CN102703417B - 载细胞生物微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

载细胞生物微胶囊的制备方法，制备步骤为：a.将阴离子表面活性剂与油相混合，制备得到油包水型反相乳液体系，将油相混合于阴离子表面活性剂中得到油包水型反相乳液体系，使混合液呈现乳白色，室温放置30分钟不分层；b.对阳离子聚电解质多糖进行降解处理，得到分子量为未降解之前三分之二的阳离子聚电解质多糖；c.向步骤a制备的油包水型反相乳液体系中加入经步骤b降解处理后的低分子量阳离子聚电解质多糖，通过自组装反应聚合成囊；d.将步骤c所得的含囊乳液体系固液分离，得到固体微胶囊。

Description

载细胞生物微胶囊的制备方法

技术领域

本发明属于辅料、载体制备技术领域，特别涉及一种制备载细胞生物微胶囊的方法。

背景技术

对组织工程而言，现已发现将干细胞或相关细胞通过载体植入坏死骨的表面能够有效的治疗骨坏死；对生物工程而言细胞载体可以避免体内相关蛋白的干扰，正确到达病灶部分，实现局部用药；对临床应用而言，颗粒运载细胞更易实施手术，保证治疗过程中细胞的活性。

将无免疫抑制的天然产物制成微胶囊，可以解决组织工程，生物工程和临床应用面临的很多问题，对生物医学领域具有一定的积极意义。作为无免疫抑制的天然产物，天然多糖由于其优越的性能一直是学界研究的对象，十年来文献中大量报道了有关天然多糖在生物医学方面的应用，例如Lee等以海藻酸钠为囊材负载胰岛素，Lim等人将微囊化技术与组织细胞移植相结合，制备海藻酸钠/聚赖氨酸（APA）微胶囊作为免疫隔离工具，这些研究成果较好的解决了组织细胞移植过程中的免疫排斥问题，避免或减少了昂贵的免疫抑制剂的使用，为组织细胞移植治疗神经/内分泌系统疾病提供了新思路。但由于制备技术和材料的限制，这些方法制备的载细胞胶囊无法达到理想效果，往往存在细胞生长困难，细胞间信息传递受阻等问题，使该类胶囊在实际应用中受到局限，近几年对该类胶囊载细胞的研究渐渐减少，而转向其他方面如Kaddoumi等以改性聚乙二醇制备载细胞颗粒，用于组织工程修复的临床研究。

对于传统材料，制备胶囊的技术包括物理方法、化学方法和物理化学方法，各类方法中乳液法和喷雾干燥法较为常用，喷雾干燥法成囊粒径均一，大小在微米到毫米范围内可控，但无法实现一步形成多孔中空颗粒，比较而言乳液法操作简单无需特殊设备因此使用广泛。而目前乳液法的使用虽被广泛报道，但仅局限于无机物和某些化学合成的高分子物质，如Peter Ma等结合细胞反应器和乳液聚合两种技术，对聚乳酸微囊进行研究，发现具有三维结构的多孔聚乳酸微囊成囊效果理想，大小均一，且细胞在其表面生长状态良好。但报道中，乳液体系和细胞微载体所使用的材料不具备天然产物的良好生物相容性且会引起免疫系统响应，不是理想的生物医用材料，无法推广应用。因此，解决制备方法、材料和实际应用之间的矛盾，将是当前生物材料领域的重大课题，若能以理想的制备方法和理想的材料制备具有三维多孔结构的细胞微囊化载体将对组织工程，制药，和生物医学等领域均能起到良好的推动作用。

发明内容

解决的技术问题：本发明所要解决的技术问题是针对以上传统工艺中存在制备方法，材料和实际应用之间的矛盾，提出一种制备纳米载药生物微胶囊的方法。本发明采用的材料价格低廉易获取，涉及的新技术，路线简单，技术含量高，且产品载细胞量大，隔离和自降解性能好，对细胞和生物体无毒，有望取代现阶段所使用的传统材料和制备方法，解决了当前同类材料在胶囊的制备过程中大小不一，难以中空，尺寸不适，使用上存在着高泄漏，高风险的问题。

技术方案：制备载细胞生物微胶囊的方法，制备步骤为：a.将阴离子表面活性剂与油相混合，制备得到油包水型反相乳液体系，所述的油包水型反相乳液体系，其油相为：石蜡油，环己烷或辛烷中的一种，阴离子表面活性剂为：直链烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸盐、烷基磺酸盐、α-磺基单羧酸及其衍生物、脂肪酸磺烷基酯、脂肪酸磺烷基酰胺、琥珀酸双酯磺酸盐、硫酸酯盐、烷基甘油醚磺酸盐和磷酸酯盐中的一种或几种，将油相混合于阴离子表面活性剂中得到油包水型反相乳液体系，使混合液呈现乳白色，室温放置30分钟不分层；b.对阳离子聚电解质多糖进行降解处理，得到分子量为未降解之前三分之二的阳离子聚电解质多糖；c.向步骤a制备的油包水型反相乳液体系中加入经步骤b降解处理后的低分子量阳离子聚电解质多糖，加入量不超过乳液体系总质量的50%，通过自组装反应聚合成囊；d.将步骤c所得的含囊乳液体系固液分离，得到固体微胶囊。

所述烷基磺酸盐为伯烷基磺酸盐或仲烷基磺酸盐。

所述的阳离子聚电解质多糖为明胶、聚氨基葡萄糖、羟甲基壳聚糖、壳聚糖和壳寡糖中的一种或几种混合物。

有益效果：

本技术方案提出的以乳体系为成囊环境，以阴离子表面活性剂为分散剂和初步聚合剂，对降解后的低分子量阳离子聚电解质多糖进行表面铰链成囊。以壳聚糖为例，降解后的低分子量壳聚糖可以在微乳体系中形成微胶束，在胶束反应器中，降解后的低分子量壳聚糖为核与阴离子表面活性剂和阴离子聚电解质通过正负离子聚合成外表面，该类胶囊成三维中空多孔结构，在生物材料领域具有极高的应用前景，将成为一类新型细胞载体。

微胶囊的合成可以分为具阴离子表面活性剂的油相体系制备、低分子量聚阳离子电解质多糖水溶液的乳化、胶囊的自组装反应三个步骤。所述的低分子量聚阳离子电解质多糖水溶液在阴离子表面活性剂的油相体系中发生初步铰链，在低分子量聚阳离子电解质多糖外层复合成网状结构。其中单个纳米颗粒粒径一般在130μm左右。该类胶囊避免了某些复合微球由高分子材料（如聚苯乙烯等）或半高分子材料（如聚乙二醇等）包埋细胞的复杂步骤，且粒径均匀，分散性好，可通过搅拌速度、反应时间、清洗方法进一步控制颗粒的大小，膜的厚度及孔隙绿等成囊因素。

针对微乳体系可能会在胶囊内残留乳化剂和助乳化剂的问题，本文对胶囊进行了生物相容性评价，通过细胞毒性试验和动物全身毒性试验，研究者发现细胞在细胞载体微囊中的相对增殖度在七天中从71.33%提高到96.97%，说明材料溶出物对细胞没有伤害，毒性较小。通过全身急性毒性试验观察小鼠，发现小鼠运动饮食均正常，未见腹部刺激症状，眼睑下垂，等不良特征，小鼠各项指标均符合《医疗器械监督管理和评价》2008年2月第一版中《医疗器械临床研究标准（ISO14155－1996）》中的详细描述。实验结果证实，低分子量壳聚糖微胶囊并无急性毒性作用，生物相容性好。

附图说明

图1为胶囊结构示意图，聚阳离子多糖核1，离子交联壳2；

图2为胶囊的SEM照片细胞在胶囊内生长情况染色照片；微囊的SEM照片（a）和养细胞后，亚甲基橙染色照片（b），亮色为活细胞，深色为死细胞。

图3为载溶血酶A1的微囊中酶活的测定。

具体实施方式

实施例1：

一、对阳离子聚电解质多糖如明胶、聚氨基葡萄糖、羟甲基壳聚糖、壳聚糖和壳寡糖进行降解处理，以羟甲基壳聚糖、壳寡糖和明胶为例说明：

以羟甲基壳聚糖制备低分子量羟甲基壳聚糖：

反应在非均相体系中进行，羟甲基壳聚糖首先分散于去离子水中，然后以质量比1：1加入双氧水，于恒温水浴中进行降解反应，控制反应时间为8-10小时以控制产物分子量，具体降解反应的步骤如下：根据实验要求安装好实验仪器后，加入称取的(3.000g) 羟甲基壳聚糖，随后以质量比25：1（W：W）加入去离子水75g，加入双氧水78g，将壳聚糖充分分散，加热升温至75℃到85℃之间，搅拌均匀，使羟甲基壳聚糖恒温反应至溶液颜色由无色转为黄绿，停止反应。滤去不溶性物质，调滤液的pH值至8，过滤，将滤液在旋转蒸发器上50℃减压蒸发浓缩至原体积的三分之一左右，用9倍滤液体积的无水乙醇沉淀，90%乙醇洗涤两次，50℃以内减压干燥，最后得到水溶性的低分子量壳聚糖。利用旋转粘度计测定其分子量。使降解后的阳离子多糖分子量为初始分子量的三分之二。

以壳寡糖制备低分子量壳寡糖：

反应在非均相体系中进行，壳寡糖首先分散于去离子水中，然后以质量比1：1加入双氧水，于恒温水浴中进行降解反应，通过调整反应时间来控制产物分子量，具体降解反应的步骤如下：根据实验要求安装好实验仪器后，加入称取的(3.000g)羟甲基壳聚糖，随后以质量比10：1加入去离子水30g，加入双氧水33g，将壳寡糖充分分散，加热升温至75℃到85℃之间，搅拌均匀，使壳寡糖恒温反应5小时，至溶液颜色由无色转为黄绿，停止反应。滤去不溶性物质，调滤液的pH值至8，过滤，将滤液在旋转蒸发器上50℃减压蒸发浓缩至原体积的三分之一左右，用9倍滤液体积的无水乙醇沉淀，90%乙醇洗涤两次，50℃以内减压干燥，最后得到水溶性的低分子量壳寡糖。利用旋转粘度计测定其分子量。使降解后的阳离子多糖分子量为初始分子量的三分之二。

以明胶制备低分子量明胶：

在均相体系中进行明胶的降解，首先将干燥过的明胶溶于去离子水中，配置成浓度为2％wt的溶液，加热至100℃，冷却至室温后平行取三份2％wt的明胶均相溶液10mL，平铺于18cm²×8cm²的平板上，在紫外仪中降解，自行选取降解模式，紫外光强度为48W，波长为312nm，每平方厘米的照射量为0.120J/cm² 。利用旋转粘度计测定其分子量。使降解后的阳离子多糖分子量为初始分子量的三分之二。

二、微囊的制备：固定油相（O）的加入量，利用阴离子表面活性剂，其中油相可以为石蜡油，环己烷或辛烷中的一种，阴离子表面活性剂可以为直链烷基苯磺酸钠(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基磺酸盐(AS和SAS)、α—磺基单羧酸及其衍生物(MES)、脂肪酸磺烷基酯(1geponA)、脂肪酸磺烷基酰胺(1gepon T)、琥珀酸双酯磺酸盐、硫酸酯盐、烷基甘油醚磺酸盐(AGS)或磷酸酯盐，在混合液中滴加低分子量阳离子聚电解质多糖，使其在阴离子表面活性剂的作用下自组装成囊，其中所得油包水型反相乳液体系呈现乳白色，室温放置30分钟不分层。

石蜡油、α-烯烃磺酸盐(AOS)和低分子量羟甲基壳聚糖溶液：

将α-烯烃磺酸盐(AOS) 分散于石蜡油中，石蜡油与α-烯烃磺酸盐(AOS)的质量比例为3：1，低速搅拌（50转/秒以上，500转/秒以下）的过程中分散低分子量羟甲基壳聚糖溶液于石蜡油/α-烯烃磺酸盐(AOS)中，在搅拌的条件下制成混合体系。所述在搅拌条件下向体系中滴加低分子量羟甲基壳聚糖溶液，溶液浓度控制在7%wt以下1%wt以上，滴加量为上述油包水型反相乳液体系质量的20－30％，搅拌至少十分钟，自组装成囊。停止搅拌，将混合体系自然沉淀分离，取出沉淀以90％的乙醇洗涤，过滤得到微胶囊。如图1所示。该制备方法技术简单易操作，形成的颗粒粒径分布均匀，颗粒不团聚不粘连易于分离并具有良好的生物相容性是理想的细胞载体颗粒。

以环己烷、脂肪酸磺烷基酰胺(1gepon T)、琥珀酸双酯磺酸盐和低分子量壳寡糖的溶液制备颗粒：

将脂肪酸磺烷基酰胺(1gepon T)：琥珀酸双酯磺酸盐以任意比例混合（S混合液），将S混合液与环己烷以1：3（质量比）混合，低速搅拌（50转/秒以上，500转/秒以下）的过程中分散低分子量壳寡糖于脂肪酸磺烷基酰胺(1gepon T)/琥珀酸双酯磺酸盐/环己烷溶液中，所述分散的过程中滴加的低分子量壳寡糖溶液，溶液浓度控制的7%wt以下，滴加量为上述油包水型反相乳液体系质量的20－30％，继续搅拌10分钟以上，自组装成囊。停止搅拌，将混合体系自然沉淀分离，取出沉淀以90％的乙醇洗涤，过滤得到微胶囊。图2为溶液中胶囊的SEM照片。该制备方法技术简单易操作，形成的颗粒粒径分布均匀，颗粒不团聚不粘连易于分离并具有良好的生物相容性是理想的细胞载体颗粒。

三、对比例的研究。不对聚电解质多糖进行技术处理，将没有降解的壳寡糖直接加入乳化体系，

考察未降解壳寡糖能否制成均匀微囊：

以石蜡油为油相，利用阴离子表面活性剂烷基甘油醚磺酸盐(AGS)和磷酸酯盐，以阴离子表面活性剂烷基甘油醚磺酸盐(AGS)与磷酸酯盐任意比混合液为S组分，石蜡油与S组分混合液的比例为3：1（质量比），在50转/秒以上，500转/秒以下保持匀速搅，在搅拌条件下向体系中滴加未降解过的壳寡糖溶液，浓度同上述的使用量，滴加量为上述体系体积的20－30％，继续搅拌十分钟以上，形成粘连颗粒，或块状凝胶无法形成乳化体系亦无法成囊。

四、在乳化体系中可制备包埋细胞或酶类物质的胶囊，并对胶囊进行荧光发光观察和酶性能的考察。

考察微乳体系中制备载细胞微胶囊的过程：

以乳化体系制备载细胞的微胶囊

将细胞与低分子量壳聚糖水溶液共混制备成细胞个数不低于10²个/mL，不高于10⁶个/mL的均相体系，制备时注意不能急速搅拌。将载细胞的均相体系分散于含有阴离子表面活性剂磷脂盐的石蜡油溶液中，使细胞/壳聚糖混合液与含阴离子表面活性剂的石蜡油溶液体积比为1：1，匀速搅拌（50转/秒以上，500转/秒以下），30min内停止搅拌，将体系低速离心（不高于1000rpm/min）2分钟，过滤得到载细胞微胶囊。

胶囊对细胞生长的影响

将载细胞微囊培养于九十六孔板相应的细胞培养液中，在第一天，第四天，第七天用MTT试剂盒对载细胞微胶囊染色，加入20 μL/孔的MTT ( 2mg/mL)液，继续培养6h抛弃孔内的培养液和样品，用PBS溶液洗涤孔内残余样品两到三次，加入150μL /孔的DMSO，震荡l0min，在免疫酶标仪上以490nm波长测定吸光度。根据以下公式计算细胞的相对增殖度(RGR)：

RGR=（实验组平均吸光度 / 阴性对照组平均吸光度）×100%

通过酶标仪检测微囊中细胞的OD值从而推断细胞在微囊中的增殖情况。微囊内细胞的亚甲基橙染色照片如图2。

考察乳液体系中制备溶血磷脂酶A1微胶囊的过程：

以乳液体系制备溶血磷脂酶A1微胶囊

取0.5mL酶液与5mL 3%wt低分子量羟甲基壳聚糖溶液共混制备成均相体系。将包埋溶血酶A1的均相体系分散于含有阴离子表面活性剂AOT的环己烷溶液中，使阴离子表面活性剂和油相的比例为1：3（质量比），继续搅拌形成低分子量羟甲基壳聚糖/溶血磷脂酶A1水溶液为水相，同时包含油相和表面活性剂的反相W/O乳液体系，分散30分钟，继续以500转/秒以上搅拌，反应30分钟，停止反应，将体系离心分离，过滤得到微胶囊。

胶囊对溶血磷脂酶A活力的研究

以5%wt的新鲜蛋黄5mL 为底物，以10mL 0.05 mol/L的Tris-HCl 为缓冲溶液，加入5mL 0.01 mol/L 的去氧胆酸钠，5mL 25mmol/L 的CaCl₂，加入实验所用量的酶液，50℃恒温振荡，在10min 时间内用0.1 mol/L 的NaOH 滴定，保持恒定pH 值，测定所消耗的NaOH体积。酶活力单位定义为，在上述条件下每分钟释放1μmol 游离脂肪酸的酶量，为一个酶学单位( μ) 。

精密称取微胶囊适量，以上述方法测定一周内的酶活，绘制酶活半衰期曲线。见图3。

五、对胶囊进行生物相容性评价

对胶囊进行小鼠全身急性毒性，细胞毒性试验，采用（石蜡油、α-烯烃磺酸盐(AOS)和低分子量羟甲基壳聚糖）和（环己烷、脂肪酸磺烷基酰胺(1gepon T)、琥珀酸双酯磺酸盐和低分子量壳寡糖）中制备的胶囊。

小鼠全身毒性试验

本实验是一种非特异性急性毒性试验，将实验材料或材料浸提液通过动物静脉或腹腔注射到动物体内，观察其生物学反应以判定材料的急性毒性作用。

选择未经过任何其他实验的昆明小白鼠十只，每只重约23g-25g，实验前在同一环境条件下，使用同一饲料培养3日，在此期间体重不减轻，精神、食欲、排泄等无异常现象。以0.9%氯化钠溶液为阴性对照，考察低分子量羟甲基壳聚糖胶囊浸提液的生物相容性。浸提液制备方法为：在制作浸提液前，先用与阴性对照同一批号的灭菌0.9%氯化钠溶液冲洗3遍，浸提液按照“试样” ：“灭菌0.9%氯化钠溶液”＝0.1（g）：1（mL）（W/V）浸提，外部条件为：恒温摇床上于37 ±0.15 ℃，50 r·min ^{- 1}振摇，浸提时间为48h。

将昆明小鼠分为两组每组五只，为两组小鼠分别注射灭菌0.9%氯化钠溶液和材料浸提液，注射量为每公斤50mL（50mL/kg），将两组昆明小鼠称重并在同一环境条件下，使用同一饲料培养24h、48h、72h分别称量小鼠的体重。记录小鼠有无不良反映。经观察试验组中一只小鼠在四小时有轻微运动能力减退的现象18小时后又恢复正常其他小鼠均没有出现异常情况。符合《药典》的相关规则。

Claims (1)

1.载溶血磷脂酶A1的生物微胶囊的制备方法，其特征在于制备步骤为：以羟甲基壳聚糖制备低分子量羟甲基壳聚糖：反应在非均相体系中进行，羟甲基壳聚糖首先分散于去离子水中，然后以质量比1:1加入双氧水，于恒温水浴中进行降解反应，控制反应时间为8-10小时以控制产物分子量，具体降解反应的步骤如下：根据实验要求安装好实验仪器后，加入称取的3.000g 羟甲基壳聚糖，随后以质量比25:1加入去离子水75g，加入双氧水78g，将羟甲基壳聚糖充分分散，加热升温至75℃到85℃之间，搅拌均匀，使羟甲基壳聚糖恒温反应至溶液颜色由无色转为黄绿，停止反应；滤去不溶性物质，调滤液的pH值至8，过滤，将滤液在旋转蒸发器上50℃减压蒸发浓缩至原体积的三分之一，用9倍滤液体积的无水乙醇沉淀，90%乙醇洗涤两次，50℃以内减压干燥，最后得到水溶性的低分子量羟甲基壳聚糖；取0.5mL溶血磷脂酶A1与5mL 3%wt低分子量羟甲基壳聚糖溶液共混制备成均相体系；将包埋溶血磷脂酶A1的均相体系分散于含有阴离子表面活性剂AOT的环己烷溶液中，使阴离子表面活性剂AOT和油相的质量比为1:3，继续搅拌形成低分子量羟甲基壳聚糖/溶血磷脂酶A1水溶液为水相，同时包含油相和阴离子表面活性剂AOT的反相W/O乳液体系，分散30分钟，继续以500转/秒以上搅拌，反应30分钟，停止反应，将体系离心分离，过滤得到微胶囊。