CN102702130A - 含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物及其合成方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物及其在制备除草剂中的用途。如式(I)所示，该类化合物在体外对拟南芥乙酰乳酸合成酶(AHAS)的抑制作用，在体内对油菜根长的抑制作用，以及在盆栽实验上对油菜和反枝苋的除草效果，可用于制备新型靶向AHAS的除草剂。式中，当X为S时，R₁为H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃酰氨基、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基；R₂为H、邻或对位硝基、邻或对位卤素、邻或对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基、对位C₁-C₃烷氧基、3，4-苯并基；当X为O时，R₁为H、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基、4-吡啶基、3-吡啶基；R2为H、邻位硝基、对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基。

Description

含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物及其合成方法和用途

技术领域

本发明涉及一类含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物及其在制备除草剂中的用途，具体涉及到该类化合物在体外(in vitro)对拟南芥乙酰乳酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)的抑制作用，在体内(in vivo)对油菜根长的抑制作用，以及在盆栽实验上对油菜和反枝苋的除草效果。

背景技术

当今世界，人口过多造成严重的粮食短缺，并且由于环境保护的要求，人类需要除草剂继续发挥作用，但同时对环境不造成污染和负面影响，对人畜安全。因此，寻找作用于人畜体内没有的特异靶标进行农药分子设计是重要的除草剂研究开发策略。

乙酰乳酸合成酶AHAS催化支链氨基酸的生物合成是一个对哺乳动物高度安全的靶点(Duggleby，R.G.，et al.J.Biochem.Mol.Biol.2000，33(1)，1-36)。事实上，近30年来，广泛应用的磺酰脲、咪唑啉酮、嘧啶氧(硫)苯甲酸、三唑嘧啶磺酰胺等四大类正是靶向AHAS的除草剂，在世界范围的植物保护领域发挥了巨大的作用。但是，随着这些已有类型的除草剂广泛使用，杂草针对已知的四大类AHAS抑制剂逐渐产生抗性问题已不可忽视。因此，靶向AHAS设计全新结构的除草剂将成为刻不容缓的历史使命。

AHAS的三维晶体结构在本世纪初期被相继解析(Pang，S.S.，et al.J.Bio.Chem.2003，278，7639-7644；McCourt，J.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2006，103，569-573.)，使得人们有条件基于原有抑制剂的结合模式，理性设计新的AHAS抑制剂化合物。2007年，我们通过虚拟筛选的方法发现二硫醚类化合物是拟南芥AHAS抑制剂(Wang，J.G.，et al.Bioorg.Med.Chem.2007，15，374-380)。

2005年，韩国科学家Yoon小组通过高通量筛选的方法发现不对称二硫醚类化合物对肺结核病菌AHAS有抑制(Yoon，M.Y.et al.Febs Lett.2005，579，4903-4910)，之后又发现了该类化合物对感冒病菌的AHAS有抑制(Yoon，M.Y.et al.Arch.Biochem.Biophy.2007，466，24-30)。说明二硫醚类化合物有望成为新的AHAS抑制剂类型。

我们前期发现含三唑环的不对称芳香二硫醚类化合物对拟南芥AHAS有抑制活性，在平皿实验上表现出油菜根长的抑制，对抗性的拟南芥AHAS也有较好的抑制活性(王建国，尚君等，CN 201210055728.5)。在此基础上，本小组又设计合成了新结构的含其它杂环的不对称芳香二硫醚类化合物，除了保持含三唑环的不对称芳香二硫醚类对AHAS的体外抑制活性、平皿试验下油菜根长的抑制活性等特征以外，本发明的含其他杂环的化合物在盆栽茎叶处理时还表现出良好的除草活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物及其在制备除草剂中的用途，特别是在体外对拟南芥AHAS有明显的抑制作用，在体内对油菜根长有明显的抑制作用，在盆栽实验茎叶处理时对油菜和反枝苋有很好的除草活性。

本发明的含杂环的不对称二硫醚类化合物如式(I)所示：

式中，X为O或S，

R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、卤素或硝基、C₁-C₆酰氨基、卤代C₁-C₆碳烷基、卤代C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷硫基、苯基、3-吡啶基、4-吡啶基；其中所述苯基、3-吡啶基、4-吡啶基是未取代的或者任选被一个或多个选自下列的基团取代的苯基：卤素、羟基、C₁-C₄烷氧基或卤代C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₂的位置为苯环上可被取代的任意位置，R₂为H，或R₂为苯环上的单取代或多取代基，分别是：卤素、硝基、羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧羰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧羰基、卤代C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷硫基、3，4-苯并基，其中，多取代时，取代基可相同或不同。

本发明进一步优选：

当X为S时，

R₁为H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃酰氨基、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基；

R₂为H、邻或对位硝基、邻或对位卤素、邻或对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基、对位C₁-C₃烷氧基、3，4-苯并基；

当X为O时，R₁为H、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基、4-吡啶基、3-吡啶基；R₂为H、邻位硝基、对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基。

本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物通过下列反应式获得：

将等物质的量(即摩尔数)的取代-2-巯基-[1，3，4]-噻(噁)二唑(II)加入到取代苯次磺酰氯(III)的乙醚溶液当中，室温反应1-5h，过滤，无水乙醚洗涤，即得目标化合物(I)，产率大于90％。

通过离体拟南芥AHAS抑制活性实验表明，本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物对野生型拟南芥AHAS和部分抗性拟南芥AHAS有很强的抑制效果，因此本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物可用于制备AHAS抑制剂的活性化合物。

通过油菜根长法实验表明，本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物在100mg/L浓度下对油菜根长有很好的抑制效果，其中代表性化合物在盆栽实验茎叶处理时在100克/亩剂量下对油菜和反枝苋的抑制率为80～100％，因此本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物可用于制备农用除草剂。

通过外源支链氨基酸恢复实验表明，本发明的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物的除草活性与支链氨基酸的生物合成有内在关系。

本发明还提供一种除草剂，该除草剂含有上述的含杂环的不对称二硫醚类化合物以及一种或多种农业上可接受的载体及盐类。其剂型可以为乳油、可湿性粉剂、可溶性粉剂、水乳剂、微乳剂、水剂、悬浮剂、微胶囊剂或水分散颗粒剂。

本发明提供的一种新的含杂环的不对称芳香二硫醚类化合物特别是在体外对拟南芥AHAS有明显的抑制作用，在体内对油菜根长有明显的抑制作用，在盆栽实验茎叶处理时对油菜和反枝苋有很好的除草活性。

附图说明

图1是化合物5抑制AtAHAS的曲线。

图2是化合物2的单晶结构。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。本发明的实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

本发明使用的试剂及原料除特别指出外，其余均为市售。其中实施例1采用的所有硫酚、实施例6采用的烟酰肼和异烟酰肼、实施例7采用的2-巯基-1，3，4噻二唑和5-甲基-2-巯基-1，3，4-噻二唑均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，实施例4采用的苯甲酰肼和邻羟基苯甲酰肼购自阿尔法爱莎化学试剂有限公司(天津)，实施例8采用的对照药单嘧磺酯从南开大学农药国家工程研究中心购买，灭草喹从上海时代生物科技有限公司购买。

实施例1：苯次磺酰氯的制备

将1.1g(10mmol)苯硫酚溶于20mL二氯甲烷中，冰水浴温度条件下，滴加1.35g(10mmol)磺酰氯，搅拌1h。真空脱掉溶剂，得到红色苯次磺酰氯1.36g，产率95％，直接用于下一步反应。

同样，可以制备对甲基苯次磺酰氯，对甲氧基苯次磺酰氯，对溴苯次磺酰氯，对氯苯次磺酰氯，邻氟苯次磺酰氯，邻甲基苯次磺酰氯，β-萘次磺酰氯。

实施例2：邻甲氧羰基苯次磺酰氯的制备

将5g(16.3mmol)2，2′-二硫代二苯甲酸溶于37.5mL无水甲醇中，搅拌，缓缓滴加1.5mL浓硫酸，加热回流72h。冷却至室温，真空脱掉过量甲醇，用饱和碳酸钠溶液中和浓缩液，使pH值达7-8，乙酸乙酯萃取有机层，用饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，真空浓缩得到灰色2，2′-二硫代二苯甲酸甲酯固体4.5g(产率82.5％)。

参考实施例1的方法可以制备邻甲氧羰基苯次磺酰氯。

同样，可以制备邻乙氧羰基苯次磺酰氯。

实施例3：邻硝基苯次磺酰氯的制备

将1.93g(84mmol)金属钠小心缓慢加入50mL无水乙醇中，待反应完毕后，加入溶于25mL无水甲醇的10.33g(83mmol)苄硫醇。然后滴加13.13g(83mmol)邻硝基氯苯，加热回流1h，冷却至室温，抽滤得到黄色固体，再用甲醇重结晶得2-硝基苯基苄基硫醚18.39g(产率90.3％)。

将6.8g(50mmol)磺酰氯溶于25mL三氯甲烷，在常温搅拌下慢慢将其滴加入12.2g(50mmol)2-硝基苯基苄基硫醚的80mL的三氯甲烷溶液中。滴加完毕后升温至45℃，此时反应物完全溶解，控制在该温度下反应0.5h，减压除去溶剂得到黄色油状物，向其中加入100mL石油醚得到黄色絮状固体，乙醚纯化得邻硝基苯次磺酰氯5.23g(产率55.2％)。

同样，可以制备2，4-二硝基苯次磺酰氯。

实施例4：5-苯基-2-巯基-1，3，4-噻二唑的制备

将4.2g(75mmol)氢氧化钾溶于75mL无水乙醇中，搅拌至澄清，加入6.8g(50mmol)苯甲酰肼，保持反应温度20-30℃，搅拌下滴加5.7g(75mmol)二硫化碳溶于15mL乙醇的溶液，滴加完毕，继续反应0.5-1h。抽滤，将所得滤饼干燥，分3次加入0-5℃的75mL浓硫酸中，保持温度，搅拌至反应液呈均相，将反应混合物倒入碎冰中，有大量固体析出。抽滤所得固体，水洗至中性，所得固体用10％的氢氧化钾的水溶液溶解，滤去不溶物，滤液用12％的盐酸调pH至5-6，将所得固体重结晶干燥，得白色5-苯基-2-巯基-1，3，4-噻二唑10.40g，产率71.1％。

同样，可以制备5-(2-苯基)-2-巯基-1，3，4-噻二唑。

实施例5：5-乙酰氨基-2-巯基-1，3，4-噻二唑的制备

将4.6g(50mmol)氨基硫脲溶于20ml无水乙醇中，缓慢加入2.4g(23mmol)无水碳酸钠和4.6g(60mmol)二硫化碳溶于5mL无水乙醇的溶液，搅拌加热回流5小时。减压除去多余的溶剂，所得固体用水溶解，抽滤除去不溶物，用浓盐酸酸化，所得固体抽滤，干燥，得5-乙酰氨基-2巯基-1，3，4-噻二唑3.90g。将所得5-乙酰氨基-2巯基-1，3，4-噻二唑加入到20mL醋酸酐中，回流2小时，冷却，析出白色5-乙酰氨基-2-巯基-1，3，4-噻二唑固体4.33g，产率82.4％。

实施例6：5-苯基-2-巯基-1，3，4-噁二唑的制备

将2.8g(50mmol)氢氧化钾和6.81g(50mmol)苯甲酰肼溶于150ml无水乙醇中，滴入4.19g(55mmol)二硫化碳，加热回流8小时。然后减压旋蒸，除去多余的乙醇，加入适量的水，溶解产生的固体，抽滤，用盐酸调pH至1，抽滤干燥得到白色5-苯基-2-巯基-1，3，4-噁二唑固体6.07g，产率68.2％。

同样，可以制备5-(3-吡啶基)-2-巯基-1，3，4-噁二唑，5-(4-吡啶基)-2-巯基-1，3，4-噁二唑和5-(2’-羟基)苯基-2-巯基-1，3，4-噁二唑。

实施例7：2-(2-硝基苯二硫基)-[1，3，4]-噻二唑的制备

将0.19g(1mmol)2-硝基苯次磺酰氯溶于5mL乙醚中，同时将0.12g(1mmol)1，3，4-噻二唑溶于5mL乙醚中，将2-硝基苯次磺酰氯的乙醚溶液滴加至1，3，4-噻二唑的乙醚溶液中，反应12h，反应完全后过滤，用15ml乙醚冲洗固体，粗品过柱，得2-(2-硝基苯二硫基)-[1，3，4]-噻二唑(化合物3)白色固体0.24g，产率92.2％。

同样，可以制备本发明的其他化合物(1-2和4-48)。

目标化合物1-48的结构式和物化参数见表1，¹H NMR及高分辨质谱见表2。

实施例8：离体拟南芥AHAS(AtAHAS)抑制活性测定。

将构建好的pET-AtAHAS：T86-CHis载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导其表达，再利用固定金属亲和色谱IMAC纯化后提纯蛋白。纯化的蛋白保存于-80℃冰箱中，以保持其酶活性(Hill，C.M.et al.Biochem.J.1997，327，891-898)。

应体系缓冲溶液的配制：所有的辅助因子及底物均配制成母液于-20℃保存，FAD配制成100μM的母液，ThDP为10mM，MgCl₂为100mM，丙酮酸钠为500mM。配制500mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)。在抑制活性测定时，取各溶液25μL于1.5mL离心管中，加入90μLMilli Q纯净水，以及不同浓度的化合物(1-48)溶液25μL。

AtAHAS的活性检测：向反应体系中加入10μL AHAS酶液，酶所催化的反应即被引发。反应于37℃进行30min，之后加入25μL 10％H₂SO₄将其终止。在60℃加热15min，使生成的乙酰乳酸脱羧，全部转变成3-羟基-2-丁酮，此时加入250μL 5％α-萘酚(溶于4M NaOH液)和250μL0.5％肌酸溶液，于60℃再反应15min后读取OD525。与空白进行对照计算抑制率。

抑制常数K_i测定时，对于每一个化合物，都要进行一个大区间和一个小区间下多种浓度同时测定，才能够进行表观抑制常数的计算。具体做法为：首先将化合物(1，6)在实际反应体系中的浓度设定在1×10^-4M，3×10^-5M，1×10^-5M......1×10^-8M，3×10^-9M，1×10^-9M，找到抑制区间可能出现的范围，然后在一个较小的浓度范围内(如0，1×10^-7M，1.5×10^-7M，2×10^-7M，3×10^-7M，5×10^-7M，7×10^-7M，1×10^-6M，1.5×10^-6M，2×10^-6M，3×10^-6M，5×10^-6M。每个平行3次)测定抑制常数K_i。

同样的，可以表达纯化突变型W574L-AtAHAS并测定抑制活性和抑制常数。

RF(resistance factor，抗性指数)，是化合物对突变体的抑制常数与化合物对野生型的抑制常数的比值，即RFK_i(突变型)/K_i(野生型)。RF小于1，表示突变体对化合物的抑制作用表现的比野生型敏感；RF等于1，表示突变体和野生型酶对化合物的抑制表现出相似的敏感性；1＜RF＜5，表示突变体对化合物抑制表现出较弱抗性。5＜RF＜10，表示突变体对化合物抑制表现出中等程度抗性。RF＞10，表示突变体对化合物抑制表现出较高程度的抗性。

对于突变型AtAHAS抑制活性测定的对照药是单嘧磺酯和灭草喹。

实施例9：对油菜根长的抑制活性测定

在直径6cm的培养皿中铺好一张直径5.6cm的滤纸，加入2mL浓度为100mg/L的供试化合物(1-48)溶液，播种浸种4h的油菜种子10粒。28℃下，黑暗培养72h后测定胚根长度来检测化合物的除草活性。

目标化合物1-48抑制野生型AtAHAS的活性以及除草活性数据(百分比抑制率)见表3，化合物5和6对野生型AtAHAS和突变型AtAHAS的K_i值见表4。

实施例10：外源支链氨基酸恢复实验

采用实施例9的油菜根长抑制活性测定方法，区别是培养皿中除了供试化合物外，还加了浓度为0.5mM的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸。实验中除了空白对照以外，还加了支链氨基酸的空白对照。由于AHAS催化支链氨基酸的生物合成，因此如果除草活性是由于AHAS被抑制引起的，则外部提供的支链氨基酸可以抵消或减弱化合物的除草效果。

本实实例中，采用的是化合物5。

外源支链氨基酸恢复实验结果见表5.

实施例11：盆栽除草活性测定

在直径8cm的塑料小杯中放入一定量的土，加入一定量的水，播种后覆盖一定厚度的土壤，幼苗出土前以塑料膜覆盖，每天加以定量的清水，苗前法抑制在出苗前将化合物样品用常规方法进行土壤处理。苗后法处理幼苗出土前以塑料膜覆盖，当幼苗长到一定时期将化合物样品用常规方法进行茎叶喷雾处理。30天后以鲜重抑制百分数来表示药效。选用的杂草品种为：油菜、反枝苋、稗草、马唐。

化合物5和6的盆栽除草活性结果见表6.

从表3的结果来看，多数目标化合物在100mg/L浓度下对野生型AtAHAS都表现出明显的抑制，化合物1，5-7，9，11，31和44在10mg/L浓度下对野生型AtAHAS的抑制率都达到80％以上，这些化合物在100mg/L浓度下对油菜根长也表现出良好的抑制，体内外活性表现出一致性；除此之外，许多化合物分别在体内(油菜根长抑制)和体外(对AHAS抑制)分别表现出较好的活性。

从表4的结果来看，典型的磺酰脲除草剂单嘧磺酯对于野生型AtAHAS活性远高于本发明的化合物，但是对于抗性的AtAHAS其抑制活性还低于5和6号化合物；典型的咪唑啉酮类AHAS抑制剂灭草喹(Imazaquin，样品从商业渠道购买)对野生型AtAHAS的K_i与本发明的5和6号化合物接近，但是对于抗性的AtAHAS的K_i与5和6号化合物相比，却高了几十倍。说明本发明的化合物与传统AHAS抑制剂相比较，结合位点和结合方式可能存在新颖性。

从表5的结果来看，加入支链氨基酸的空白对照与不加支链氨基酸的空白对照相比较，可以看出支链氨基酸对油菜根长甚至还有一定的抑制(12.7％)。而不论是在50mg/L还是25mg/L浓度下，5号化合物对于油菜根长的抑制率在支链氨基酸存在时都要明显低于未加支链氨基酸时的抑制率，说明该类化合物除草效果与AHAS被抑制存在必然的关系。

从表6的结果来看，化合物5和6在盆栽土壤处理和茎叶处理时都表现出一定的除草活性。尤其突出的是，茎叶处理时，在100克/亩的剂量下，化合物5对油菜表现出77.4％的抑制，对苋菜表现出100％的抑制；而化合物6在同样的实验条件下，则对油菜和苋菜都表现出100％的抑制。表明该类化合物经过开发后作为除草剂使用具有很好的前景。

表1.目标化合物1-48的物化参数

--该化合物的样品久置熔解，未能测得熔点。

表2.目标化合物1-48的¹HNMR以及高分辨质谱

表3.目标化合物1-48对野生型AtAHAS和油菜根长的抑制活性

表4.化合物5和6抑制野生型和突变型AtAHAS的抑制常数

表5.化合物5的支链氨基酸恢复实验结果

表6.化合物5和6的盆栽除草活性结果

Claims (8)

1.一种含杂环的不对称二硫醚类化合物，其特征在于它是如(I)所示的化合物：

X为O或S；

R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、卤素或硝基、C₁-C₆酰氨基、卤代C₁-C₆碳烷基、卤代C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷硫基、苯基、3-吡啶基、4-吡啶基；其中所述苯基、3-吡啶基、4-吡啶基是未取代的或者任选被一个或多个选自下列的基团取代的苯基：卤素、羟基、C₁-C₄烷氧基或卤代C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₂的位置为苯环上可被取代的任意位置，R₂为H，或R₂为苯环上的单取代或多取代基，分别是：卤素、硝基、羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧羰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧羰基、卤代C₁-C₆烷氧基、卤代C₁-C₆烷硫基、3，4-苯并基，其中，多取代时，取代基可相同或不同。

2.根据权利要求1所述的含三唑环的不对称二硫醚类化合物，其特征在于

当X为S时，R₁为H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃酰氨基、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基；R₂为H、邻或对位硝基、邻或对位卤素、邻或对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基、对位C₁-C₃烷氧基、3，4-苯并基；

当X为O时，R₁为H、苯基、邻羟基苯基、邻C₁-C₃烷氧基苯基、4-吡啶基、3-吡啶基；R₂为H、邻位硝基、对位C₁-C₃烷基、邻位C₁-C₃烷氧羰基。

3.权利要求1所述的化合物的合成方法，其特征在于包括如下步骤

将等摩尔数的取代-2-巯基-[1，3，4]-噻(噁)二唑(II)加入到取代苯次磺酰氯(III)的乙醚溶液当中，室温反应1-5h，过滤，无水乙醚洗涤，即得目标化合物(I)，产率大于90％。

4.权利要求1-2任一项所述的含杂环的不对称二硫醚类化合物用于制备野生型拟南芥乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂中的用途。

5.权利要求1-2任一项所述的含杂环的不对称二硫醚类化合物用于制备抗性型拟南芥乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂中的用途。

6.权利要求1-2任一项所述的含杂环的不对称二硫醚类化合物作为制备除草剂中的用途。

7.一种除草剂，其特征在于它含有权利要求1-2任一项所述的含杂环的不对称二硫醚类化合物以及农业上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的除草剂，其特征在于其剂型为乳油、可湿性粉剂、可溶性粉剂、水乳剂、微乳剂、水剂、悬浮剂、微胶囊剂或水分散颗粒剂。

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