CN102690893A

CN102690893A - 一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法

Info

Publication number: CN102690893A
Application number: CN2012102051009A
Authority: CN
Inventors: 王沛政; 段维; 杨勇刚; 李新鹏
Original assignee: XINJIANG CONDY AGRI-GENETICS Co Ltd
Current assignee: XINJIANG CONDY AGRI-GENETICS Co Ltd
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明公开了一种鉴定油葵康地4号品种纯度方法。通过建立了油葵RAPD技术最佳程序，并确定了PCR扩增反应各组分的优化组合，以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记OPB03，扩增的康地4号产生的母本特异标记OPB03条带大小为480bp，产生的父本特异标记OPB03条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带，这个引物标记可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，具有重要应用价值。

Description

一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，本发明具体涉及一种鉴定油葵康地品种纯度方法的技术领域。

背景技术

向日葵(Helianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一,也是我国北方地区的主要油料作物,其作为油料或蛋白质资源日益受到人们的重视。

随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种的大面积推广,品种鉴定已成为新品种保护及保护农民利益的重要手段。传统的品种鉴定多用形态学方法, 是根据作物的形态特征和农艺生理特征鉴定特定的基因型,它虽是一种最原始的品种纯度检验方法,但简单、直观、易观测记载、长期以来形态标记是鉴定杂交向日葵品种的主要手段。但随着育种新技术的不断发展,品种间的形态学差异越来越小,能用于鉴定的形态性状已显不足,增加了鉴定的困难;而且此法鉴定时间长,费用高。近年来,蛋白质和DNA多态性检测技术迅速发展,尤其是DNA多态性检测技术以其检测材料少、时间短、结果稳定性好、重复性高、技术简单、成本低而逐渐成为目前检测的主流方法。

DNA分子检测技术基于DNA分子的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列机制而产生的多态性(polymorphism diversity orfingerprints)，从本质上能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。杂交向日葵品种纯度鉴定应用的分子检测技术有RFLP技术、RAPD技术、SSR技术、AFLP技术。RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)是由Grodzicker(1974)最早创立的，该技术是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用特异性探针进行Sothern分子杂交，通过放射自显影来揭示DNA的多态性。由于RFLP标记对DNA的需要量较大(5-10ug)，质量要求较高，技术较为复杂，程序繁多，周期长，费用较高，多态有限，对材料需求量大巨有放射性同位素的潜在污染和危害，因而目前尚不宜于用于品种的纯度鉴定。RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核普酸序列为引物，一般为9一l0bp碱基，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA产物，再经过脂糖凝胶电泳得到多态性的DNA谱带。RAPD技术主要特点是反应灵敏，多态性强，具有简便、快速的优点，既有大量的随机引物可供筛选使用，又不受种属的限制，因而被广泛用于多种作物的品种纯度鉴定。SSR标记在人类及植物的基因组中，均存在着由1一4个碱基对组成的简单重复序列(simple sequence repeats,简称SSR)，又称之为微卫星(microsatellite)，SSR技术已广泛应用于玉米、水稻等作物的品种纯度鉴定，SSR最大的优点在于其扩增产物在进行测序胶电泳分离时具有单碱基的高分辨率，能检测到很高的多态性，遗传信息量较大，并具有较好的稳定性和重演性。AFLP(Amplify Fragment length Poiymorphism)技术扩增片断长度多态性是RFLP和RAPD两项技术的结合，是由荷兰科学家Zabean等人发明的一项专利技术。AFLP技术具较好的重复性，但操作复杂，步骤多，对实验技能和仪器精度要求均很高，难以在作物品种纯度鉴定上普及。

康地4号为新疆康地种业科技股份有限公司2001年选育的早熟油葵品种。生育期日数春播95天左右，耐向日葵霜霉病和叶斑病。抗倒伏，耐盐碱。平均亩产200公斤。综上所述，从传统的形态鉴定、生化指纹检测发展到分子水平和基因水平检测杂交向日葵品种纯度的检验技术经历了从简单到复杂而精确的过程，每一种方法都有其各自的优点和不足，因而至今在农作物种子检验规程中尚无快速的生化或DNA分子检测技术标准程序。现有技术中未见报道有关鉴定油葵康地4号品种纯度的方法。

发明内容

针对现有技术中未见报道有关鉴定油葵康地4号品种纯度的方法的技术现状，本发明提供一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法，可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，鉴定体系能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，结果准确可靠。

本发明的技术方案：通过建立了油葵RAPD技术最佳程序，并确定了PCR扩增反应各组分的优化组合，以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记OPB03，这个引物标记可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程。

本发明具体提供一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法，具体方法步骤如下：

（1）油葵DNA提取：取培养2周的油葵幼嫩真叶于研钵中,加入液氮迅速研磨使成均匀粉状,在样品未融化之前加入65℃预热的CTAB提取液500μl,上下颠倒10次充分混匀后，把样液移入1.5 ml离心管中,置65℃水浴50 min,其间颠倒离心管3-5次。取出样品冷却至室温,分别加入等体积的酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提,其中，酚/氯仿按体积比1：1计，氯仿/异戊醇按24∶1计，经4℃12 000 r/min离心5 min。取上清液加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温放置5-10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清,用100μl 70%乙醇洗涤沉淀,置无菌台吹干。用双蒸水溶解DNA沉淀,4℃保存备用；CTAB提取液为：50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH 8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2-巯基乙醇。

（2）PCR扩增反应及程序：反应总体积为20ul, 其中含10×反应缓冲液，1.25mmol/L MgCl₂, 1u Taq DNA 聚合酶，0.1mmol/L dNTPs, 1umol/L Primer的引物OPB03, 1-5ng模板DNA；扩增程序为94℃ 预变性4min; 94℃ 变性20sec, 37℃ 退火 50sec, 72℃ 延伸 1min20sec, 40个循环后再于72℃ 延伸10min。

（3）胶板的制备：待0.5%琼脂糖胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，电泳缓冲液50×TAE Buffer 配制方法：称量Tris 242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g 溶于1L烧杯中，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，加样缓冲液为：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板；DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之。

（5）上述步骤以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行了100对随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记OPB03，该引物序列CATCCCCCTG。

本发明中，经以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记OPB03,这个引物标记OPB03的具体序列与现有技术报到一致，本领域普通技术人员可以参见引物标记OPB03序列。

随机引物OPB03扩增的康地4号产生的母本特异标记OPB03条带大小为480bp，产生的父本特异标记OPB03条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：

1.本发明建立油葵DNA提取、RAPD技术最佳程序，并确定了PCR扩增反应各组分的优化组合，扩增效果稳定。利用上述结果计算出的品种纯度与田间检测结果基本一致。这个OPB03随机引物标记可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，鉴定体系能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，结果准确可靠。

2.本发明中通过提取康地油葵种子, PCR扩增反应及程序，以及电泳、观察和拍照仅需2天时间，比常规形态检测时间大幅缩短。

附图说明

图1显示为康地4号的OPB03引物RAPD扩增结果图，图中，1为父本、2为杂种3为母本、 M.为 DNA标准分子量，即1kb DNA Ladder。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要原辅材料：康地4号油葵种子是由新疆康地种业公司提供，是2002年以来成熟商品品种，本领域可以通过市场购买获得；引物标记OPB03在现有技术中可见。

主要试剂： Tris-HCl，NaCl, EDTA, CTAB, 2-巯基乙醇，Taq DNA 聚合酶，dNTPs,Na₂EDTA·2H₂O，溴酚蓝，二甲苯青，蔗糖等。

LRH-150-G型光照培养箱，上海仪器厂；医用高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂。PCR扩增仪 Pcr2700、美国冷冻离心机 eppendorf5810、美国分光光度计 Nd1000、美国可调移液器 eppendor、美国纯水系统Milib美国。

实施例一：鉴定油葵康地4号品种纯度的方法

（3）胶板的制备：待0.5%琼脂糖胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，电泳缓冲液50×TAE Buffer 配制方法：称量Tris 242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g 溶于1L烧杯中，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。

本发明中以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记OPB03,这个引物标记OPB03的序列CATCCCCCTG与现有技术报到一致，本领域普通技术人员可以参见引物标记OPB03。

本发明中随机引物OPB03扩增的康地4号产生的母本特异标记OPB03条带大小为480bp，产生的父本特异标记OPB03条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。

实施例二：鉴定油葵康地4号品种纯度的方法

（1）无菌油葵幼苗获得：取康地4号油葵种子,用70%的酒精溶液浸泡10min，无菌水冲洗2遍，用10%的过氧化氢溶液消毒30min，再无菌水冲洗2遍，胚端朝上接种于无激素的1/2MS培养基上,培养室温度为26℃-28℃，光照时间16h,光强2000LX，生长14天。

（2）向日葵DNA提取：取上述培养2周的向日葵幼嫩真叶于研钵中,加入液氮迅速研磨使成均匀粉状,在样品未融化之前加入65℃预热的CTAB提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH 8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2-巯基乙醇)500μl,充分混匀后把样液移入1.5 ml离心管中,置65℃水浴50 min,其间颠倒离心管数次。取出样品冷却至室温,分别加入等体积的酚/氯仿(1：1)和氯仿/异戊醇(24∶1)进行抽提,4℃12 000 r/min离心5 min。取上清液加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温放置5-10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清,用100μl 70%乙醇洗涤沉淀,置无菌台吹干。用双蒸水溶解DNA沉淀,4℃保存备用。

（3）PCR扩增反应及程序：取步骤(2)1-5ng DNA， 10×反应缓冲液，1.25mmol/L MgCl₂, 1u Taq DNA 聚合酶，0.1mmol/L dNTPs, 1umol/L Primer（引物OPB03）,反应总体积为20ul。将其放入基因扩增仪扩增，扩增程序为94℃ 预变性4min; 94℃ 变性20sec, 37℃ 退火 50sec, 72℃ 延伸 1min20sec, 40个循环后再于72℃ 延伸10min。

（4）胶板的制备：待0.5%琼脂糖胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液（50×TAE Buffer 配制方法：称量Tris 242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g 溶于1L烧杯中），使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。

（5）电泳、观察和拍照：取第(3)步PCR扩增反应液4ml加样缓冲液1ml(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml),加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。参见附图1，箭头所示为随机引物标记扩增条带，条带所示1、2、3、M以此为随机引物标记扩增康地4号父本、其杂交种、母本、以及标准带普的条带。箭头所示为随机引物OPB03扩增的康地4号产生的母本特异条带，大小为480bp，产生的父本特异条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带，因此该引物扩增产物可以区别康地4号母本、其杂交种、父本，可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪。

Claims

1.一种鉴定油葵康地4号品种纯度的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下：

（1）油葵DNA提取：取培养2周的油葵幼嫩真叶于研钵中,加入液氮迅速研磨使成均匀粉状,在样品未融化之前加入65℃预热的CTAB提取液500μl,充分混匀后把样液移入1.5 ml离心管中,置65℃水浴50 min,其间颠倒离心管数次；取出样品冷却至室温,分别加入等体积的酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提,其中，酚/氯仿按体积比1：1计，氯仿/异戊醇按24∶1计，经4℃12 000 r/min离心5 min；取上清液加入0.6倍体积的异丙醇混匀,于室温放置5-10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清,用100μl 70%乙醇洗涤沉淀,置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀,4℃保存备用；CTAB提取液为：50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH 8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2-巯基乙醇；

（2）PCR扩增反应及程序：反应总体积为20ul, 其中含10×反应缓冲液，1.25mmol/L MgCl₂, 1u Taq DNA 聚合酶，0.1mmol/L dNTPs, 1umol/L Primer, 1-5ng模板DNA；扩增程序为94℃ 预变性4min; 94℃ 变性20sec, 37℃ 退火 50sec, 72℃ 延伸 1min20sec, 40个循环后再于72℃ 延伸10min；

（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，加样缓冲液为：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板；DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之；

（5）上述步骤以商品油葵品种康地4号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记OPB03，该引物序列CATCCCCCTG。

2.如权利要求1所述的鉴定油葵康地4号品种纯度的方法，其特征在于，所述的引物OPB03扩增的康地4号产生的母本特异标记OPB03条带大小为480bp，产生的父本特异标记OPB03条带大小为900bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带。