CN102696637B - 龙胆苦苷药物制剂及其在防治烟草花叶病毒病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种龙胆苦苷药物制剂及其在防治烟草花叶病毒病中的应用。所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷0.1~99%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。本发明采用的龙胆苦苷可从西南獐牙菜(SwertiacinctaBurk)中分离制备,方法简便,提取率高。本发明龙胆苦苷药物制剂在制备防治烟草花叶病毒病中的应用前景广泛。本发明运用现代分离技术从西南獐牙菜中分离得到龙胆苦苷。实验证明龙胆苦苷能显著抑制TMV侵染的活性,可作为新型抗植物病毒的活性成分用于防治烟草花叶病毒病,其抑制效果优于市售抗烟草花叶病植物药剂(宁南霉素等),本发明制剂系纯生物制剂,对人畜无害,对防治烟草花叶病毒病有显著的效果,可用于有机烟叶的生产中。
Description
技术领域
本发明属于植物药物及应用技术领域,具体涉及一种龙胆苦苷药物制剂,从西南獐牙菜( Swertia cincta Burk)提取龙胆苦苷的方法、以及药物制剂在制备防控烟草花叶病毒病及抗病毒制剂中的应用。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是烟草花叶病等的病原体,属于披甲病毒科烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。TMV的寄主广泛,能侵染30个科的300多种植物,在烟草、番茄等粮经作物上危害严重,全世界每年仅由TMV引起的花叶病造成的损失就超过1亿美元,给农业生产造成巨大的经济损失。然而,由于TMV对寄主具有绝对寄生性以及植物没有像动物那样完整的免疫代谢系统,因此,植物一旦被病毒感染就终生处于被危害的状态。这些因素都给高选择性的抗植物病毒药剂的研发带来了很大的难度。在目前的农业生产中,化学农药防治烟草花叶病毒病应用最为广泛,但化学防治效果有限,且易造成农残超标,因此迫切需要开发新型抗病毒制剂。
植物在进化过程中合成了类型丰富的具有抗微生物活性的次生代谢产物,它们可以选择性的抵御包括TMV在内的病原物的侵害。由于是植物本身产生的抗病毒物质,植物源病毒抑制剂对寄主本身毒性小或没有毒性,作用机制独特且资源丰富。因此,筛选新型植物源抗病毒制剂具有重要意义。
病毒对植物产生危害的过程可分为侵染寄主、体内复制和症状表达三个部分。因此,对其中任何部分的抑制均可减轻植物病毒病的危害。另外有些抗植物病毒剂虽然对这三个部分没有作用,但却能激活寄主产生系统抗性。同时,许多活性物质表现的抗病毒活性可能是其中一种或多种机制共同起作用的结果。本发明人前期研究表明,很多植物源病毒抑制剂是通过激活植物的系统获得性抗性,从而增强植物对病毒的抵抗力。
龙胆科獐牙菜属植物(Swertia)主要产于云南、贵州、四川等地,是西南少数民族常用的植物药源。该属植物共有170 个种,我国约有80 个种,主要分布在西南地区,仅云南就有38 种。该属药用植物大多具有清热利胆、强心、舒肝健胃、解毒等功效,用于治疗肝炎、黄疸型肝炎、肝胆等疾病,但尚未有文献报道该属植物具有抗植物病毒的作用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种龙胆苦苷药物制剂;第二目的在于提供一种提取龙胆苦苷的方法;第三的目的在于提供龙胆苦苷药物制剂的剂型;第四目的在于提供龙胆苦苷药物制剂在制备抗烟草花叶病毒病制剂中的应用。
本发明的第一目的是这样实现的,所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷0.1~99%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。
本发明的第二目的是这样实现的,以西南獐牙菜为原料,并按包括下列步骤的工艺提取龙胆苦苷化合物:
A、取阴干的西南獐牙菜粉碎,用75~85%甲醇提取2~3次,每次1~3h;
B、合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;
C、浸膏加入1~3倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度95~100%二氯甲烷溶液萃取2~3次,每次15~25min;
D、合并萃取液,过MCI 柱脱色,之后用浓度 70~80%的甲醇洗脱,收集洗脱液;
E、再用大孔树脂柱脱糖,并用甲醇/水(V/V)0~100:100~0的溶液洗脱,收集洗脱液,浓缩得含70~80%甲醇的浸膏;
F、上HPLC进行分离,用70~80%甲醇水溶液洗脱,最后用半制备柱进行纯化,得到龙胆苦苷化合物。
本发明的第三目的是这样实现的,按配方要求比例将龙胆苦苷化合物与对人和动物无毒可药用辅料和/或赋形剂混合,配制成水剂、片剂、颗粒剂或微乳剂。
本发明的第四目的是这样实现的,所述的龙胆苦苷药物制剂在制备防治烟草花叶病毒病制剂中的应用。
本发明运用现代分离技术从西南獐牙菜( Swertia cincta Burk) 中分离得到一种环烯醚萜类化合物——龙胆苦苷。实验证明龙胆苦苷具有显著的抑制TMV侵染的活性,可作为新型抗植物病毒的活性成分,可用于制备防治烟草花叶病毒病的药物制剂,其抑制效果要优于市售抗烟草花叶病植物药剂,如宁南霉素等药物,本发明药物制剂不仅对人畜无毒、无害,使用安全可靠,对防治烟草花叶病毒病有显著的效果。
附图说明
图1为TAS-ELISA法检测病毒的含量柱状图。图1中:CK-为阴性对照,CK+为阳性对照,大于阳性对照为阳性,小于2倍阴性对照为阴性。宁南霉素为市售药物对照,龙胆苦苷-1、5、10、15和20分别表示龙胆苦苷的浓度为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml和20μg/ml。
图2为本发明的应用效果对比照片。其中左图为本发明化合物与对照组效果对比;右图为现有化合物与对照组药物效果对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变更或改进,均属于本发明的保护范围。
本发明所述的龙胆苦苷药物制剂为:含有龙胆苦苷0.1~99%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。
作为优选实施方式:
含有龙胆苦苷0.5~90%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。
含有龙胆苦苷1~50%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。
含有龙胆苦苷5~20%,其余为药物学上可接受的药用辅料和/或赋形剂。
本发明所述的用于制备上述龙胆苦苷药物制剂的龙胆苦苷,其制备方法为:以西南獐牙菜为原料,并按包括下列步骤的工艺提取龙胆苦苷化合物:
A、取阴干的西南獐牙菜粉碎,用75~85%甲醇提取2~3次,每次1~3h;
B、合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;
C、浸膏加入1~3倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度95~100%二氯甲烷溶液萃取2~3次,每次15~25min;
D、合并萃取液,过MCI 柱脱色,之后用浓度 70~80%的甲醇洗脱,收集洗脱液;
E、再用大孔树脂柱脱糖,并用甲醇/水(V/V)0~100:100~0的溶液洗脱,收集洗脱液,浓缩得含70~80%甲醇的浸膏;
F、上HPLC进行分离,用70~80%甲醇水溶液洗脱,最后用半制备柱进行纯化,得到龙胆苦苷化合物。
作为优选实施方式:
所述的大孔树脂柱为D900、D130、D101、D201或D301中的任意一种。
所述的半制备柱为艾杰尔半制备柱、HPLC半制备柱或日本唯美希半制备柱中的任意一种。所述的艾杰尔半制备柱进行纯化,采用甲醇/水溶液进行洗脱,得到龙胆苦苷化合物。
本发明所述的龙胆苦苷药物制剂的剂型是:按配方要求比例将龙胆苦苷化合物与对人和动物无毒可药用辅料和/或赋形剂混合,配制成水剂、片剂、颗粒剂或微乳剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂,冲剂等)、喷剂、气雾剂等。上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、助湿剂和其他常用的添加剂,如淀粉、蛋白粉、果胶、蔗糖、糊精、硬脂酸镁、甘露醇、十二烷基苯磺酸钠等。上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
所述的龙胆苦苷药物制剂在制备防治烟草花叶病毒病制剂中的应用,其中龙胆苦苷溶液浓度为1~20μg/ml。
实施例1
取阴干的西南獐牙菜粉碎,用75%甲醇提取2次,每次1h;合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;浸膏加入1倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度98%二氯甲烷溶液萃取2次,每次15min;合并萃取液,过MCI 脱色,之后用浓度75%的甲醇洗脱,收集洗脱液;再用D900大孔树脂柱脱糖,用甲醇/水(V/V)10:90的溶液洗脱,收集洗脱液;浓缩得浸膏,上HPLC进行分离,用70%的甲醇水溶液洗脱,最后艾杰尔半制备柱进行纯化,用70%的甲醇水溶液洗脱,得到龙胆苦苷化合物。
实施例2
取阴干的西南獐牙菜粉碎,用85%甲醇提取2次,每次3h;合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;浸膏加入3倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度95%二氯甲烷溶液萃取3次,每次25min;合并萃取液,过MCI 柱脱色,之后用浓度70%的甲醇洗脱,收集洗脱液;再用D130大孔树脂柱脱糖,用甲醇/水(V/V)30:70的溶液洗脱,收集洗脱液;浓缩得浸膏,上HPLC进行分离,80%的甲醇水溶液洗脱,最后HPLC半制备柱进行纯化,用80%的甲醇水溶液洗脱,得到龙胆苦苷化合物。
实施例3
取阴干的西南獐牙菜粉碎,用80%甲醇提取3次,每次2h;合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;浸膏加入2倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度100%二氯甲烷溶液萃取3次,每次20min;合并萃取液,过MCI 柱脱色,之后用浓度80%的甲醇洗脱,收集洗脱液;再用D101大孔树脂柱脱糖,用甲醇/水(V/V)70:30的溶液洗脱,收集洗脱液;浓缩得浸膏,上HPLC柱进行分离,75%的甲醇水溶液洗脱,最后日本唯美希半制备柱进行纯化,用75%的甲醇水溶液洗脱,得到龙胆苦苷化合物。
实施例4
采用D201大孔树脂柱脱糖,其余同实施例1。
实施例5
采用D301大孔树脂柱脱糖,其余同实施例2。
实施例6
1μg/ml的龙胆苦苷水溶液的配制。称取分离提纯的龙胆苦苷化合物2μg溶于少量DMSO溶液,充分搅拌混合,待其充分溶解后,加入余量的蒸馏水至终体积2ml,制成水剂,即得1μg/ml的龙胆苦苷水溶液。使用时按照所需浓度稀释即可。
实施例7
20μg/ml的龙胆苦苷水溶液的配制。称取分离提纯的龙胆苦苷化合物20μg溶于少量DMSO溶液,充分搅拌混合,待其充分溶解后,加入余量的蒸馏水至终体积1ml,制成水剂,即得20μg/ml的龙胆苦苷水溶液。使用时按照所需浓度稀释即可。
实施例8
100μg/ml的龙胆苦苷水溶液的配制。称取分离提纯的龙胆苦苷化合物100μg溶于少量DMSO溶液,充分搅拌混合,待其充分溶解后,加入余量的蒸馏水至终体积1ml,制成水剂,即得100μg/ml的龙胆苦苷水溶液。使用时按照所需浓度稀释即可。
实施例9
制备1g龙胆苦苷粉剂,称取10mg龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后再加入0.1g牛血清白蛋白粉,加水充分搅拌混匀,然后加入20%淀粉作为赋形剂,充分混匀,干燥后磨碎制成粉剂。使用时将粉剂稀释至所需浓度即可。
实施例10
制备1g龙胆苦苷粉剂,称取0.95g龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后再加入0.01g牛血清白蛋白粉,加水充分搅拌混匀,然后加入余量淀粉作为赋形剂,充分混匀,干燥后磨碎制成粉剂。使用时将粉剂稀释至所需浓度即可。
实施例11
制备1g龙胆苦苷颗粒剂,称取0.15g龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后再加入0.5g牛血清白蛋白粉,加水充分搅拌混匀,然后加入15%淀粉和15%果胶作为赋形剂,充分混匀,制粒并干燥后成为颗粒剂。使用时将颗粒剂稀释至所需浓度即可。
实施例12
制备1g龙胆苦苷颗粒剂,称取0.001g龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后再加入0.5 g牛血清白蛋白粉,加水充分搅拌混匀,然后加入20%淀粉和20%果胶作为赋形剂,充分混匀,制粒并干燥后成为颗粒剂。使用时将颗粒剂稀释至所需浓度即可。
实施例13
制备1g龙胆苦苷乳剂,称取0.99g龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后加入10%十二烷基苯磺酸钠作为乳化剂,充分混匀成为乳剂。使用时将乳剂稀释至所需浓度即可。
实施例14
制备1g龙胆苦苷片剂,称取0.4g龙胆苦苷,加入少许DMSO使之充分溶解;然后再加入0.1g小麦蛋白(粉),加水充分搅拌混匀,然后加入40%淀粉作为赋形剂,充分混匀,干燥后压制成为片剂。使用时将片剂稀释至所需浓度即可。
实施例15
10μg/ml 的TMV溶液制备。吸取已经制备的100μg/ml 的TMV母液1ml,加入余量的磷酸缓冲液至终体积10ml,即得10μg/ml的TMV溶液。
实施例16
龙胆苦苷对TMV初侵染的抑制试验。采用半叶枯斑法对心叶烟人工接种TMV。选取健康且生长良好的心叶烟,在暗室放置一夜。每棵烟苗挑选水平位置相同的3个叶片。将每个叶片的右半部分均匀喷洒10μg/ml的龙胆苦苷溶液100μl,左半部分喷洒100μl 含相同DMSO浓度的蒸馏水,喷洒量以叶面全部浸湿而不下滴为准。2 h后将整个叶片均匀摩擦接种10 μg/ml的TMV 200 μl。以8%宁南霉素水剂1000倍液为对照。每个处理3株烟共10片烟叶。5天后分别统计左右叶片的枯斑数目并根据叶片上的枯斑数计算枯斑抑制率。化合物对TMV侵染的抑制率=[(阳性对照枯斑数-化合物处理枯斑数) /阳性对照枯斑数]×100%。
实验结果:表1为化合物龙胆苦苷在10μg/ml浓度时与对照药物宁南霉素在心叶烟上对TMV初侵染的抑制比较。由结果可知,化合物龙胆苦苷对TMV的平均抑制率为52.5%,而宁南霉素对TMV的抑制率只有35%。因此,龙胆苦苷对TMV初侵染的抑制效果要优于市售药物“宁南霉素”。
表1 龙胆苦苷与宁南霉素在心叶烟上对TMV初侵染的抑制率的比较
实施例17
不同浓度的龙胆苦苷溶液对TMV增值的影响试验。选取健康且生长良好的系统寄主烟草品种K326,在暗室放置一夜。以不同浓度的龙胆苦苷溶液均匀喷洒在叶面上,喷洒量以叶面全部浸湿而不下滴为准。2h后将整个叶片均匀摩擦接种10μg/ml的TMV 200μl。以8%宁南霉素水剂1000倍液为对照。接种3天后用TAS-ELISA检测TMV病毒的增殖情况。
实验结果:随着龙胆苦苷浓度的增加,病毒粒子的含量逐渐减少。龙胆苦苷浓度为5μg/ml时,其对TMV在寄主内复制的抑制效果明显优于市售药物宁南霉素。当龙胆苦苷的浓度达到20μg/ml时,已经检测不到病毒的存在(图1)。
实施例18
龙胆苦苷对TMV在烟苗上形成症状的影响试验。选取健康且生长良好的枯斑寄主心叶烟,在暗室放置一夜。以20μg/ml的龙胆苦苷溶液均匀喷洒在叶面右半叶面上,左半叶面喷洒清水作对照,喷洒量以叶面全部浸湿而不下滴为准。2h后将整个叶片均匀摩擦接种10μg/ml的TMV 200μl。以8%宁南霉素水剂1000倍液为对照。接种TMV后第5天观察烟苗的症状。
实验结果:如图2所示,用20μg/ml龙胆苦苷溶液处理烟苗后接种TMV,5天后烟苗上基本没有枯斑症状出现。枯斑数目显著少于阳性对照,也明显少于宁南霉素处理的烟苗。表明龙胆苦苷能抑制或延缓TMV在烟草上症状的表现,其抑制效果要优于市售药物宁南霉素。
Claims (9)
1.一种龙胆苦苷药物制剂在防治烟草花叶病毒病中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷0.1~99%,其余为药物学上可接受的药用辅料。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷0.5~90%,其余为药物学上可接受的药用辅料。
4.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷1~50%,其余为药物学上可接受的药用辅料。
5.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷药物制剂含有龙胆苦苷5~20%,其余为药物学上可接受的药用辅料。
6.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷是以西南獐牙菜为原料,并按下列步骤提取:
A、取阴干的西南獐牙菜粉碎,用75~85%甲醇提取2~3次,每次1~3h;
B、合并提取液,过滤除渣,合并滤液,然后减压浓缩得相对密度1.2~1.3的浸膏;
C、浸膏加入1~3倍体积的水搅拌至呈悬浮状,用浓度95~100%二氯甲烷溶液萃取2~3次,每次15~25min;
D、合并萃取液,过MCI 柱脱色,之后用浓度 70~80%的甲醇洗脱,收集洗脱液;
E、再用大孔树脂柱脱糖,并用甲醇/水(V/V)0~100:100~0的溶液洗脱,收集洗脱液,浓缩得含70~80%甲醇的浸膏;
F、上HPLC进行分离,用70~80%甲醇水溶液洗脱,最后用半制备柱进行纯化,得到龙胆苦苷化合物。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述的大孔树脂柱为D900、D130、D101、D201或D301中的任意一种。
8.如权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述的龙胆苦苷药物制剂由龙胆苦苷化合物与对人和动物无毒可药用辅料混合配制成水剂、片剂、颗粒剂或微乳剂。
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