CN102702084B

CN102702084B - 一种单\双光子钙离子荧光探针化合物及其制备与应用

Info

Publication number: CN102702084B
Application number: CN2012102247141A
Authority: CN
Inventors: 张献; 谢瑞兴; 姚金水; 刘伟良; 李梅; 丁碧妍
Original assignee: Shandong Institute of Light Industry
Current assignee: Shandong Institute of Light Industry
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-07-02
Also published as: CN102702084A

Abstract

本发明提供一种单\双光子钙离子荧光探针化合物及其制备与应用。所述钙离子荧光探针化合物具有式I的结构。制备方法是：BAPTA-CH₃-CHO与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐按摩尔比1：1.1~1.3在乙醇溶剂和哌啶催化剂条件下，加热78~83℃回流反应，冷却析出沉淀，过滤、冲洗、干燥、重结晶，得到产物。该探针化合物对钙离子具有良好的选择性和灵敏性，检测样品前处理简单，具有一定的水溶性和良好的单\双光子荧光性质，可广泛用于检测动植物、人体细胞、土壤或水体中的钙含量。

Description

一种单\双光子钙离子荧光探针化合物及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种钙离子荧光探针化合物及其制备与应用，属于荧光探针技术领域。

技术背景

Ca²⁺作为细胞内的信息传递物质，它起着调节许多重要细胞功能的作用。作为第二信使，Ca²⁺参与生物信号的跨膜传递，介导细胞对外界刺激的应答，它还参与凝血过程、细胞生长分裂、骨骼构成、参与心脏跳动等等。检测钙离子的方法目前有很多：Ca²⁺有机显色剂法、钙离子荧光指示剂法、Ca²⁺传感器法和核磁共振法等。这些方法较灵敏，但存在耗时长，对样品的预处理比较复杂，对细胞易造成伤害等缺点。

荧光法是消除上述常用方法不足之处的可行性方法之一，荧光法包括传统的单光子荧光探针法和近些年发展起来的双光子荧光探针法。双光子荧光探针法用于生物物质的检测具有独特的优势，可以避免单光子荧光探针法穿透深度较浅（＜100μm），背景荧光干扰、对活体细胞有伤害等问题，同时可以对细胞内Ca²⁺进行实时、定量的动态检测提供了独特而重要的方法。然而，传统的Ca²⁺荧光标记探针如fluo-2、BAPTA-1(OG1)、Indo-1等用于双光子技术时，其双光子荧光活性吸收截面(δ×Φ)相对较小，如钙离子常用荧光试剂Indo-1的δ×Φ为1.2GM。因此在实验中必须采用高强度激光激发高浓度荧光物的措施来获得足够强的上转换荧光，这使得荧光化合物吸收的光能很大一部分没有转化为荧光光能，而是以热的形式释放出来，加大了对生物样品的热损伤，增加了活体生物样品观测的难度。由于双光子荧光探针具有更高的设计要求，能用于双光子荧光成像的化合物必能用于传统的单光子荧光成像。因此，针对游离Ca²⁺尤其是细胞内钙离子，研究开发具有较大双光子活性吸收截面的高效钙离子荧光探针材料是当务之急。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种单\双光子钙离子荧光探针化合物，可以灵敏检测钙离子。

本发明还提供所述钙离子荧光探针化合物的制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种单\双光子钙离子荧光探针化合物，具有式I的结构：

本发明所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：

在反应容器加入5-醛-5＇-甲基1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N＇，N＇-四乙酸四乙酯（简称BAPTA-CH₃-CHO）和4-甲基-N-甲基碘盐，BAPTA-CH₃-CHO与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐摩尔比为1：1.1~1.3，然后加入乙醇溶剂和哌啶催化剂，加热到78~83℃回流反应9~11小时，冷却析出沉淀，过滤出沉淀再用乙醇和水冲洗，干燥后在乙醇中重结晶得到产物。

根据本发明，优选的，BAPTA-CH₃-CHO与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐的摩尔比为1：1.2。

根据本发明，所述的催化剂哌啶的加量为催化量；优选的哌啶的加量与BAPTA-CH₃-CHO体积质量比为0.2-0.3mL/g。

根据本发明，优选的，所述反应温度为80℃。

根据本发明，优选的，在三口瓶中加入BAPTA-CH₃-CHO 10g（15.87mmol），再加入4.5g（19.05mmol）的4-甲基N-甲基吡啶碘盐，然后取100mL的乙醇倒入，滴加2.5mL的哌啶，加热到80℃回流反应10小时，冷却析出沉淀，过滤出沉淀再用乙醇和水冲洗，干燥后在50mL乙醇中重结晶得到产物。

本发明所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的应用，可广泛用于检测动植物、人体细胞、土壤或水体中的钙含量。在缓冲溶液中最低可探测的钙离子浓度为10^-7mol/L。

本发明所述的钙离子荧光探针化合物在缓冲溶液中对钙离子表现出灵敏的识别性，加入金属钙离子后单光子荧光强度迅速降低并发生蓝移，最低可探测的钙离子浓度为10^-7mol/L。详细试验将在实施例3中加以说明。本发明的钙离子荧光探针化合物可应用到实际的细胞染色成像，具有广泛的应用前景。

本发明的优良效果如下：

1、本发明的荧光离子探针化合物具有一定的水溶性，因而生物相容性较好。并且由于酯基的存在，具有较好的膜穿透性，可用于细胞内钙离子的探测。

2、本发明的荧光离子探针化合物在水解或脂酶存在下具有更好的亲水性特点，并且具有良好的选择性和灵敏度，测试样品无需前处理或前处理非常简单。

3、本发明的荧光离子探针化合物的在水中的双光子截面较大，为细胞成像提供了有利的基础。

4、目前报道的效果比较好的钙离子荧光探针Indo-01e-M甲酯的激发波长在390nm。本发明的钙离子探针，对钙离子的螯合部分并未做修改，对钙离子的螯合能力依然很好，发色团的部分由于增加了双键，共轭效应增大，单光子荧光激发波长为420nm，有效的降低了对细胞的损伤，而双光子激发波长为800nm，完全的避开了紫外光对细胞的损伤，非常有利于细胞体内的观察和检测。

5、本发明的荧光离子探针化合物的制备方法简单易行，产率可达到85.9%。

附图及附表说明

图1为实施例2钙离子荧光探针化合物在不同溶剂中的双光子荧光光谱；图中谱线1-5分别对应的是丙酮、乙醇、DMF、乙腈、水定容配成1×10^-4mol/L的溶液样品。

图2为实施例1钙离子荧光离子探针与不同金属离子作用后的单光子荧光谱图；图中谱线1是单纯探针的荧光发射谱线，2-10分别对应的是Ca²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、K⁺、Mg²⁺、Na⁺和Zn²⁺与探针混合后的荧光发射谱线，其中谱线1-10对应的探针浓度为1×10^-5mol/L，金属离子的浓度为探针的10倍。

图3为实施例1钙离子荧光钙离子探针与不同浓度的钙离子的双光子荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1、钙离子荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：

在三口瓶中加入BAPTA-CH₃-CHO 10g（15.87mmol），再称取4.5g（19.05mmol）的4-甲基-N-甲基吡啶碘盐加入，然后取100mL的乙醇倒入，滴加2.5mL哌啶，加热到80℃回流反应10小时，停止后反应液成深红色，冷却析出沉淀，过滤用乙醇和水冲洗，干燥后在乙醇中重结晶得产物11.6g。

本发明合成的钙离子荧光探针化合物，¹H NMR(CDC1₃,400MHz,TMS)δ(ppm):8.54(d,J＝7.2Hz,2H),8.03(d,J＝6.8Hz,2H),7.25(m,4H),6.76(m,4H),4.21(m,20H),2.28(s,3H),1.94(s,3H),1.18(t,J＝4.4Hz,12H).

所述的双光子钙离子荧光探针化合物合成路线如下：

实施例2、钙离子荧光探针化合物的双光子溶剂效应。

将实施例1合成的钙离子荧光探针化合物配成溶液。然后对其双光子溶剂效应进行测试，计算其在不同溶剂中的双光子吸收截面和活性吸收截面。

称取钙离子荧光探针化合物0.0424g放入5mL的容量瓶中，然后用色谱纯的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）定容，制得浓度为1×10^-2mol/L的探针母液。然后用微量进样器取500μL的母液放入5mL容量中，分别用色谱纯的丙酮、乙醇、DMF、乙腈、水定容，配成1×10^-4mol/L的溶液，充分摇匀后以Ti:sapphire Mira 900-F锁模激光器发出的激光脉冲作辐照光源，重复频率76MHZ，在SpectroPro 300i光谱仪上进行双光子荧光光谱测试。测试结果如图1所示，计算相关双子性质如表1。

表1钙离子荧光探针化合物在不同溶剂中的双光子性质

注：δ表示探针的双光子吸收截面，单位是GM，λ表示探针的最大发射峰下的波长。

δ×Ф则表示探针的双光子活性吸收截面，单位也为GM，Ф代表荧光量子产率。

实施例3、钙离子荧光探针化合物对钙离子的性能实验

将实施例1合成的钙离子荧光探针化合物配成溶液。然后对其性能进行测试，确定其选择性和灵敏性。

（1）钙离子探针的选择性

常见的金属离子对钙离子的检测可能存在干扰，因而要确定合成的钙离子探针在识别钙离子时能否具备良好的选择性。

在1×10^-5mol/L钙离子荧光探针化合物的水溶液中分别加入Cu(NO₃)₂.3H₂0，Fe(NO₃)₃.9H₂O，Zn(NO₃)₂.6H₂O，KNO₃,Mg(ClO₄)₂.6H₂O，NaClO₄.H₂O，AgNO₃，AlCl₃·6H₂O等固体，使金属离子与化合物的摩尔比为10:1。然后用单光子荧光检测仪测定荧光发射强度，手动输入扫描波长范围为440~700nm，激发波长419nm，扫描波长和荧光强度关系如图2，可见荧光探针中加入其他金属离子后单光子荧光强度几乎未发生改变。只有加入钙离子后荧光强度迅速降低并蓝移10nm。因此本发明的钙离子探针对钙离子有着非常高的选择性。

（2）钙离子探针灵敏度

配制钙离子荧光探针化合物探针母液1×10^-2mol/L，Ca²⁺母液1mol/L。取探针母液400μL，Ca²⁺母液分别取0、1、2.5、5、10、15、30、50μL加入8个5mL的容量瓶中，用pH7.2的缓冲液进行定容，制得的溶液探针浓度都为8×10^-4mol/L，使钙离子与探针的摩尔比分别为0、0.2、0.5、1、2、3、6、10，充分作用稳定后以Ti:sapphire Mira 900-F锁模激光器发出的激光脉冲作辐照光源，在SpectroPro 300i光谱仪上测试双光子荧光光谱。测试结果如图3所示，在加入钙离子摩尔比为0.2时其双光子荧光强度从8000a.u下降到6000a.u，当钙离子含量增加到2.5μL（摩尔比为0.5）荧光强度迅速增大到16000a.u，此时双光子荧光强度最大，继续增加钙离子的含量双光子荧光强度又会降低。因此，本发明的钙离子探针对钙离子的灵敏性非常高，最低可探测的钙离子浓度为10^-7mol/L。

钙在动植物、人体、土壤、水体中广泛存在，缺钙会对动植物生长、人体健康造成不利影响，细胞内钙离子的浓度变化关系到生命体的一些列重大生理生命活动。因此对钙含量进行有效及时准确的检测具有重要的意义。本发明的钙离子探针具有较高的灵敏性和专一性，而且单\双光子荧光性质较好，能进行活体细胞的成像，使用时操作简单，能快速检测，有广泛应用前景。

Claims

1.一种单\双光子钙离子荧光探针化合物，具有式I的结构：

I。

2.一种制备权利要求1所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的方法，步骤如下：

在反应容器加入5-醛-5’-甲基1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酯（简称BAPTA-CH₃-CHO）和4-甲基-N-甲基吡啶碘盐，5-醛-5’-甲基1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酯与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐摩尔比为1：1.1~1.3，然后加入乙醇溶剂和哌啶催化剂，加热到78~83℃回流反应9~11小时，冷却析出沉淀，过滤出沉淀再用乙醇和水冲洗，干燥后在乙醇中重结晶，即得。

3. 如权利要求2所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，所述5-醛-5’-甲基1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酯与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐的摩尔比为1：1.2。

4.如权利要求2所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，所述的催化剂哌啶的加量与5-醛-5’-甲基1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酯体积质量比为0.2-0.3 mL/g。

5.如权利要求2所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，所述反应温度为80℃。

6.如权利要求2所述的单\双光子钙离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，在三口瓶中加入BAPTA-CH₃-CHO 10 g（15.87 mmol），再加入4.5g（19.05 mmol）的4-甲基-N-甲基吡啶碘盐，然后取100 mL的乙醇倒入，滴加2.5mL的哌啶，加热到80℃回流反应10小时，冷却析出沉淀，过滤出沉淀再用乙醇和水冲洗，干燥后在50 mL乙醇中重结晶得到产物。