CN103524506B - 一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用 - Google Patents

一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用。本发明建立了“一锅法”制备放射性碘标记生物分子的方法，利用易得、使用方便的炔或叠氮修饰的小分子与具有生物靶向功能的生物分子、及放射性碘偶联生成放射性碘标记生物分子—5-碘代-1,4二取代-1,2,3三唑化合物。本发明方法在有水有氧的开放体系下进行，且该方法具有操作简便、标记率、产物纯度高的优点。本发明方法制备的放射性碘标记生物分子可用作临床SPECT/CT和PET/CT的分子探针，该方法亦为临床SPECT/CT和PET/CT分子探针的合成提供了新的思路；I131标记的生物分子还可以用作肿瘤治疗药物。

Description

一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种分子标记方法，特别涉及一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用。
背景技术
目前，放射性碘标记的方法主要有同位素交换法和化学合成法，后者包括直接标记(如：Iodogen法，氯胺-T法等)和间接标记。同位素交换法是利用一种元素的两种同位素在两种不同化学状态中的互相交换来制备放射性药物或标记化合物。其条件是在原料分子中具有碘原子而且碘原子处于非中心位置，此种方法简单，标记率可达95%以上，一般不需要分离纯化，但是放射性的比活度不高。直接标记法是把放射性碘直接引入到蛋白质或多肽等分子中去，反应主要发生在酪氨酸、组氨酸或者色氨酸残基上，得到的标记物的比活度较高，是一种简便有效的标记方法；但碘标记酪氨酸的结构类似于甲状腺素，而甲状腺素在体内易被脱碘酶识别并发生脱碘反应，因此直接标记得到的产物在体内不稳定。间接标记法是用预先标记的放射性中间体与蛋白或多肽分子上存在的游离功能团进行偶联，蛋白质标记的主要功能团是胺基、巯基和氧化的糖官能团，其他的官能团如苯酚、羧酸酯、咪唑等也可能被利用，然而前提是所标记化合物中含有上述基团，如果没有则很难用放射性碘进行标记。而且这些方法都不适用于小分子化合物的标记。
自Sharpless提出clickchemistry（点击化学）以来，其在放射性药物的合成以及分子探针合成方面展现了广阔的应用前景并取得了令人瞩目的研究成果。18F和fac-[M(CO)3]+(M=99mTc或188Re)的应用较为广泛（MarikJ.，SutcliffeJ.L.TetrahedronLett.，2006，47:6681-6684；MindtT.L.，StruthersH.，BransT.，etc.J.Am.Chem.Soc.，2006，128:15096-15097.），然而对于已经临床广泛应用的碘的标记几乎没有报道。最近有文献报道了小分子的5-碘-（I125）-1,2,3-三唑的合成(YanR.，El-EmirE.，RajkumarV.Angew.Chem.Int.Ed.,2011，50，6793-6795；ChengW.，JilinY.，WeiZ.，J.South.Med.Univ.，2013，33，779-784.)，但将其应用于临床的放射性药物的合成有待进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种放射性碘标记生物分子的制备方法及应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种放射性碘标记生物分子的制备方法，为下述方法中的任意一种：
方法一、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的小分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法二、以叠氮基团修饰的小分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法三、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成具有双靶点的放射性碘标记生物分子。
优选的，
方法一中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的小分子选自苯乙炔、炔丙基胺、丙炔酸、炔丙基甘氨酸、HC≡C–PEG；
方法二中，叠氮基团修饰的小分子选自叠氮化钠、苄基叠氮、叠氮丙氨酸、羟乙基叠氮、胺乙基叠氮、N3-PEG，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸；
方法三中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸。
优选的，所述生物分子为经PEG修饰的生物分子：
其中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-PEG-叶酸、N3-PEG-肽、N3-PEG-DNA、N3-PEG-RNA、N3-PEG-蛋白质、N3-PEG-糖、N3-PEG-氨基酸；
炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-PEG-叶酸、HC≡C-PEG-肽、HC≡C-PEG-DNA、HC≡C-PEG-RNA、HC≡C-PEG-蛋白质、HC≡C-PEG-糖、HC≡C-PEG-氨基酸。
优选的，方法一、二、三均包括以下步骤：
1)制备催化体系；
2)混合催化体系、反应原料、溶剂，得混合物料，25℃～120℃下震荡反应1～12小时，合成放射性碘标记生物分子。
优选的，所述催化体系为以下任意一种：
(1)含有碘化亚铜/三乙胺的混合体系或含有氯化铜/三乙胺的混合体系；
(2)硫酸铜/抗坏血酸钠的水溶液体系。
优选的，混合物料中，溶剂为水，或为乙腈、甲醇、乙醇、THF、DMSO或DMF与水的混合溶剂。
优选的，混合物料中，叠氮基团、炔基基团与铜元素的摩尔比为1：1：（0.5～2）。
优选的，混合物料中，生物分子的浓度为0.01～1.0mol/L。
更优选的，混合物料中，生物分子的浓度为0.5～1.0mol/L。
上述方法制备的放射性碘标记生物分子作为SPECT/CT或PET/CT的分子探针的应用，或作为肿瘤治疗药物的应用。
本发明的有益效果是：
本发明建立了“一锅法”制备放射性碘标记生物分子的方法，利用易得、使用方便的炔或叠氮修饰的小分子与具有生物靶向功能的生物分子、及放射性碘（I124、I125、I131）偶联生成放射性碘标记生物分子——5-碘代-1,4二取代-1,2,3三唑化合物。
本发明方法在有水有氧的开放体系下进行，且该方法具有原料易得、操作简便、标记率、产物纯度高的优点。
本发明方法制备的放射性碘标记生物分子可用作临床SPECT/CT（I125、I131）和PET/CT（I124）的分子探针，该方法亦为临床SPECT/CT和PET/CT分子探针的合成提供了新的思路；I131标记的生物分子还可以用作肿瘤治疗药物。
附图说明
图1为实施例1产物的radio-HPLC分析图谱；
图2为实施例2产物的radio-HPLC分析图谱；
图3为实施例3产物的radio-HPLC分析图谱；
图4为实施例4产物的radio-HPLC分析图谱；
图5为实施例5产物的radio-HPLC分析图谱。
具体实施方式
本发明放射性碘标记生物分子（5-碘（I124、I125、I131）-1,4-二取代三唑化合物）的合成机理如下：
所述放射性碘为I124、I125或I131。
一种放射性碘标记生物分子的制备方法，为下述方法中的任意一种：
方法一、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的小分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法二、以叠氮基团修饰的小分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法三、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成具有双靶点的放射性碘标记生物分子。
优选的，
方法一中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的小分子选自苯乙炔、炔丙基胺、丙炔酸、炔丙基甘氨酸、HC≡C–PEG；
方法二中，叠氮基团修饰的小分子选自叠氮化钠、苄基叠氮、叠氮丙氨酸、羟乙基叠氮、胺乙基叠氮、N3-PEG，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸；
方法三中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸。
优选的，所述生物分子为经聚乙二醇修饰的生物分子，经聚乙二醇修饰可增加生物分子的水溶性，增加生物相容性，并延长标记核素与被标记物之间的距离，减少生物分子的放射性自损伤，经聚乙二醇修饰的生物分子用于方法三，还可以调节多靶点生物分子的间距。其中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-PEG-叶酸、N3-PEG-肽、N3-PEG-DNA、N3-PEG-RNA、N3-PEG-蛋白质、N3-PEG-糖、N3-PEG-氨基酸；炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-PEG-叶酸、HC≡C-PEG-肽、HC≡C-PEG-DNA、HC≡C-PEG-RNA、HC≡C-PEG-蛋白质、HC≡C-PEG-糖、HC≡C-PEG-氨基酸。
一种放射性碘标记生物分子的制备方法，方法一、二、三均包括以下步骤：
1)制备催化体系；
2)混合催化体系、反应原料、溶剂，得混合物料，使生物分子的浓度为0.5～1.0mol/L，25℃～120℃下震荡反应1～12小时，合成放射性碘标记生物分子。
优选的，步骤2）中，50～70℃下震荡反应1～8小时。
步骤1）、2）中的溶剂相同或不同。
更优选的，步骤2）混合物料中的溶剂为以下体系中的一种：乙腈/水、甲醇/水、乙醇/水、THF/水、DMSO/水、DMF/水，其中，另一组份与水的体积比为0.1～10：1，更优选的，为0.8～2：1。
优选的，混合物料中，溶剂为水，或为乙腈、甲醇、乙醇、THF、DMSO或DMF与水的混合溶剂。
优选的，混合物料中，叠氮基团、炔基基团与铜元素的摩尔比为1：1：（0.5～2）。
优选的，混合物料中，生物分子的浓度为0.01～1.0mol/L。
更优选的，混合物料中，生物分子的浓度为0.5～1.0mol/L。
所述催化体系为以下任意一种：
(1)含有碘化亚铜/三乙胺的混合体系或含有氯化铜/三乙胺的混合体系；
(2)硫酸铜/抗坏血酸钠的水溶液体系。
优选的，催化体系中，碘化亚铜/三乙胺或者氯化铜/三乙胺摩尔比为1：1～10，更优选的，为1：1～2；硫酸铜/抗坏血酸钠的摩尔比为1：1～10，更优选的，为1：1～4。
上述方法制备的放射性碘标记生物分子可作为SPECT/CT或PET/CT的分子探针，或用作肿瘤治疗药物。
下面结合具体实施例进一步描述本发明内容，但本发明并不受其限制。
实施例1
(1)将1μmol的氯化铜溶解于装有50μL水的EP管中，而后加入1.5μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol（113μg）炔丙基甘氨酸（HC≡C-甘基酸），室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI125（3.7MBq）和50μL含1μmol叠氮-Folicacid的DMSO溶液，得混合物料，25℃震荡反应6h后，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL的体积比为1:1的DMSO/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为70%（分析图见图1）；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，50%A-95%A。
实施例2
(1)将1μmol的氯化铜溶解于装有50μL无水乙腈的EP管中，而后加入1.5μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔丙基甘氨酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI125（3.7MBq）和50μL含1μmol叠氮-RGD三肽的无水乙腈溶液，得混合物料，60℃震荡1后，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL的体积比为1:1的乙腈/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为85%（分析图见图2）；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，95%A-50%A。
实施例3
(1)将1μmol的氯化铜溶解于50μL无水DMF，加入1.5μmol的三乙胺（152μg），震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔基叶酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和50μL含1μmol苄基叠氮的无水DMF溶液，得混合物料，混合物在60℃震荡2h，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL的体积比为1:1的四氢呋喃/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为76%（分析图见图3）；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，55%A-90%A。
实施例4
(1)将1μmol的氯化铜溶解于50μL无水乙腈，加入1.5μmol的三乙胺（152μg），震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔基丙基甘氨酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和50μL含1μmol叠氮-Octreotide的无水乙腈溶液，60℃室温震荡1h，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL体积比为1:1的乙腈/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为87%（分析图见图4）；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，95%A-50%A。
实施例5
(1)将1μmol的硫酸铜和2μmol的抗坏血酸钠溶解于50μL水溶液中，加入1.0μmol的三乙胺（152μg），震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔基丙基甘氨酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和50μL含1μmol叠氮-丙氨酸的乙腈溶液，60℃室温震荡4h，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL体积比为1:1的乙腈/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为92%（分析图见图5）；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，85%A-40%A。
实施例6
(1)将1μmol的氯化铜溶解于50μL无水DMSO，加入2.0μmol的三乙胺（152μg），震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔基叶酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和50μL含1μmol叠氮-Folicacid的无水DMSO溶液，60℃室温震荡8h，合成放射性碘标记生物分子。
加入1mL体积比为1:1的DMSO/水对产物进行稀释。用分析型radio-HPLC检测标记率为71%；用制备型radio-HPLC制备后放化纯度大于99%。HPLC的条件为：流动相A：0.1%TFA的水溶液，流动相B为：0.1%TFA的乙腈溶液；流速为每分钟1mL；梯度为0-20min，55%A-90%A。
实施例7
(1)将0.5μmol的硫酸铜溶解于55μL水中，加入0.5μmol的抗坏血酸钠，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入1μmol炔基葡萄糖，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和45μL含1μmol叠氮-RNA的无水DMSO溶液，120℃震荡1h，合成放射性碘标记生物分子。
实施例8
(1)将10μmol的碘化亚铜溶解于33μL水，加入15μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入5μmol炔基-DNA，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）和67μL含5μmol叠氮葡萄糖的无水DMSO溶液，50℃震荡6h，合成放射性碘标记生物分子。
实施例9
(1)将40μmol的硫酸铜溶解于90μL水，加入160μmol的抗坏血酸钠，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入40μmol炔基-RNA，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）、40μmol叠氮丙氨酸和9μL无水DMSO，25℃震荡12h，合成放射性碘标记生物分子。
实施例10
(1)混合50μmol的氯化铜、90μL无水DMSO、75μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入50μmol炔基-绿色荧光蛋白，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）、50μmol叠氮-PEG和15μL水，70℃室温震荡4h，合成放射性碘标记生物分子。
实施例11
(1)混合80μmol的氯化铜、33μL的无水乙腈、480μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
(2)在上述催化体系中加入80μmolHC≡C-PEG-叶酸，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）、80μmol胺乙基叠氮和67μL无水DMSO溶液，80℃室温震荡2h，合成放射性碘标记生物分子。
实施例12
(1)混合50μmol的碘化亚铜、90μL无水乙腈、500μmol的三乙胺，震荡使其保持在棕褐色状态，制得催化体系。
在上述催化体系中加入100μmol炔基-folicacid，室温震荡2分钟后，分别滴加入5μLNaI131（3.7MBq）、100μmolN3-PEG和9μL水，100℃室温震荡1h，合成放射性碘标记生物分子。

Claims (4)

1.一种放射性碘标记生物分子的制备方法，为下述方法中的任意一种：
方法一、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的小分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法二、以叠氮基团修饰的小分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成放射性碘标记生物分子；
方法三、以叠氮基团修饰的生物分子、炔基基团修饰的生物分子、放射性碘化合物作为反应原料，加入溶剂中，在催化体系作用下，进行点击化学反应，合成具有双靶点的放射性碘标记生物分子；
其中，方法一中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的小分子选自苯乙炔、炔丙基胺、丙炔酸、炔丙基甘氨酸、HC≡C–PEG；
方法二中，叠氮基团修饰的小分子选自叠氮化钠、苄基叠氮、叠氮丙氨酸、羟乙基叠氮、胺乙基叠氮、N3-PEG，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸；
方法三中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-叶酸、N3-肽、N3-DNA、N3-RNA、N3-蛋白质、N3-糖、N3-氨基酸，炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-叶酸、HC≡C-肽、HC≡C-DNA、HC≡C-RNA、HC≡C-蛋白质、HC≡C-糖、HC≡C-氨基酸；
或者，方法一、二、三中，所述生物分子为经PEG修饰的生物分子：其中，叠氮基团修饰的生物分子选自N3-PEG-叶酸、N3-PEG-肽、N3-PEG-DNA、N3-PEG-RNA、N3-PEG-蛋白质、N3-PEG-糖、N3-PEG-氨基酸；
炔基基团修饰的生物分子选自HC≡C-PEG-叶酸、HC≡C-PEG-肽、HC≡C-PEG-DNA、HC≡C-PEG-RNA、HC≡C-PEG-蛋白质、HC≡C-PEG-糖、HC≡C-PEG-氨基酸；
上述方法一、二、三均包括以下步骤：
1）制备催化体系；所述催化体系为含有碘化亚铜/三乙胺的混合体系或含有氯化铜/三乙胺的混合体系或硫酸铜/抗坏血酸钠的水溶液体系；
2）混合催化体系、反应原料、溶剂，得混合物料，25℃～120℃下震荡反应1～12小时，合成放射性碘标记生物分子；其中，所述混合物料中，溶剂为水，或为乙腈、甲醇、乙醇、THF、DMSO或DMF与水的混合溶剂。
2.根据权利要求1所述放射性碘标记生物分子的制备方法，其特征在于：混合物料中，叠氮基团、炔基基团与铜元素的摩尔比为1：1：（0.5～2）。
3.根据权利要求1所述放射性碘标记生物分子的制备方法，其特征在于：混合物料中，生物分子的浓度为0.01～1.0mol/L。
4.根据权利要求3所述放射性碘标记生物分子的制备方法，其特征在于：混合物料中，生物分子的浓度为0.5～1.0mol/L。
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