CN102703528A - 一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，该方法先通过选择合适的培养基制备银耳菌的发酵培养物，再将发酵液加入乙醇除去多糖和蛋白质后，采用大孔树脂吸附、洗脱后低温结晶。本发明具有发酵周期短、发酵液中卵孢菌素含量高、操作简单、使用有机溶剂少等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备卵孢菌素晶体的方法，特别是涉及一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法。
背景技术
卵孢菌素是许多土壤真菌、虫生真菌和担子菌的代谢产物。据文献报道，卵孢菌素具有广泛的生物活性，主要用于生物防治，1984年D Brewer报道卵孢菌素具有抗细菌作用，1992年BJ Terry报道卵孢菌素具有抑制I型单纯疱疹病毒DNA聚合酶的活性，1994年J Eyal报道卵孢菌素具有较强的抗虫害作用如植物叶片粉虱，土壤昆虫象鼻虫等，2000年Hermann Strasser研究表明卵孢菌素对人类和动物没有毒害作用，2006年胡丰林报道卵孢菌素具有抑制单胺氧化酶（MAO）的活性。鉴于卵孢菌素具有广泛的生物活性，人们正在研究将其作为生物农药使用。
很多栽培银耳菌的人都知道银耳菌在胶质化之前会出现“吐黄水和吐红水”的现象，但是至今没有文献报道产生这种现象的原因，以及所吐黄水和红水为何种化合物。本申请人通过大量跟踪、分析发现了产生这种现象的原因，即银耳菌在合适培养条件下可代谢卵孢菌素，并通过筛选合适的培养基培养出了红色物质—卵孢菌素，由此产生了本发明。迄今为止还未有有关用银耳菌制备卵孢菌素晶体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法。
本发明所提供的一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法包括如下步骤：
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在20~30℃、转速100~200r/min的条件下培养2~5d，获得种子液，将种子液以5~10%的接种量接种到发酵培养基中，在20~30℃、转速100~200r/min的条件下培养4~10d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：碳源20~30g.L-1+氮源5~15g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1g.L-1+硫酸镁1g.L-1，pH6.0，所述碳源和氮源为适合银耳菌生长的碳源和氮源；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在40℃~80℃减压浓缩后加入无水乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂吸附，然后依次用蒸馏水和乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
上述（1）步骤中培养基所采用的碳源为葡萄糖、蔗糖、，乳糖或麦芽糖，氮源为有机氮源或/和氨基酸。
上述有机氮源为豆粕、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉中的一种或几种的组合，氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸中的一种或几种的组合。
上述（2）步骤中所加入的无水乙醇体积为浓缩后发酵液体积的2~5倍。
上述（3）步骤中洗脱时所用乙醇的浓度为55~95%。
上述（4）步骤中所用乙醇的浓度与（3）步骤所用乙醇的浓度相同。
本发明所采用的银耳菌种子是由四川省通江山霸王野生食品有限公司提供的通江椴木银耳菌二级母种通过原生质体育种的方法分离得到的（命名为TJ001，现保藏于成都大学药食同源植物资源重点实验室）。具体步骤是：先将银耳菌二级母种接种于PDA液体培养基中培养5天，然后采用4000r/min离心获得菌丝体，将菌丝用0.6mol/L的氯化钾溶液清洗后，取0.5g 菌丝体溶解在0.6mol/L的氯化钾溶液中，再加入浓度为3%溶壁酶，在25℃酶解4h后用无菌脱脂棉过滤酶解液获得原生质体，将原生质体涂布于再生培养基：麦芽糖10g.L-1+葡萄糖10g.L-1+蛋白胨4g.L-1+磷酸二氢钾0.46 g.L-1+硫酸镁1.0 g.L-1+琼脂20 g.L-1上生长6d，pH6.0，挑取单菌落。
上述原生质体育种的方法已是成熟方法，并已在有关文献上进行了刊载，如《菌物系统》〔2003.22（4）〕上登载的的由谢宝贵、朱虎撰写的“银耳原生质体分离与再生条件优化研究”。
本发明首次通过选择合适的培养基发酵银耳菌产生卵孢菌素，同时利用简单的除杂方法和柱纯化技术获得高纯度卵孢菌素晶体，产率可达30mg.L-1。本发明具有发酵周期短、发酵液中卵孢菌素含量高、操作简单、使用有机溶剂少等优点。
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的内容并不仅限于此。
具体实施方式
实施例1
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速150r/m的条件下培养5天，获得种子液，将种子液以10%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：葡萄糖20g.L-1+蛋白胨5g.L-1++磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0，发酵3天后发酵液开始变红，12小时后颜色变化明显；
（2）采用10000r/min的转速将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入4倍体积的无水乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其在70℃浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例2
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在20℃、转速200r/min的条件下培养4d，获得种子液，将种子液以8%的接种量接种到发酵培养基中，在30℃、转速150r/min的条件下培养7d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：蔗糖30g.L-1+蛋白胨6g.L-1+玉米浆4g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0，发酵5d发酵液开始变红，12h后颜色变化明显；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在50℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂AB-8吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为85%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为85%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例3
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在20℃、转速200r/min的条件下培养4d，获得种子液，将种子液以5%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养8d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：蔗糖30g.L-1+牛肉膏5g.L-1+酵母浸粉5g.L-1+豆粕5g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0，发酵5d发酵液开始变红，12h后颜色变化明显；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在50℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂AB-8吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例4
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在30℃、转速150r/min的条件下培养3d，获得种子液，将种子液以6%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速200r/min的条件下培养5d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：乳糖25g.L-1+缬氨酸10g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0，发酵4d发酵液开始变红，12h后颜色变化明显；
（2）采用10000r/min的转速将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，80℃减压浓缩后加入3倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D-101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为65%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为65%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例5
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得种子液，将种子液以10%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：麦芽糖25g.L-1+缬氨酸2g.L-1+异亮氨酸4g.L-1+磷酸二氢钾0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例6
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速120r/min的条件下培养3d，获得种子液，将种子液以5%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速120r/min的条件下培养5d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：蔗糖25g.L-1+缬氨酸3g.L-1+异亮氨酸3g.L-1+苏氨酸3g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例7
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得种子液，将种子液以10%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养8d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：麦芽糖20g.L-1+谷氨酸2g.L-1+天冬氨酸4g.L-1+甘氨酸6g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为65%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为65%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例8
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得种子液，将种子液以10%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养10d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：葡萄糖28g.L-1+缬氨酸2g.L-1+异亮氨酸2g.L-1+丝氨酸2g.L-1+天冬氨酸2g.L-1+甘氨酸2g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为85%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为85%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例9
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养5d，获得种子液，将种子液以10%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速150r/min的条件下培养8d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：葡萄糖30g.L-1+缬氨酸2g.L-1+异亮氨酸2g.L-1+丝氨酸2g.L-1+天冬氨酸2g.L-1+甘氨酸2g.L-1+豆粕2 g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在70℃减压浓缩后加入5倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
实施例10
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在30℃、转速150r/min的条件下培养3d，获得种子液，将种子液以6%的接种量接种到发酵培养基中，在25℃、转速200r/min的条件下培养5d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：乳糖30g.L-1+缬氨酸5g.L-1+蛋白胨3g.L-1+玉米浆2g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0；
（2）采用10000r/min的转速将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，80℃减压浓缩后加入3倍体积的乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂D-101吸附，然后依次用蒸馏水和浓度为75%的乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入浓度为75%的乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
Claims (6)
1.一种采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备银耳菌的发酵培养物：挑取银耳菌种子接种于种子培养基中，在20~30℃、转速100~200r/min的条件下培养2~5d，获得种子液，将种子液以5~10%的接种量接种到发酵培养基中，在20~30℃、转速100~200r/min的条件下培养4~10d，获得银耳菌发酵培养物，所述种子液培养基和发酵培养基相同，其组成为：碳源20~30g.L-1+氮源5~15g.L-1+磷酸二氢钾 0.46g.L-1+磷酸氢二钾1.0g.L-1+硫酸镁1.0g.L-1，pH6.0，所述碳源和氮源为适合银耳菌生长的碳源和氮源；
（2）将发酵培养物中的发酵液和菌丝体分离，取发酵液，在40℃~80℃减压浓缩后加入无水乙醇以除去多糖和蛋白质，高速离心除去沉淀；
（3）将（2）步骤制得的发酵液浓缩后采用大孔树脂吸附，然后依次用蒸馏水和乙醇洗脱，收集洗脱液，将其浓缩后低温结晶得粗晶体；
（4）将粗晶体放入乙醇溶液中进行重结晶，所获得的棕红色晶体即为卵孢菌素晶体。
2.根据权利要求1所述的采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于：（1）步骤中培养基所采用的碳源为葡萄糖、蔗糖、，乳糖或麦芽糖，氮源为有机氮源或/和氨基酸。
3.根据权利要求2所述的采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于：所述有机氮源为豆粕、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉中的一种或几种的组合，所述氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于：（2）步骤中所加入的乙醇体积为浓缩后发酵液体积的2~5倍。
5.根据权利要求1所述的采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于：（3）步骤中洗脱时所用乙醇的浓度为55~95%。
6.根据权利要求1所述的采用银耳菌制备卵孢菌素晶体的方法，其特征在于：（4）步骤中所用乙醇的浓度与（3）步骤所用乙醇的浓度相同。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN106942224A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-07-14 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 卵孢菌素在制备生物农药中的应用 |
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| CN102168108A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-08-31 | 广东省微生物研究所 | 一种深红虫草及利用其制备卵孢菌素的方法和其用途 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121003 |