(优选两个)上缀合代谢抑制基团(MIG)。具有以该方式保护的两个肽末端对于体内成像应用很重要，这是因为否则的话，预期会有快速代谢，导致丧失对BTM肽的选择性结合亲和力。术语“代谢抑制基团”(MIG)意指生物相容性基团，其在氨基端或羧基端抑制或阻抑BTM肽的酶(尤其是肽酶，例如羧肽酶)代谢。所述基团对于体内应用尤其重要，并为本领域技术人员所熟知，用于肽胺末端的所述基团合适地选自以下：N-酰化基团-NH(C＝O)RG，其中酰基-(C＝O)RG具有选自以下的RG：C1-6烷基、C3-10芳基或包含聚乙二醇(PEG)的结构单元(buildingblock)。以下阐述用于接头基团(L1)的合适的PEG基团。优选所述PEG基团为式Bio1或Bio2(以下)的生物修饰剂。优选所述氨基端MIG基团为乙酰基、苄氧羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。
用于肽羧基端的合适的代谢抑制基团包括：羧酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。用于BTM肽的羧基端氨基酸残基的合适MIG是其中氨基酸残基的末端胺基用C1-4烷基(优选甲基)使其N-烷基化的基团。优选所述MIG基团为羧酰胺或PEG，最优选所述基团为羧酰胺。
在第一方面的方法中，优选存在接头基团(L1)。优选接头基团(L1)为合成的，并且包括式-(A)m-基团，其中每一个A独立地为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或单分散性的聚乙二醇(PEG)结构单元；
其中每一个R独立地选自：H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
M为1-20的整数值。
当L1包含1-10个氨基酸残基的肽链时，所述氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L1包含PEG部分时，其优选包含源自式Bio1或Bio2的单分散性PEG样结构的低聚化的单元：
式Bio1的17-氨基-5-氧-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸，其中p为1-10的整数。或者，可使用基于式Bio2丙酸衍生物的PEG-样结构：
其中p为如对式Bio1所定义的，且q为3-15的整数。
在式Bio2中，p优选为1或2，且q优选为5-12。
当接头基团不包含PEG或肽链时，优选的L1基团具有被连接的原子的主链，所述被连接的原子构成2-10个原子的-(A)m-部分，最优选2-5个原子，且特别优选2或3个原子。
可通过固相肽合成来合成不能市购的BTM肽，这如P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald；ChemicalApproachestotheSynthesisofPeptidesandProteins(合成肽和蛋白质的化学方法)，CRCPress，1997中所述。
在第一方面的方法中，可优选通过式(IIa)化合物的脱保护来原位产生式(II)化合物：
其中M1为炔-保护基，且I*为如对式(II)所定义的。
式(IIa)中的I*的优选方面如式(II)所述。
术语“保护基”意指抑制或阻抑不合乎需要的化学反应的基团，但其被设计为具有充分的活性，使得其可在不修改分子其余部分的足够温和条件下从目标官能团裂解。在脱保护后获得所需产物。在‘ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis’，TheodoraW.Greene和PeterG.M.Wuts，第8章，第927-933页，第4版(JohnWiley&Sons，2007)中阐述了合适的炔保护基，其包括：三烷基甲硅烷基，其中每一个烷基独立地为C1-4烷基；芳基二烷基甲硅烷基，其中芳基优选苄基或二苯基，而烷基各独立地为C1-4烷基；羟甲基或2-(2-羟丙基)。优选所述炔保护基为三甲基甲硅烷基。受保护的式IIa炔基碘具有以下优势：可控制放射性炔基碘的挥发性；可以以受控方式原位产生所需的式(II)炔，以使与式(Ia)或(Ib)叠氮化物衍生物反应的效率最大化。
第一方面的方法优选以无菌方式进行，以便获得作为放射性药物组合物的式(IIIa)或(IIIb)产物。在第三方面(以下)提供放射性药物组合物的进一步阐述。因此，在无菌制备条件下实施所述方法，以得到所需的无菌无热原放射性药物产物。因此优选的是，关键组分，尤其是与式(IIIa)或(IIIb)产物接触的仪器的任何部件(例如小瓶和转移管道)为无菌的。可通过本领域已知方法对组分和试剂进行灭菌，所述方法包括：无菌过滤、最终灭菌，用例如γ辐射、高压灭菌、干热或化学处理(例如用环氧乙烷)。优选事先对非-放射性组分进行灭菌，使得需要对放射性碘标记的放射性药物产物进行的操作次数最少。然而，作为预防措施，优选包括至少最后的无菌过滤步骤。
式(Ia)、(Ib)和(II)化合物加上Cu(I)催化剂以及其它所述试剂和溶剂各自提供在包括密封容器加上任选惰性顶空气体(例如氮气或氩气)的合适的小瓶或容器中，所述密封容器使得可保持无菌完整性和/或放射性安全，加上任选惰性顶部气体同时使得可通过注射器或插管加入及抽取溶液。优选所述容器为隔膜密封小瓶，其中用顶封(通常为铝)压紧气密封盖。所述封盖适于用皮下注射器针头一次或多次穿刺同时保持无菌完整性(例如压紧的隔膜封封盖)。所述容器具有以下另外的优点：需要时封盖可承受真空(例如以改换顶空气体或除去溶液中的气体)以及承受压力变化，例如降低压力而不使外部大气气体例如氧气或水蒸气进入。反应容器合适地选自所述容器及其优选实施方案。反应容器优选由生物相容性塑料(例如PEEK)制造。
优选用自动合成仪实施第一方面的方法。术语“自动合成仪”意指基于单元操作原理的自动模块，其如Satyamurthy等[Clin.Positr.Imag.，2(5)，233-253(1999)]所述。术语‘单元操作’意指复杂过程被简化为一系列的简单操作或反应，其可应用于多种材料。所述自动合成仪优选用于本发明方法，尤其是当需要放射性药物产物时。所述自动合成仪可自多个供应商市购[Satyamurthy等，见上]，包括：GEHealthcare；CTIInc；IonBeamApplicationsS.A.(CheminduCyclotron3，B-1348Louvain-La-Neuve，Belgium)；Raytest(Germany)和Bioscan(USA)。
市购自动合成仪亦提供合适的用于因制备放射性药物而产生的液态放射性废物的容器。自动合成仪通常不提供辐射屏蔽，因为其设计为在合适配置的放射性工作单元中使用。放射性工作单元提供合适的辐射屏蔽以保护操作者免受可能的辐射剂量，以及提供通风以除去化学和/或放射性蒸气。自动合成仪优选包括第八方面所述的‘盒(cassette)’(见下)。
可在合适的溶剂或在水中实现第一方面的放射性碘标记方法，所述溶剂例如乙腈、C1-4烷醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲亚砜或其任何水性混合物。可使用pH范围为4-8、更优选5-7的水性缓冲液。反应温度优选5-100℃，更优选75-85℃，最优选环境温度(通常15-37℃)。可任选在有机碱存在下实施点击环加成，其如Meldal和Tornoe[Chem.Rev.108，(2008)2952，表1(2008)]所述。
优选的点击环加成催化剂包括Cu(I)。Cu(I)催化剂以足以让反应进行的量存在，通常以催化量或过量存在，例如相对于式(Ia)或(Ib)化合物为0.02-1.5摩尔当量。合适的Cu(I)催化剂包括Cu(I)盐，例如CuI或[Cu(NCCH3)4][PF6]，但在还原剂存在下可有利地使用Cu(II)盐(例如硫酸铜(II))来原位产生Cu(I)。合适的还原剂包括：抗坏血酸或其盐，例如抗坏血酸钠；对苯二酚；金属铜；谷胱甘肽；半胱氨酸；Fe2+；或Co2+。Cu(I)本质上亦存在于元素铜颗粒的表面上，因此例如粉末或颗粒形式的元素铜亦可用作催化剂。具可控粒度的元素铜为优选的Cu(I)催化剂来源。更优选所述催化剂为作为铜粉的元素铜，其具有介于0.001-1mm范围、优选0.1mm-0.7mm、更优选约0.4mm的粒度。或者，可使用直径在0.01-1.0mm范围、优选0.05-0.5mm并且更优选直径0.1mm的卷曲铜线。可任选在红菲咯啉存在下使用Cu(I)催化剂，红菲咯啉在点击化学中用于稳定Cu(I)。
可通过标准肽合成方法制备式(Ia)和(Ib)的非-放射性前体化合物，其中BTM为肽或蛋白质，所述合成方法例如固相肽合成，例如如下所述：Atherton，E.和Sheppard，R.C.；“SolidPhaseSynthesis”；IRLPress：Oxford，1989。可通过肽的N或C-末端反应或与肽序列内含有的某些其它官能团反应来实现将炔或叠氮基并入式(Ia)或(Ib)化合物，该修饰不影响载体的结合特性。优选通过形成稳定的酰胺键来引入叠氮基，所述酰胺键例如通过肽胺官能团(peptideaminefunction)与激活的酸反应来形成，或者，通过肽酸官能团(peptideacidfunction)与胺官能团(aminefunction)反应来形成，并且所述酰胺键在肽合成期间或之后引入。用于将叠氮基并入载体例如细胞、病毒、细菌的方法可参见H.C.Kolb和K.B.Sharpless，DrugDiscoveryToday，第8(24)卷，2003年12月及其中的参考文献。用于将叠氮基并入式(Ia)或(Ib)化合物的合适的双官能中间体包括：
其中L1及其优选实施方案如上所定义。
在上式中，L1合适地存在。然而，在叠氮化物-官能化的氨基酸中，叠氮化物官能团可任选直接而无任何接头基团地与氨基酸侧链连接。
用叠氮基使BTM官能化的另外的方法由Nwe等[CancerBiother.Radiopharm.，24(3)，289-302(2009)]阐述。Li等提供N3-L1-CO2H型化合物的合成及其与含胺BTM缀合的应用，其中L1为-(CH2)4-[Bioconj.Chem.，18(6)，1987-1994(2007)]。Hausner等阐述用于N3-L1-CO2H的相关方法，其中L1为-(CH2)2-[J.Med.Chem.，51(19)，5901-5904(2008)]。DeGraaf等[Bioconj.Chem.，20(7)，1281-1295(2009)]阐述具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸，并将其位点特异性并入肽或蛋白质用于随后的点击缀合。
可通过Ku等[Org.Lett.，3(26)，4185-4187(2001)]及其中参考文献所述方法获得式(Ib)氧化腈。因此，其通常可通过用有机碱例如三乙胺处理α-卤素乙醛肟而原位产生。亦参见K.B.G.Torsell“NitrileOxides，NitronesandNitronatesinOrganicSynthesis”[VCH，NewYork(1988)]。
可如第四方面所述获得式(II)和(IIa)的放射性碘标记的炔(见下)。
本发明提供放射性碘标记的更具化学选择性的方法。连接反应在BTM的预定位点发生，这仅产生一种可能的产物。因此，该方法具有化学选择性。另外，炔和叠氮化物两种官能团在大部分反应条件下稳定，并且不与最常见的肽官能团反应-由此使得放射性标记合成期间所需的保护和脱保护步骤最少化。此外，在标记反应期间形成的三唑和异唑环不水解，并且对氧化和还原高度稳定，这意味着标记的BTM具有高的体内稳定性。三唑环在大小及极性上亦与酰胺相当，使得标记的肽或蛋白质是其天然对应物的良好模拟物-三唑环尤其是已知的酰胺模拟基团或生物电子等排体。然而，预期本发明式(IIIa)和(IIIb)产物的三唑和异唑环不被甲状腺脱碘酶所识别，已知所述酶代谢碘代-酪氨酸比代谢碘代苯更快，并且由此预期本发明式(IIIa)和(IIIb)产物的三唑和异唑环在体内用于放射性药物成像和放疗足够稳定。
在第二方面，本发明提供式(IIIa)或(IIIb)化合物：
其中I*、L1和BTM及其优选实施方案如在第一方面所定义。具体而言，L1可存在或不存在。
优选地，第二方面化合物为式(IIIa)的化合物。
本发明亦提供如第二方面所定义的用于医学应用的式(IIIa)或(IIIb)化合物-优选式(IIIa)化合物。
在第三方面，本发明提供包含有效量的第二方面式(IIIa)或(IIIb)化合物连同生物相容性载体介质的放射性药物组合物。I*、L1和BTM的优选实施方案如在第一方面(以上)所定义。第三方面化合物亦优选式(IIIa)三唑。
“生物相容性载体介质”包含一种或多种药学上可接受的辅剂、赋形剂或稀释剂。优选其为流体，尤其是液体，式(IIIa)或(IIIb)化合物悬浮或溶解于其中，使得组合物在生理上耐受，即可将其给予哺乳动物身体而无毒性或过分不适。生物相容性载体介质适宜地为可注射载体液体，例如注射用无菌无热原水；水溶液，例如盐(可将其有利地平衡以便用于注射的终产物为等渗或非低渗的)；一种或多种张力调节物质的水溶液(例如具生物相容性反荷离子的等离子体阳离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等等)。生物相容性载体介质亦可包含生物相容性有机溶剂，例如乙醇。所述有机溶剂可用于溶解更亲脂的化合物或制剂。优选地，生物相容性载体介质为注射用无热原水、等渗盐或乙醇水溶液。用于静脉内注射的生物相容性载体介质的pH适当地在4.0-10.5的范围。
在第四方面，本发明提供制备如第一方面所定义的式II化合物的方法，所述方法包括：
(i)在氧化剂存在下，将式IV或式V前体与放射性碘离子供应物反应，得到式IIb化合物：
其中M2为H或M1基团，并且M1如在第一方面所定义，每一个Ra独立地为C1-4烷基；
其中I*如在第一方面所定义；
(ii)当M2为M1基团时，脱保护以除去M1基团。
适用于第四方面及其优选实施方案的保护基M1如第一方面所述(见上)。脱保护的条件阐述于‘ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis’，TheodoraW.Greene和PeterG.M.Wuts，第8章，第927-933页，第4版(JohnWiley&Sons，2007)中。
式IV或V前体为非-放射性的。式(IV)的某些前体可市购。因此，三烷基锡化合物Bu3Sn-≡-H和Bu3Sn-≡-SiMe3可自Sigma-Aldrich市购。其它有机锡中间体由Ali等[Synthesis，423-445(1996)]阐述。合适的氧化剂由Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]阐述。优选氧化剂是pH约为4的过乙酸(市购)和过氧化氢/pH约为1的水性HCl。当M2为H时，式IIb化合物为碘乙炔。非-放射性(127I)类似物合成由Ku等[Org.Lett.，3(26)，4185-4187(2001)]阐述。Kabalka等[J.Lab.Comp.Radiopharm.，48，359-362(2005)]阐述123I-标记的炔基碘的合成，其在放射性碘标记步骤中用过乙酸通过与式(V)类似的炔基三氟硼酸钾前体来合成。从该文中以及在Kabalka等[JLab.Comp.Radiopharm.，49，11-15(2006)]中阐述了自相应的炔合成炔基三氟硼酸钾前体。说明了炔基三氟硼酸钾前体为结晶固体，其在空气中和水中都稳定。
在第五方面，本发明提供了可用于第一方面方法中的式(IIb)化合物：
其中I*如第一方面所定义；和
M2为H或M1，其中M1如式IIa所定义(见上)。
I*和M1的优选实施方案如第一方面所定义(见上)。
当M2为H时，式(IIb)化合物为放射性碘标记的碘乙炔。所用碘乙炔(H-≡-I)在32℃于1个大气压力时的挥发性可有利地用于使活性放射性碘物质在放射性标记之前容易地蒸馏，且将产物截留在例如干冰冷却的容器中。这代表放射性碘标记步骤之前的有用的纯化。因为点击环加成是高产率的，所以预计将消耗全部化合物(II)，因此产物即化合物(IIIa)或(IIIb)的放射性化学纯度(RCP)最大。
在第六方面，本发明提供第二或第五方面化合物用于制备用于体内成像或体内放疗的方法中的放射性药物的用途。优选地，所述用途为在体内成像方法中的用途，更优选通过PET或SPECT成像。
在第七方面，本发明提供自动合成仪实施第一或第四方面方法的用途。
自动合成仪及其优选实施方案如第一方面中阐述(见上)。
在第八方面，本发明提供适用于第一方面优选实施方案的自动合成仪的单次使用的无菌盒，所述盒包含实施第一或第四方面方法所必需的无菌无热原形式的非-放射性试剂。
用于第八方面的以上方法的优选实施方案分别如第一和第四方面所述。
术语“盒”意指经设计适合在自动合成仪上移出和交换的一块器械(如下所定义)，这样使得合成仪的活动件的机械运动从盒外，即外部地控制盒的操作。合适的盒包含线性阵列的阀，各阀与端口连接，其中试剂或小瓶可通过针刺倒置隔膜密封的小瓶或通过气密连接的接头来连接。各阀具有凸-凹接头，其与自动合成仪的对应移动臂对接。因此当盒与自动合成仪连接时臂的外部旋转控制阀的打开或闭合。将自动合成仪的另外的活动件设计为夹在注射器活塞头上，并由此提起或下压注射器管。
盒是多用途的，通常具有若干可连接试剂的位置，和若干适于连接试剂注射器小瓶或色谱柱(例如SPE)的位置。盒总是包括反应容器。所述反应容器优选体积为1-10cm3，最优选2-5cm3，并且经配置使得3个或更多个盒端口与其连接，以允许从盒上的不同端口传送试剂或溶剂。优选地盒具有以线性阵列的15-40个阀，最优选20-30个，且特别优选25个。盒的阀优选每一个相同，最优选为3通阀。将本发明盒设计为适于放射性药物制备，并且因此由药物级的并亦理想地为耐受辐解作用的材料来制备。
优选本发明自动合成仪为包括一次性的或单次使用的盒的合成仪，所述盒包含制备给定批次放射性碘标记的放射性药物所必需的所有试剂、反应容器和仪器。所述盒意指具有能够通过简单变换盒来制备各种不同放射性碘-标记的放射性药物的灵活性且具最小交叉污染风险的自动合成仪。盒方法还具有以下优势：简化装配因而降低操作人员的误差风险；改进的GMP遵从性；多-示踪物能力；生产运行之间的快速转换；预运行自动诊断核查盒和试剂；自动条形码交叉检查化学试剂与待进行的合成；试剂可示踪性；单次使用并因此无交叉污染的风险、防止擅自改变和滥用。
在第九方面，本发明提供产生人或动物身体影像的方法，所述方法包括给予第二方面的化合物或第五方面的放射性药物组合物，并用PET或SPECT产生所述分布有所述化合物或组合物的身体的至少部分的影像。
在再一方面，本发明提供监测用药物治疗人或动物身体的效果的方法，所述方法包括给予所述身体第二方面化合物或第五方面的组合物，并用PET或SPECT检测所述分布有所述化合物或组合物的身体的至少部分对所述化合物或组合物的吸收。
该最后方面的给予和检测优选在用所述药物治疗前和治疗后实施，使得可测定药物治疗对人或动物患者的效果。当药物治疗涉及疗程时，亦可在治疗期间进行成像。
通过以下实施例来说明本发明。实施例1提供作为色谱法的可信参考标准品的非-放射性(127I)碘-乙炔参考样品的合成。实施例2提供碘-乙炔与苄基叠氮的点击偶联，以形成三唑环。实施例3-5提供用不同氧化剂合成123I-碘乙炔。实施例6-8提供用本发明方法合成放射性碘标记的三唑的预示性实例。实施例9提供用本发明方法合成放射性碘标记的三唑的预示性实例。
缩写
DIPEA：二异丙基乙胺
DMF：二甲基甲酰胺
HPLC：高效液相色谱法
MeCN：乙腈
PAA：过乙酸
RP-HPLC：反相HPLC
RT：室温
THF：四氢呋喃
实施例1：合成碘乙炔
在0℃将含三丁基(乙炔基)锡烷的氘氯仿(2ml)(Sigma-Aldrich；400mg，1.27mmol)用碘(322mg，1.27mmol)处理。然后在15分钟的时间内当碘颜色快速消失时使反应物温热至室温。然后蒸馏反应物，并收集含挥发性碘乙炔的氘氯仿，为无色液体。氯仿中的NMR表明其为纯碘乙炔溶液。在该规模上不易估测产率，因为碘乙炔为挥发性物质。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δH2.17(1H，s，CH)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：δC83.3，(其它碳不可见)。
实施例2：合成1-苄基-4-碘-1H-1，2，3-三唑
在2O℃将氘氯仿(2ml)和THF(2ml)中的碘乙炔(193mg，1.27mmol，假定自先前反应100％产率)溶液用叠氮甲基苯(苄基叠氮；169mg，1.27mmol)[购自AlfaAeser；Fr.Moulin，Helvet.Chim.Acta，35，167-80(1952)]、碘化亚铜(90mg，047mmol)和三乙胺(256mg，2.54毫摩尔)处理。然后在室温在48小时的时间内搅拌反应物。然后通过硅藻土过滤反应物，以除去氧化铜(1)，然后在二氧化硅上以15-50％梯度的乙酸乙酯/汽油进行色谱。收集两个馏分。蒸发馏分1得到无色油状物(102mg，0.77mmol)。
1HNMR和13CNMR表明这主要是未反应的叠氮甲基苯。
蒸发馏分2得到1-苄基-4-碘-1H-1，2，3-三唑，为无色液体，其静置时结晶(104mg，0.364mmol，28％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δH5.60(2H，s，CH2)，7.24(2H，m，2xArH)7.32(3H，m，3xArH)，7.741H，s，CHArH)。13CNMR(75MHz，CDCl3)：δC53.8，127.7，128.4，128.8.134.2141.5。一个碳不可见。
实施例3：用过乙酸氧化剂制备并蒸馏[ 123 I]-碘乙炔
向冰上的Wheaton小瓶中加入乙酸铵缓冲液(100μl，0.2M，pH4)、[127I]碘化钠(10μl，0.01M氢氧化钠中的10mM溶液，1x10-7摩尔)、[123I]碘化钠(10μl，20-85MBq)、过乙酸(10μl，10mM溶液，1x10-7摩尔)以及含乙炔基三丁基锡烷的THF(Sigma-Aldrich；100μl，0.38mg/ml，1.2x10-7摩尔)溶液。最后，加入400-600μlTHF，密封Wheaton小瓶，使反应混合物温热至室温，然后进行反相HPLC分析。
在加入乙炔基三丁基锡烷后约10分钟时的HPLC分析，产生具75％放射性化学纯度(RCP)的[123I]-碘乙炔。参见图1。认为具更长保留时间的杂质为123I-二-碘乙炔。
在80-100℃将反应混合物加热15-20分钟，在此期间，将[123I]-碘乙炔和THF通过短管蒸馏到冰上的收集小瓶中。此后，让低流速的氮气通过经加热小瓶的隔膜，以除去来自管的任何残留的液体。参见图2。
蒸馏后约10分钟时的HPLC分析显示94％RCP的[123I]-碘乙炔。参见图3。
实施例4：用Iodo-gen管制备[ 123 I]-碘乙炔
向用磷酸钠缓冲液(1mlpH7.4，25mM)预湿的Iodo-gen管(ThermoScientificPierceProteinResearchProducts)中加入磷酸钠缓冲液(100μlpH7.4，25mM)、[127I]碘化钠(10μl，0.01M氢氧化钠中的10mM溶液，1x10-7摩尔)和[123I]碘化钠(10μl，18MBq)。在室温孵育6分钟后，将所述反应物转移到冰上的Wheaton小瓶中，然后加入含乙炔基三丁基锡烷的THF溶液(Sigma-Aldrich；38μl，1mg/ml，1.2x10-7摩尔)。密封小瓶并使反应混合物温热至室温，然后进行反相HPLC分析。
在加入乙炔基三丁基锡烷后约10分钟时的HPLC分析显示57％产率的[123I]-碘乙炔。
实施例5：用过氧化氢氧化剂制备并纯化[ 123 I]-碘乙炔
向冰上的Wheaton小瓶中加入[127I]碘化钠(10μl，0.01M氢氧化钠中的10mM溶液，1x10-7摩尔)、[123I]碘化钠(10μl，18MBq)、盐酸(100μl，1M)、过氧化氢(50μl，3％水溶液，4.4x10-5摩尔)以及含乙炔基三丁基锡烷的THF溶液(Sigma-Aldrich；38μl，1mg/ml，1.2x10-7摩尔)。密封小瓶并使反应混合物温热至室温，然后进行反相HPLC分析。
在加入乙炔基三丁基锡烷后约10分钟时的HPLC分析，产生85％产率的[123I]-碘乙炔。
实施例6：制备1-苯-4-[ 123 I]-碘-1H-1，2，3-三唑(预示性实施例)
向含有THF中的[123I]-碘乙炔(实施例3、4或5)的冷却Wheaton小瓶中加入水、硫酸铜、L抗坏血酸钠和磷酸钠缓冲液。最后，加入苄基叠氮溶液并移走冰浴。在室温下孵育反应物，需要时施用加热。在水中稀释后，通过反相HPLC或Sep-Pak柱纯化1-苯-4-[123I]-碘-1H-1，2，3-三唑。
实施例7：制备1-苯-4-[ 123 I]-碘-1H-1，2，3-三唑(预示性实施例)
向冰上的含有THF中的[123I]-碘乙炔(实施例3、4或5)的Wheaton小瓶中加入碘化铜(I)、L抗坏血酸钠、水和二异丙基乙胺。最后，加入苄基叠氮溶液并移走冰浴。在室温下孵育反应物，需要时施用加热。在水中稀释后，通过反相HPLC或Sep-Pak柱纯化1-苯-4-[123I]-碘-1H-1，2，3-三唑。
实施例8：制备1-苯-4-[ 123 I]-碘-1H-1，2，3-三唑(预示性实施例)
向装有铜粉(-40目)并置于冰上的Wheaton小瓶中加入[123I]-碘乙炔(实施例3、4或5)和苄基叠氮。加入试剂后，移走冰浴，在室温下孵育反应物，需要时施用加热。
向含有[123I]-碘乙炔(实施例3，4或5)的冷却的3mlWheaton小瓶中加入溶解于THF(0.1-0.5ml)的氧化腈溶液。在0℃进一步将反应混合物搅拌15分钟，然后使其温热至室温，并再搅拌30-60分钟直到耗尽所有碘乙炔。在用水稀释后，通过HPLC纯化[123I]异唑。

Claims (17)

1.放射性碘标记生物学靶向部分的方法，所述方法包括：
(i)提供式(Ia)或(Ib)化合物：
(ii)在点击环加成催化剂存在下将所述式(Ia)或(Ib)化合物与式(II)化合物反应，通过点击环加成分别得到式(IIIa)或(IIIb)缀合物：
其中：
I*为碘放射性同位素；
L1为可存在或不存在的接头基团；
BTM为单一氨基酸、3-100聚体的肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物；
其中所述催化剂包含Cu(I)催化剂；
其中所述接头包括式-(A)m-基团，其中每一个A独立地为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或单分散性的聚乙二醇(PEG)结构单元；其中每一个R独立地选自：H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；m为1-20的整数值。
2.权利要求1的方法，其中I*选自123I、124I或131I。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中BTM为RGD肽。
4.权利要求1或权利要求2的方法，其中BTM为包含以下片段的肽：
。
5.权利要求1或权利要求2的方法，其中BTM为式(A)肽：
其中X1为–NH2或
其中a为1-10的整数。
6.权利要求1的方法，其中Cu(I)催化剂包括元素铜。
7.权利要求6的方法，其中所述元素铜具有范围为0.001-1mm的粒度。
8.权利要求1、2和7中任一项的方法，其中所述式(II)化合物通过式(IIa)化合物的脱保护而原位产生：
其中M1为炔-保护基。
9.权利要求1、2和7中任一项的方法，所述方法以无菌方式实施，以便获得作为放射性药物组合物的式(IIIa)或(IIIb)产物。
10.权利要求1、2和7中任一项的方法，所述方法用自动合成仪实施。
11.式(IIIa)或(IIIb)化合物：
其中I*和L1如权利要求1或权利要求2所定义，并且BTM如权利要求1或3-5中的任一项所定义。
12.包含有效量的权利要求11的化合物连同生物相容性载体介质的放射性药物组合物。
13.权利要求11的化合物用于制备用于体内成像或体内放疗的方法中的放射性药物的用途。
14.自动合成仪实施权利要求1-9中任一项的方法的用途。
15.适用于权利要求14的自动合成仪方法的单次使用的无菌盒，所述盒包含无菌无热原形式的实施权利要求1-9中任一项的方法所必需的非-放射性试剂。
16.权利要求11的化合物或权利要求12的组合物在制备用于用PET或SPECT产生人或动物身体影像的药物中的用途。
17.权利要求11的化合物或权利要求12的组合物在制备用于用PET或SPECT监测用药物治疗人或动物身体的效果的药物中的用途。
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