CN102690854B - 一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虾壳血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，包括：a、将虾类洗净烘干后磨粉过筛，并加水配制成质量分数为1%~5%的虾壳粉溶液；b、调节pH，加入中性蛋白酶后在恒温下进行酶解反应；c、灭酶进行分离纯化；d、浓缩和冷冻干燥制得虾壳ACE抑制肽。该方法发获得的ACE抑制肽分子量较低，可快速进入血液循环被人体吸收和利用，活性稳定；对血压正常者没有降压作用，不会产生降压过度的问题；ACE抑制肽是采用食用级酶在温和条件下获得的，安全性高，无毒副作用；且该方法操作简单，以价格低廉且丰富易得的虾壳为原料，增加了虾类产品的附加值，避免了环境污染。

Description

一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法

技术领域

本发明涉及一种血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，尤其涉及一种以虾壳为原料，利用酶解反应制备虾壳血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的方法。

背景技术

高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，可以诱发一系列心脑血管疾病，并导致人的死亡。据国家心血管病中心颁布的《中国高血压防治指南2010修订版》估计，我国高血压患病率呈增长态势，每5个成人中就有1个患高血压，我国高血压患者至少已达2亿。控制高血压已成为我国医疗卫生事业的一项刻不容缓的任务。

血管紧张素转化酶（ACE）普遍存在哺乳动物组织中，是造成人体内血压升高的一大因素。ACE抑制剂能够抑制ACE的活性，达到降低血压的目的。现在的高血压患者大多数使用合成ACE抑制剂来控制血压的升高，合成ACE抑制剂具有作用强、见效快等特点，但对人体正常的肾功能有一定的副作用。

从动植物资源中分离的ACE抑制肽，因其对正常血压没有影响，没有毒副作用的特点，具有十分广阔的应用前景。天然的ACE抑制肽是在1965年从南美茅头蝮蛇毒液中发现的，随后对于其生理功能及开发应用的研究迅速开展起来。现今ACE抑制肽主要由蛋白质经蛋白酶水解产生，采用的蛋白质种类很多，其中主要是陆地蛋白质资源，如大豆蛋白，乳清蛋白，玉米蛋白，汗麻籽蛋白等。此外，从海洋生物中提取蛋白制备ACE抑制肽也越来越受到人们的关注。

以食品蛋白质为原料制备ACE抑制肽的工艺原理基本相同，但随原料的不同其加工工艺略有差异。一般制备工艺流程如下：原料-蛋白提取-酶解-灭酶-脱苦、脱色-离心超滤分离-离子交换层析分离凝胶色谱层析分离-冷冻干燥-检验-成品（梁汉营，刘成梅，刘伟.食源性ACE抑制肽的研究进展.食品研究与开发，2007,156-158）。

申请号为“200910248611.7”的中国专利申请公开了血管紧张素I转换酶活性抑制寡肽的制备方法，以新鲜猪血为原料，通过提取珠蛋白粉末并对蛋白粉末酶解以及对珠蛋白可溶蛋白酶解液进一步分离、纯化得到氨基酸序列为Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe的寡肽。

申请号为“200910220756.6”的中国专利申请也公开了血管紧张素转换酶抑制剂的制备方法，以牡蛎浆液为原料，通过对牡蛎浆液酶解所产生的牡蛎蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到氨基酸序列为Vel Tyr Pro Trp ThrGlnArg Phe的新肽。

随着我国水产养殖业的迅猛发展，到2010年，我国对虾总产量已突破350万吨。由于虾类消费而产生的虾壳和虾头等副产物也逐年增多，它们大多被丢弃或是加工成附加值很低的饲料，不但极大地浪费了资源，而且还有可能对环境造成破坏。经研究发现，虾壳中富含甲壳素、蛋白质、虾青素和各种矿物质，均可再利用。为了更好地利用虾壳资源，同时避免其对环境的污染，近几年食品科学研究者关于虾壳的利用展开了深入的研究。国内关于利用蛋白酶水解虾壳制取ACE抑制肽的研究未见报道。

发明内容

本发明提供了一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，解决了虾类产品加工副产物虾壳造成的环境污染的问题，实现了对虾壳中蛋白质的再利用，制得的血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽安全性高、无毒副作用，能够对高血压患者血压降低起到积极的促进作用。

一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，包括如下步骤：

a、将虾壳清洗后烘干、粉碎，制得虾壳粉，加水配置得到质量分数为1～5%的虾壳粉溶液；

b、调节虾壳粉溶液的pH值为4.0~10.0，加入蛋白酶1000～5000U/g虾壳粉溶液，在搅拌条件下，于20～70℃酶解反应1～4小时，得到虾壳蛋白水解液；

c、将虾壳蛋白水解液灭酶后离心，取上清液，采用截留分子量≤10000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；

d、将虾壳多肽超滤液浓缩、冷冻干燥，制得血管紧张素转化酶抑制肽。

烘干可以使虾壳脱水，便于后续的粉碎，而且可以使虾壳中的各种酶失活，阻止虾壳蛋白质的水解、破坏。在40~60℃下进行烘干，可以有效使各种酶失活，而且不会破坏蛋白质的一级结构，使抑制肽产品具有较高的活性和得率。烘干温度和时间决定了虾壳粉中的含水量，一般情况下，烘干时间为12~36小时，该条件下，虾壳含水量低，较容易粉碎，虾壳粉不粘结，易分散。

在酶与底物的反应中，底物颗粒体积越小，比表面积越大，与酶接触的几率越大，酶促反应进行越彻底，但细度过大，有可能破坏内部蛋白分子结构，造成产品活性较低，优选的，所述虾壳粉的细度为40~80目，更优选有60目。

酶解反应的温度和pH值对最终的抑制肽产品活性具有一定影响，而反应的温度和pH值也会影响蛋白酶的活性，因此最好选择最适温度和pH值对产品影响较小的蛋白酶，本发明优选为中性蛋白酶，中性蛋白酶的酶解温度为35~55℃，pH值6.0~7.5，该反应条件温和，对产品活性影响较小。

酶的添加量、底物浓度、温度、pH值和反应时间是影响酶促反应的主要因素，当虾壳粉溶液的质量分数为2.5%，中性蛋白酶添加量为2000U/g虾壳粉溶液，酶解反应的温度为50℃，时间为2小时，pH值为7时，酶解反应效率较高，反应较为彻底，产品得率较高。

酶解液中残留蛋白酶和未分解的虾壳粉，它们作为杂质存在，需要通过离心分离去除，离心的转速和时间对产品的纯度有一定影响，本发明优选离心转速为3000~5000转/min，时间为10~20min，在该条件下，杂质去除率和产品的得率均较为理想。

为了彻底除杂，需对离心获得的上清液进一步分离纯化，超滤膜是一种有效的高分子分离膜，膜孔径大小是影响分离效果的关键因素，一般用截留分子量来描述超滤膜孔径的大小。在蛋白质水解物中，活性物质的分子量一般低于10000Da，而且大部分低于5000Da，因此选用截留分子量≤5000Da的超滤膜进行超滤，既可以保留大部分的活性物质，又可以满足充分除杂的要求。

本发明以虾壳为原料，对虾壳中的蛋白进行酶解，分离纯化制得血管紧张素转化酶ACE抑制肽，同现有的制备方法相比，本发明方法具有如下优点：

1）原料丰富易得，所用虾壳为虾类加工的副产物，成本低廉，避免了其对环境造成的污染，增加了虾类产品的附加值，且制备方法简单；

2）制得的ACE抑制肽分子量较低，可快速进入血液循环被人体吸收和利用，活性稳定，体外实验表明其对ACE的抑制率高；

3）对血压正常者没有降压作用，不会产生降压过度的问题；

4）ACE抑制肽是采用食用级酶在温和条件下获得的，安全性高，无毒副作用，适用于食品、化妆品、医药等领域。

具体实施方式

实施例1

一种虾壳血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，采用如下步骤：

A）将虾壳清洗除杂，在40℃下烘24小时，烘干样品用组织粉碎机磨成粉末，将粉末过40目筛，制成虾壳粉，然后加水配制成质量分数为5%的虾壳粉溶液；

B）将上述虾壳粉溶液的pH调节到6.5，然后加入中性蛋白酶5000U/g虾壳粉溶液，置于45℃水浴中水解4小时，反应在搅拌状态下进行，并保持温度和pH恒定，得到虾壳蛋白水解液；

C）将上述虾壳蛋白水解液于95℃水浴灭酶15分钟，取出冷却至室温后，在3000r/min转速下离心10分钟，取上清液，用截留分子量4000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；

D）将上述虾壳多肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥处理，得到虾壳ACE抑制肽产品。

实施例2：

一种虾壳血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，采用如下步骤：

A）将虾壳清洗除杂，在60℃下烘干24小时，烘干样品用组织粉碎机磨成粉末，将粉末过100目筛，制成虾壳粉，然后加水配制成质量分数为1%的虾壳粉溶液；

B）将上述虾壳粉溶液的pH调节到7.5，然后加入中性蛋白酶1000U/g虾壳粉溶液，置于55℃水浴中水解1小时，反应在搅拌状态下进行，并保持温度和pH恒定，得到虾壳蛋白水解液；

C）将上述虾壳蛋白水解液于95℃水浴灭酶15分钟，取出冷却至室温后，在5000r/min转速下离心20分钟，取上清液，用截留分子量8000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；

D）将上述虾壳多肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥处理，得到虾壳ACE抑制肽产品。

实施例3：

一种虾壳血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽的制备方法，采用如下步骤：

A）将虾壳清洗除杂，在50℃下烘干24小时，烘干样品用组织粉碎机磨成粉末，将粉末过60目筛，制成虾壳粉，然后加水配制成质量分数为2.5%的虾壳粉溶液；

B）将上述虾壳粉溶液的pH调节到7，然后加入中性蛋白酶2000U/g虾壳粉溶液，置于50℃水浴中水解2小时，反应在搅拌状态下进行，并保持温度和pH恒定，得到虾壳蛋白水解液，；

C）将上述虾壳蛋白水解液于95℃水浴灭酶15分钟，取出冷却至室温后，在4000r/min转速下离心15分钟，取上清液，用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；

D）将上述虾壳多肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥处理，得到虾壳ACE抑制肽产品。

分别测定以上三个实施例中蛋白水解液的水解度和多肽超滤液的ACE抑制率，具体测定方法如下：

水解度（DH）测定：

水解度(Degree of Hydrlysis,DH)是反映蛋白质水解程度的指标，可以作为重要的产品质量检定标准。水解度通常定义为：DH=h/h_tot×100%，式中h为水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数（mmol/g）），h_tot对于特定的蛋白质是常数，虾壳蛋白的h_tot=8.073mmol/g，因此通过测定被水解的肽键数即可算出相应的DH值，即测定每克蛋白水解液中氨基态氮的浓度。

氨基态氮的测定采用甲醛滴定法。吸取蛋白水解液样品5mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加60mL水，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH值为8.2。加入10mL中性甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L NaOH溶液滴定至pH9.2，记录消耗NaOH毫升数（V₁）。用80mL蒸馏水做空白。

$h_{{\mathrm{NH}}_2}(\mathrm{mmol}/g)=\frac{(V_1-V_2)\×C}{m\×\frac{5}{V}\×\frac{20}{100}}$

$\mathrm{DH}=\frac{h_{{\mathrm{NH}}_2}-h_0}{h_{\mathrm{tot}}}$

式中：V₁，NaOH标准溶液的体积（mL）；V₂，空白消耗的NaOH标准溶液的体积（mL）；C，标准NaOH溶液的浓度（mol/L）；m，虾壳中蛋白质的质量（g）；V，待测溶液体积（mL）；h_NH2，反应后氨基态氮浓度（mmol/g）；h₀，反应前氨基态氮浓度（mmol/g）；h_tot，每克原料蛋白的肽键毫摩尔数（mmol/g），虾壳蛋白h_tot=8.073mmol/g。

20——测定样品稀释液的量，mL；

5——样品量，mL。

ACE抑制率测定：

参照Cushman（Cushman D W，Cheung H S.Spectrophoto metric assay andproperties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].BiochemPharmacol，1971，20：1637-1648）的方法进行改进。以Hippuryl-His-Leu为底物，测定多肽超滤液对ACE的抑制活性，多肽HHL在ACE酶的催化下快速地分解产生马尿酸（Hip）和二肽（His-Leu，HL），马尿酸在228nm处有最大吸收值。

反应体系包括pH8.3硼酸-硼砂缓冲液、5mmol/L的HHL 50μL以及40μL多肽超滤液，终体积为140μL。加入ACE酶液启动反应，于37℃恒温1h，然后加入1mol/L HCI终止反应。加入1.2ml乙酸乙酯萃取，离心，吸取1ml酯层于100℃下干燥1h，加入3mL蒸馏水，于228nm下测定吸光度OD。

同时做对照1，即上述反应体系中不加多肽超滤液，使ACE与HHL完全反应，其余步骤相同，并测定228nm处吸光值OD₁。

对照2，即在上述反应体系中加入灭活ACE酶代替原先的ACE酶，其余步骤相同，并测定228nm处吸光值OD₀。

ACE抑制率（%）=（OD₁-OD）/(OD₁-OD₀)式中：OD₀——加灭活ACE酶的吸光值。

OD——加入多肽超滤液和ACE酶的吸光值；

OD₁ACE与HHL完全反应后的吸光值；

根据以上方法，分别测定三个实施例中蛋白质水解度（DH）和多肽超滤液的ACE抑制率，结果如下（见表1）：

表1不同水解条件对虾壳蛋白水解度及制得的ACE抑制肽的抑制效应

实验结果显示，虾壳蛋白在三个实施例的不同水解条件下，其水解度都在20%以上，其中实施例3中的水解度最高，达22.71%；说明温度过高或过低，pH值偏酸或偏碱，中性蛋白酶的量过多或过少及反应时间的长短，都直接影响虾壳蛋白水解程度，试验表明在pH值为7，中性蛋白酶量为2000U/g虾壳粉溶液，温度为50℃，水解2小时的条件下，虾壳蛋白的水解效果较好。

通过对本实验三个实施例不同条件下获得的ACE抑制肽抑制率的测定表明，不同试验条件下获得的产品对ACE的抑制率不同，但均高达70%以上，实施例3产品对ACE的抑制率甚至高达84.04%。由此可见，实施例3中的条件不仅能使虾壳蛋白水解彻底，且获得的水解物对ACE的抑制效果较好。

Claims (1)

1.一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，包括如下步骤：

A)将虾壳清洗除杂，在50℃下烘干24小时，烘干样品用组织粉碎机磨成粉末，将粉末过60目筛，制成虾壳粉，然后加水配制成质量分数为2.5％的虾壳粉溶液；

B)将上述虾壳粉溶液的pH调节到7，然后加入中性蛋白酶2000U/g虾壳粉溶液，置于50℃水浴中水解2小时，反应在搅拌状态下进行，并保持温度和pH恒定，得到虾壳蛋白水解液；

C)将上述虾壳蛋白水解液于95℃水浴灭酶15分钟，取出冷却至室温后，在4000r/min转速下离心15分钟，取上清液，用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，得到虾壳多肽超滤液；

D)将上述虾壳多肽超滤液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥处理，得到虾壳ACE抑制肽产品。