CN102702302B

CN102702302B - 一种丹参酮i类衍生物及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN102702302B
Application number: CN201210184490.6A
Authority: CN
Inventors: 金辉; 李慧; 毛声俊; 马伟从; 陈叶桐; 刘诗雨
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: CN102702302A

Abstract

本发明涉及丹参酮Ⅰ类化合物及其制备方法和应用，其中丹参酮Ⅰ类化合物特征为其特征是在丹参酮I分子A环的不同位置上引入各种类型的取代基，选择性的保留丹参酮I分子C环上的羰基的数量，以及将丹参酮I分子D环还原为二氢呋喃环。其制备方法为：使用使用苯乙烯类化合物与对苯醌发生Diels-Alder反应经过分离纯化后得到关键骨架—菲醌类化合物；然后与烯胺反应使菲醌骨架引入呋喃环，再通过酸化水解，氧化反应得，经过分离纯化后得到目标产物——丹参酮Ⅰ类化合物，丹参酮Ⅰ类化合物经催化氢化可以得到二氢丹参酮I类化合物。通过细胞毒性研究和药理研究结果表明该类化合物细胞毒性。因此丹参酮类化合物有着非常广阔的临床应用前景，有望将其作为一种新的抗肿瘤用药。

Description

一种丹参酮I类衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其是一种制备抗肿瘤的丹参酮I衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

丹参为唇形科植物丹参（SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE）的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，入药历史悠久。丹参味苦、微辛，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、养血安神、凉血消肿的作用。

随着化学、分子生物学等技术方法的飞速发展，人们对中药丹参复杂化学成分的研究也不断深入。根据现有研究结果，丹参由脂溶性与水溶性两类化学成分构成。其中，丹参酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ等为丹参主要有效成分，在高血压、冠状动脉疾病、心肌梗死、脑血栓等心血管疾病的临床治疗中发挥重要作用。研究表明，丹参酮具有天然抗氧化作用、可降低钙超载、抑制中性粒细胞的活化及心肌细胞凋亡、清除氧自由基，从而起到防治心肌再灌注损伤、减少脑损伤的作用；丹参酮类的邻醌或对醌结构易与其二酚类衍生物发生互变，在氧化还原转变过程中引起电子传递作用；同时，其代谢产物容易作为生物反应的辅酶参与多种生化反应，主要表现为抗菌消炎等作用。此外，丹参酮还具有活血通经、改善肝脏微循环、温和的雌激素样作用以及镇静等中枢神经系统抑制作用。近年来，随着丹参酮药理作用研究的不断深入，其广泛的抗肿瘤活性逐渐被人们发现，并成为新的研究热点。

但是，现目前获得丹参酮类化合物主要是通过提取后分离丹参中天然的丹参酮类化合物，在研究丹参酮类化合物药学活性时存在以下缺陷限制了其在临床上的运用：1. 丹参酮单一化合物从天然植物中提取及分离必须综合使用吸附，沉淀，萃取，离子交换和色谱等多项技术，其收率非常低，成本造价太高。2. 天然存在的丹参酮类化合物绝大多数水溶性极低，口服使用生物利用度较低；同时也难以制成其他适宜的给药剂型。3. 目前合成丹参酮类化合物的路线均存在着成本较高、反应条件苛刻、路线偏长、对环境污染大等问题。

发明内容

本发明以丹参酮I为先导化合物，设计并合成出了一系列新型化合物，其特征是在丹参酮I分子A环的不同位置上引入各种类型的取代基，选择性的保留丹参酮I分子C环上的羰基的数量，以及将丹参酮I分子D环还原为二氢呋喃环；体外抗癌活性实验（MTT法）研究表明，本发明化合物均表现出对肿瘤细胞的增殖抑制作用，部分化合物的活性好于或等于阳性对照药物三氧化二砷，经初步药理实验表明，本发明化合物对裸鼠肿瘤细胞异体移植模型和小鼠肿瘤模型均有不同程度的抑制作用。

同时本发明还提供一种方法简单，不影响环境，工艺稳定，并宜于工业化生产的制备丹参酮I类衍生物的方法。

本发明化合物的结构通式如下式：

丹参酮I类衍生物通式 I

其中R₁~R₄表示：取代基可以在A环上有4个相同或不同取代基；

R₁~R₄代表的取代基为：氢、氯、溴、碘、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、氨基、C1~C4烷基单取代胺基、C1~C4烷基双取代胺基、C0~C4烷基（取代）苯基胺基、C0~C4烷基（取代）苄基基胺基、1-吗啉基、哌啶基、乙酰氨基、、N-脲基、N-硫脲基、胍基、硝基、三氟甲基、氰基、乙酰基、C1~C4烷基磺酰基、氨基磺酰基、C1~C4烷胺基磺酰基、烯丙胺基磺酰基、吗啉-1-基磺酰基、哌啶-1-1基磺酰基；

D环为二氢呋喃或呋喃环。

2. 权利要求1 的化合物，R₁~R₄取代基可以同时代表相同的取代基，也可以同时各自代表不相同的取代基。

3. 权利要求1 的化合物，其中R₁~R₄代表：氢、氯、溴、碘、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、氨基、C₁~C₄烷基单取代胺基、C1~C4烷基双取代胺基、C0~C4烷基（取代）苯基胺基、C₀~C₄烷基（取代）苄基基胺基、1-吗啉基、哌啶基、乙酰氨基。

4. 权利要求3的化合物，其中R₁~R₄代表：氢、碘、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、氨基、C₁~C₄烷基单取代胺基、C₁~C₄烷基双取代胺基1-吗啉基、哌啶基、乙酰氨基。

5. 权利要求4的化合物，其中R₁~R₄代表：氢、氨基、C₁~C₄烷基单取代胺基、C₁~C₄烷基双取代胺基1-吗啉基、哌啶基。

6．权利要求5的化合物药学上可接受的盐，其中药学上可接受的盐是通式I化合物与下列酸成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、碳酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、富马酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸。

本发明部分化合物是：

3-甲基-8-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-2）（代号 II-1，下同）

3-甲基-8-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-3）

3-甲基-9-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-4）

3-甲基-9-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-5）

3-甲基-9-甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-6）

3-甲基-9-氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-8）

3-甲基-9-（N-2-甲基）-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-9）

3-甲基-9-乙酰氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-10）

3-甲基-9,10-二甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-11）

3,4-二氢-3-甲基-8-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-2）

3,4-二氢-3-甲基-8-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-3）

3,4-二氢-3-甲基-9-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-4）

3,4-二氢-3-甲基-9-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-5）

3,4-二氢-3-甲基-9-甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-6）

3,4-二氢-3-甲基-9-氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-8）

3,4-二氢-3-甲基-9-（N-2-甲基）-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-9）

3,4-二氢-3-甲基-9-乙酰氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-10）

3,4-二氢-3-甲基-9,10-二甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-11）。

下面药理试验中的化合物的代号等同于此处的代号所对应的化合物结构。

本发明通式I化合物可以用以下方法制备。

A．取代苯乙烯与2-甲氧基1,4-对苯醌在溶剂中反应，纯化分离后得到化合物3-甲氧基-1,4-菲醌类化合物（3）；

B．化合物（2）碱性条件下脱去甲基，纯化分离后得到3-羟基-1,4-菲醌类化合物（4）；

C．化合物（4）与氯丙酮发生Feist-Benary反应，生成丹参酮I类化合物（6）；

D．丹参酮I类衍生物（6），经过过渡金属催化氢化反应，得到二氢丹参酮类化合物（6）

其中R₁的定义如权利要求1所述；R₃代表 O、(CH₂)_n n=1~3或R₃= 0。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，为Diels-Alder[4+2]成环反应，此反应根据前线轨道理论，双烯体（苯乙烯衍生物）的最高已充填轨道（HOMO）与亲双烯体（2-甲氧基-1,4-对苯醌）的最低未充填轨道（LUMO）相互匹配，在加热的条件下发生双分子协同的可逆反应。由于不涉及中间体-离子、自由基等，所以反应所需活化能相对较高（这意味着需要较高的温度），但由于双分子协同反应，区域选择性较好。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，我们以苯乙烯衍生物作为二烯体，由于是环外双键与环内双键共同组成的二烯体，所以可以预知的困难主要有以下两点：

1.当苯乙烯衍生物发生D-A反应时，势必要破坏苯乙烯衍生物的芳环结构。然而，众所周知，当形成芳环时分子轨道的能量将会下降，破坏芳环时分子轨道总能量亦将上。这意味着当苯乙烯作为二烯体发生D-A反应时，将会比其他不含有芳香成分的二烯体，如环戊二烯，更难反应。因此，可以预知的是，D-A反应这一步将会是非常困难的。

2.苯乙烯是广泛用于制造高分子化合物的聚合单体，因此较高温度下势必会发生聚合，从而降低产率。而这两点已被实验所证明。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，为了解决反应速率过慢的问题，我们尝试使用耐压反应装置为容器，在密闭的条件下加热最高至200摄氏度。由于且反应容器的密闭特性，苯乙烯衍生物无法逸出，故而减少了苯乙烯的浪费。与此同时，大幅升高反应温度所导致的速率提升造成了反应时间的大大缩短（表1）。

表1.D-A反应条件筛选

注：甲苯,200℃ 回流,指在加压装置下反应。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，所述耐压反应装置是指一般从事合成领域人员所理解的常用装置，如高压釜、封管等。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，所述的有机溶剂选自甲苯、二甲苯、苯、硝基苯、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲醇、乙醇或丙醇中的一种或几种，优选离子液体、甲苯和二甲苯。反应温度室温~300℃，优选50~200℃。

根据权利要求7中制备化合物（3）所述方法，D-A反应中，由于底物对苯醌中甲氧基的存在，使得反应加成过程中存在区位选择性问题，即甲氧基的位置可能在C2位或C3位，由此可能生成两种差别很小的同分异构体。学术界对甲氧基的位置一直存在普遍争议。Schmalle等[Cryst,1986,C42:1039]于1986年对其合成的一系列菲醌衍生物进行了X-ray分析，结果测得大多数化合物的甲氧基取代位于C2位。本发明为证实此结果，将3-甲氧基-8-氯-1,4-菲醌的单晶进行了X-ray分析，晶体结构证明，化合物7的甲氧基取代发生在C-2位，为目标产物。

3-甲氧基-8-氯-1,4-菲醌的单晶结构

根据权利要求7中制备化合物（4）所述方法，所述脱甲基的条件是碱性条件，此处所应用的碱是指一般从事合成领域人员所理解无机强碱及有机强健化合物，包括氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钙、氢化钠、氢化钙、氰化钾、低级脂肪醇钠、低级脂肪醇钾、碳酸钠、碳酸钾等。反应溶剂为水、低级脂肪醇或二者的混合物。反应温度室温~300℃，优选50~150℃。

根据权利要求7 中制备化合物（6）所述方为Feist-Benary反应，参考文献[J.Med.Chem.,2006,49:5631-5634.]，我们选择以氯丙酮做为α-卤代酮，在弱碱性溶液醋酸-醋酸铵溶液中，进行反应。

根据权利要求7 中制备化合物（7）所述方法，过渡金属可选自镍、钯、载体吸附的钯或者铂及氧化态的铂，优选雷尼镍和钯碳。

部分化合物的药理活性测试实验如下：

权利要求1制备的化合物，进行了多种肿瘤细胞的增殖抑制研究，表1列出部分化合物对K562细胞的IC50值。与空白实验组相比，各组药物的OD值均存在不同程度的下降。其中，其作用24h的OD值在浓度1 μg/ml时即与空白对照组出现统计学差异。将不同浓度的各组药物在不同的时间点对细胞的抑制率作折线图。所有化合物的细胞生长抑制率随浓度的增加与时间的延长呈现上升趋势。其中，部分化合物的细胞生长抑制率在1 μg/ml时作用强度稍低于1 μg/ml亚砷酸组。

表1 部分化合物对K562细胞的IC50值

SMMC-7721人肝癌荷瘤裸鼠模型的抗肿瘤试验：将对数期的SMMC-7721细胞经0.25%胰酶消化分散、细胞计数后，调整细胞浓度制备4×10⁷个/ml的细胞悬液。取4~6周龄BALBC/c裸鼠，安尔碘右前肢腋下消毒，皮下接种SMMC-7721细胞悬液细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况。接种次日分组给药，组别为模型对照组、阳性对照组、供试品组，每组15只。分别给予PBS溶液、受试药物0.01mmol/kg， As₂O₃1.2mg/kg，每天1次，连续2周，3周后将裸鼠脱颈处死，取瘤体称重，计算抑瘤率，抑瘤率（%）＝［1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重］×100%。

表2 部分化合物对SMMC-7721人肝癌荷瘤裸鼠模型的抗肿瘤试验

药理实验结果表明，通式I化合物及其药学上可接受的盐对多种恶性肿瘤有不同程度的抑制作用，因此，通式I化合物及其药学上可接受的盐可以在临床上用于多种肿瘤有关的临床病症。这些病症包括：各种恶性肿瘤如，乳头状癌，腺癌，囊腺癌，混合癌，移行上皮癌，基底细胞癌，脂肪肉瘤，平滑肌肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，血管肉瘤，淋巴管肉瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，滑膜肉瘤，多形胶质母细胞瘤，成髓细胞瘤，恶性神经鞘瘤，成神经节细胞瘤，脑膜肉瘤，何杰金氏病、非何杰金氏病白血病，多发骨髓瘤，绒毛上皮癌，恶性葡萄胎，精原细胞瘤，胚胎性癌，恶性畸胎瘤，恶性黑色素瘤背部脂肪瘤，面部血管瘤、子宫平滑肌瘤等，乳头状瘤，如膀胱头状瘤、阴茎乳头状瘤等，胃肠道腺瘤、甲状腺瘤、乳腺腺瘤等，卵巢囊腺瘤。

一种用于抗肿瘤的药用组合物，含有通式I化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。所所述药用组合物可以是普通片剂或胶囊、缓释片剂或胶囊、控缓释片剂或胶囊、口服液、注射剂、乳剂等药剂学上常规的制剂形式。

具体实施例

下面通过实施例具体说明本发明，但本发明并不只局限于下面的例子。

实施例一 3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮

于高压釜中，依次加入2-甲氧基-1,4-对苯醌（0.5mmol），邻甲基苯乙烯（3mmol），另加入适量甲苯使二者混合均匀，封口，不加外压，加热至200℃，搅拌反应3h。TLC检测反应完全。反应液冷却，硅胶色谱柱分离，展开剂为二氯甲烷：石油醚（2:5）。得橘红色固体59mg，产率65%。1H NMR ( CDCl3, 400 Hz, TMS ): δ2.744 (s,3H), 3.942 (s,3H), 6.147(s,1H), 7.474(d,1H,J=6.8Hz), 7.628(t,1H, J=16Hz), 8.224(d,1H,J=8.4Hz), 8.398(d,1H, J=9.2Hz), 9.401(d,1H, J=8.8Hz)。

实施例二、三、四的制备方法此一致。

实施例二 3，6，7-三甲氧基-1，4-菲二酮

底物为相应苯乙烯衍生物与2-甲氧基-1,4-对苯醌，得橘红色固体107.4mg，产率60%。1H NMR ( CDCl3, 400 Hz, TMS ): δ3.920(s,3H,OCH3), 4.051(s,3H,OCH3), 4.110(s,3H,OCH3), 6.102(s,1H,AR-H), 7.121(s,1H, AR-H), 7.952(d,1H, J=8.8Hz, AR-H), 8.11(d,1H, J=8.4Hz, AR-H), 9.145(s,1H, AR-H)。

实施例三 3，6,-二甲氧基-1，4-菲二酮

底物为相应苯乙烯衍生物与2-甲氧基-1,4-对苯醌，得橘红色固体120.5mg，产率65%。¹H NMR ( CDCl₃, 400 Hz, TMS ): δ3.940(s,3H), 4.002(s,3H), 6.138(s,1H), 7.290(dd,1H,J=11.6Hz), 7.788(d,1H, J=9.2Hz), 8.064(d,1H, J=8.0Hz), 8.116(d,1H, J=8.4Hz),9.056 (d,1H,J=2.4Hz)。

实施例四 3-甲氧基-8-氯-1，4-菲二酮

底物为相应苯乙烯衍生物与2-甲氧基-1,4-对苯醌，得橘红色固体54.5mg，产率40%。1H NMR ( CDCl3, 400 Hz, TMS ): δ3.96（s,3H,-OCH3）, 6.19(s,1H,H-2,3), 7.66(t,1H,J=16.4Hz,H-6),7.75(d,1H,J=7.6Hz,H-7),8.32(d,1H,J=8.8Hz,H-10),8.73(d,1H,J=8.8Hz,H-9),9.51(d,1H,J=8.8Hz,H-5)。

实施例五3-甲氧基-6-乙酰氨基-1，4-菲二酮

底物为相应苯乙烯衍生物与2-甲氧基-1,4-对苯醌，得橘红色固体97.4mg，产率66%。1H NMR ( CDCl3, 400 Hz, TMS ): δ2.290(s,3H,CH3), 3.920(s,3H,CH3), 6.153(s,1H,AR-H), 7.654(s,1H,NH), 7.893(d,1H,J=8.8Hz, AR-H), 8.138(d,1H J=8.4Hz, AR-H), 8.154(d,1H, J=8.4Hz, AR-H), 8.436(d,1H, J=8.4Hz, AR-H),9.244(s,1H, AR-H)。

实施例六 3,8-二甲基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮 (I-1)

于圆底烧瓶中依次加入氢氧化钠（2.1mmol）、水（50ml）、3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮（0.4mmol）与无水乙醇（3ml），混合均匀，电热帽加热回流1h，TLC检测反应完全。反应液冷却，用0.5mol/L HCl的盐酸溶液调pH至3左右，乙酸乙酯提取（20ml×3），收集乙酸乙酯层，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得深红的固体95.3mg，产率89%，反应物直接用于下一步反应；

向圆底烧瓶中依次投入上一步反应物，甲苯10ml，冰乙酸（2mmol），醋酸铵（2mmol），氯丙酮（2mmol），乙醇（2ml），90℃加热回流，避光搅拌反应2h，TLC检测反应完全。反应液冷却，加入70ml水稀释，乙酸乙酯萃取（20ml×3），收集乙酸乙酯层，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。硅胶色谱柱分离，展开剂为石油醚-二氯甲烷（3:1），得红色固体88.32 mg，产率80%。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ2.278(s,3H,CH3),2.667(s,3H,CH3), 7.282(s,1H,CH),7.326(d,1H,J=8.8Hz,AR-H),7.526( t, 1H, J= 16Hz, AR-H), 7.758(d, 1H, J= 8.8Hz, AR-H), 8.257(d,1H,J=8.8Hz,AR-H),9.216(d,1H,J=9.2Hz,AR-H). MS ( m/z ): 277.2 [M+H]^＋。

实施例七 3-甲基-8-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-2）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 2.276 ( 3H, s); 7.321 ( 1H, s); 7.345 (1H, d); 7.617 ( 1H ,m); 7.789 ( 1H, d); 8.406 ( 1H, d); 9.231 ( 1H, d). MS ( m/z ): 297.2 [M+H]^＋。

实施例八 3-甲基-8-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-3）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 2.269 ( 3H, s); 7.289 ( 1H, s); 7.352 (1H, d); 7.579 ( 1H ,m); 7.779 ( 1H, d); 8.317 ( 1H, d); 9.211 ( 1H, d). MS ( m/z ): 341.2 [M+H]^＋。

实施例九 3-甲基-9-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-4）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 2.272 ( 3H, s); 7.256 ( 1H, s); 7.315 (1H, d); 7.567 ( 1H ,d); 7.790 ( 1H, d); 8.153 ( 1H, d); 9.231 ( 1H, d). MS ( m/z ): 297.7 [M+H]^＋。

实施例十 3-甲基-9-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-5）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 2.269 ( 3H, s); 7.285 ( 1H, s); 7.320 (1H, d); 7.558 ( 1H ,d); 7.767 ( 1H, d); 8.298 ( 1H, d); 9.224 ( 1H, d). MS ( m/z ): 341.2 [M+H]^＋。

实施例十一 3-甲基-9-甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-6）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.89g，收率为80%。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ: 2.394 ( 3H, s); 4.040 (3H, s); 7.301 (1H, d); 7.518 ( 1H, s); 7.790 ( 1H, d); 8.110 ( 1H, dd), 8.966 ( 1H, dd); 9.283( 1H, d). MS (m/z): 293.1[M+H]^＋。

实施例十三 3-甲基-9-氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-7）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。MS( m/z ): 278.2 [M+H]^＋。

实施例十四 3-甲基-9-（N，N-二甲氨基）-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-8）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ: 1.808 ( 3H, s); 2.834( 6H, s); 6.976 ( 1H, s); 7.345( 1H, dd); 7.514( 1H, s)；7.854 ( 1H, d); 7.890 ( 1H, d); 9.012( 1H, d) ; MS( m/z): 306.3 [M+H]^＋。

实施例十五 3-甲基-9-乙酰氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-9）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.84g，收率为80%。MS ( m/z ):306.3 [M+H]^＋。

实施例十六 3-甲基-9,10-二甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-10）

操作同化合物I-1，将相应的化合物替换3-甲氧基-8-甲基-1，4-菲二酮，得橙红色固体0.62g，收率为50%。。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ: 2.416 ( 3H, s); 4.053 ( 3H, s); 4.130 (3H, s); 7.093 ( 1H, s); 7.489 ( 1H, s); 7.958 ( 1H, d); 8.122 ( 1H, d); 9.271 ( 1H, d). MS ( m/z ): 323.1[M+H]^＋。

实施例十七 3,4-二氢-3,8-二甲基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（III-1）

1. 将3-甲基-8-甲基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-1）（0.48g,1.5mmol）使用甲苯为溶剂，加入5%重量的钯炭（24mg），氢气保护，50℃搅拌，过夜反应，过滤，25℃减压浓缩得到橙红色固体0.43g,收率为90%。（以下操作相同）¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 1.648 ( 3H, d); 2.078(1H, m); 2.667 ( 3H, s); 4.125(2H, m); 7.326 (1H, d); 7.526 ( 1H ,t); 7.758 ( 1H, d); 8.257 ( 1H, d); 9.216 ( 1H, d). MS ( m/z ): 279.2 [M+H]^＋。

2. 将3-甲基-8-甲基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（I-1）（0.48g,1.5mmol）使用甲苯为溶剂，加入5%重量的新鲜制备雷尼镍（36mg），氢气保护，50℃搅拌，过夜反应，过滤，25℃减压浓缩得到橙红色固体0.43g,收率为90%。

实施例十八 3,4-二氢-3-甲基-8-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-2）

操作与实施例二十七制备III-1相同。得到类红色，红色固体收率为90%。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ:1.645（3H, d）; 2.125(1H, m); 2.276 ( 3H, s); 4.087(2H, m); 7.367 (1H, d); 7.545 ( 1H ,t); 7.834 ( 1H, d); 8.421 ( 1H, d); 9.010 ( 1H, d). MS ( m/z ): 299.7 [M+H]^＋

实施例十九 3,4-二氢-3-甲基-8-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-3）

操作与制备III-1相同。得到类红色，红色固体收率为93%。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 1.698(3H, d); 2.245(1H, m); 2.269 ( 3H, s);4.245(2H, m); 7.334 (1H, d); 7.587 ( 1H ,t); 7.803 ( 1H, d); 8.307 ( 1H, d); 9.017 ( 1H, d). MS ( m/z ): 342.2 [M+H]^＋。

实施例二十 3,4-二氢-3-甲基-9-氯-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-4）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为90%。 ¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ: 1.681(3H, d); 2.145(1H, m); 2.271 ( 3H, s); 4.065(2H, m); 7.304 (1H, d); 7.346 ( 1H ,t); 7.651 ( 1H, d); 8.567 ( 1H, d); 9.132 ( 1H, d). MS ( m/z ): 299.1 [M+H]^＋。

实施例二十一3,4-二氢-3-甲基-9-溴-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-5）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为90%。¹HNMR (400MHz, CDCl₃) δ:1.687(1H, d); 2.087(1H, m); 2.269 ( 3H, s);4.128(2H, m); 7.423 (1H, d); 7.542 ( 1H ,m); 7.457 ( 1H, d); 8.108 ( 1H, d); 9.197 ( 1H, d). MS ( m/z ): 342.2 [M+H]^＋。

实施例二十二 3,4-二氢-3-甲基-9-甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-6）

将3-甲基-9-甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（0.48g,1.5mmol），加入10%重量的钯炭（48mg），氢气保护，50℃搅拌，过夜反应，过滤，25℃减压浓缩得到橙红色固体收率为90%。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ: 1.694(3H, d); 2.056(1H, m); 4.012(2H, m) 4.149 (3H, s); 7.321 (1H, d); 7.821 ( 1H, d); 8.164 ( 1H, dd), 8.175 ( 1H, dd); 9.012( 1H, d). MS(m/z): 295.4 [M+H]^＋。

实施例二十四 3,4-二氢-3-甲基-9-氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-7）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为92%。1.564 ( 3H, d);2.156(1H, m) 2.834( 6H, s); 4.132(2H, m), 4.808 ( 2H, s); 6.076 ( 1H, s); 7.345( 1H, d); 7.854 ( 1H, d); 7.890 ( 1H, d); 9.012( 1H, d) ; MS( m/z ): 280.2 [M+H]^＋。

实施例二十五 3,4-二氢-3-甲基-9-（N,N-甲胺基）-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-8）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为94%。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ: 1.564 ( 3H, d);2.12 (1H, m) 2.834( 6H, s); 3.945(2H, m), 6.823 ( 1H, s); 7.219( 1H, d); 7.831 ( 1H, d); 7.926 ( 1H, d); 9127( 1H, d); MS ( m/z ): 308.3 [M+H]^＋。

实施例二十六 3,4-二氢-3-甲基-9-乙酰氨基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-9）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为91%。操作同化合物I-1，得到橙红色固体0.62g，收率为50%。。¹HNMR( 400MHz, CDCl₃) δ:1.702（3H, d）; 2.046(1H, m) ; 2.416 ( 3H, s); 4.053 ( 3H, s); 4.130 (3H, s); 7.093 ( 1H, s); 7.489 ( 1H, s); 7.958 ( 1H, d); 8.122 ( 1H, d); 9.271 ( 1H, s). MS ( m/z ): 322.3 [M+H]^＋。

实施例二十七 3,4-二氢-3-甲基-9,10-二甲氧基-苯菲并[3,2-c]呋喃-1,2-二酮（II-10）

操作与制备III-1相同。得到红色，红色固体收率为87%。δ: 1.675(3H, d) ; 2.097(1H, m), 2.425 ( 3H, s); 3.987 ( 2H,m);4.068 (3H, s); 4.130 (3H, s); 7.123 ( 1H, s); 7.990 ( 1H, d); 8.122 ( 1H, d); 9.317 ( 1H, s).MS ( m/z ): 325.1[M+H]^＋。

实施例三十八细胞毒性试验

药液配制及分组

精密称取已合成得到的丹参酮Ⅰ衍生物适量，DMSO溶解，配制成一定浓度的储备液，加药前用RPMI-1640培养液（含10%灭活类标准胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）分别稀释成终浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/ml的药液（8.0 μg/ml 的各药物组中DMSO终浓度为0.03%，一般认为DMSO≤0.1%时，不引起细胞生物学形态改变）。实验以亚砷酸作为参比药物（终浓度为1 μg/ml）。各组药液均在无菌条件下配制，加药前过0.22μm微孔滤膜除菌。

细胞培养及加药方案

取人白血病K562悬浮于10-12 ml RPMI-1640培养液（含10%灭活类标准胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素）中，在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，每隔一天倾倒出旧培养液并更换新鲜培养基。取对数生长期细胞（细胞存活率大于97%），加入适量培养液调整细胞密度为5×10⁴个/ ml；取96孔板，分别向其中加入20μl不同浓度的各组药物及参比药物，随后每孔接种80μl细胞悬液，各实验组设6个复孔。实验设置空白对照组，向其中加入80μl细胞悬液与20 μl RPMI-1640培养液，并设置一组RPMI-1640培养液组作为调零组。

实施例三十九

取实施例七中制备的化合物0.5克，淀粉3.0克，糊精0.8克，微晶纤维素0.2克，用适量25%乙醇作润湿剂，制粒，压片。

Claims

1.一种丹参酮I类衍生物的制备方法，其通过如下方法制备：

取代苯乙烯（1）与2-甲氧基1,4-对苯醌（2）在溶剂中经D-A反应环合，纯化分离后得化合物（3）；化合物（3）在碱性条件下脱去甲基，纯化分离后得化合物（4）；化合物（4）与氯丙酮发生Feist-Benary反应得丹参酮I类化合物；

其中，R₁~R₄表示氢、氯、溴、碘、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、氨基、C1~C4烷基单取代胺基、C1~C4烷基双取代胺基、1-吗啉基、哌啶基、乙酰氨基、胍基、硝基、三氟甲基、氰基、乙酰基、C1~C4烷基磺酰基、氨基磺酰基、C1~C4烷胺基磺酰基、烯丙胺基磺酰基、吗啉-1-基磺酰基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，取代苯乙烯（1）与2-甲氧基1,4-对苯醌（2）在溶剂中经D-A反应环合得化合物（3）的具体反应容器为高压釜、封管；反应温度为室温~300℃。

3.根据权利要求2所述的方法，反应温度为50~200℃。

4.根据权利要求2所述的方法，所述溶剂选自甲苯、二甲苯、苯、硝基苯、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲醇、乙醇或丙醇中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的方法，所述溶剂选自离子液体、甲苯、二甲苯。

6.根据权利要求1所述的方法，所述碱性条件所用的碱选自氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、氢化钠、碳酸钠、碳酸钾。

7.根据权利要求6所述的方法，所述碱选自氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂。

8.根据权利要求1所述的方法，所述脱甲基的反应溶剂为水。

9.根据权利要求1所述的方法，所述脱甲基的反应温度为室温~300℃。

10.根据权利要求9所述的方法，所述反应温度为50-150℃。