CN102690371A

CN102690371A - 胍基丁胺改性o-羧甲基壳聚糖及其制备方法

Info

Publication number: CN102690371A
Application number: CN2012101384438A
Authority: CN
Inventors: 刘文广; 孙亮; 杨建海
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明公开了胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖及其制备方法，首先利用对甲苯磺酰氯改性O-羧甲基壳聚糖，得到对甲苯磺酰化O-羧甲基壳聚糖，然后将胍基丁胺与对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖溶于水中，并加入三乙醇胺，在惰性气体保护下进行反应，即得到胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖。利用羧甲基壳聚糖和胍基丁胺的优点，并进行两种物质的有效结合，利用胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖，胍基化羧甲基壳聚糖通过对甲苯磺酰化的羧甲基壳聚糖与胍基丁胺的伯胺进行亲核反应，这种共聚方式不会损害羧甲基壳聚糖的主链并能将伯胺变成仲胺以降低对生物大分子生物功能的破坏性，降低毒性。

Description

胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种胍基丁胺改性生物大分子的合成，更具体的说是，一种胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖及其制备方法。

背景技术

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viral vector）和非病毒载体（nonviral vector）两种。病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。

过去的几十年中，人们已经证实聚阳离子非病毒载体可有效的用于基因转染，但聚阳离子非病毒载体仍有一些缺陷，如转染效率不高，有毒等，另外，对于合成的阳离子聚合物来说，所谓的可生物降解主要是由于主链或侧链的断裂，而且这些断链仍可能对病人产生威胁。因此，作为有可能用于临床的理想的载体应该能降解或者分裂成无副反应和无毒害的物质。为了能够得到生物相容性好并且可降解的聚阳离子化合物，研究者试图直接将带正电的胺类与多糖相连，如葡聚糖、普罗兰、硫酸软骨素及透明质酸。基于糖环的载体中，葡聚糖以其能降解、生物相容性好和非免疫性而得到广泛关注。

羧甲基壳聚糖是甲壳胺的高级衍生物,由甲壳质在碱性条件下与氯乙酸反应得到。与甲壳质相比，其物理、化学性质均得到优化，具有100%水溶性、成膜性及极强的重金属螯合作用。这种中性、纯天然和完全无毒的产物在医学保健、工农业等领域均显示出更加优越的特点。目前已应用在高级化妆品添加剂、重金属螯合剂、药物缓释剂、植物生长剂、工业废水处理等诸多方面。作为医药保健品，羧甲基壳聚糖保留了壳聚糖对人体保健的一系列优点，还具备壳聚糖所不具备的无涩味等对人体健康更加有利的特点。口服后，经转化、降解成低分子物质，被人体吸收，效果更佳。

胍基丁胺是精氨酸的代谢产物，本身具有生物活性，在大脑中合成，几乎分布于体内所有的器官，并呈器官特异性分布，含量最高的器官是胃。它是一种神经递质或调质，参与多个生物学作用，影响细胞的粘附和增殖。其结构中含有一个丁胺基活性基团和胍基基团，带正电荷，且胍基具有类似于细胞穿膜肽的作用，有利于跨膜。目前已常用于健身类保健品领域。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，针对羧甲基壳聚糖与胍基丁胺的优点，利用胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖，以降低对生物大分子生物功能的破坏性，提供一种胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖及其制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖，以O-羧甲基壳聚糖为主链，利用主链上的羟基将胍基丁胺键接到O-羧甲基壳聚糖分子主链上，形成如下述化学式所示的分子结构：

其中

x，y分别表示两种重复单元的聚合度，这一点可以通过原料O-羧甲基壳聚糖的测试或者产品信息予以确认。当R全是羟基时，结构为O-羧甲基壳聚糖，故R不能全为羟基。

胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖的制备方法，首先利用对甲苯磺酰氯改性O-羧甲基壳聚糖，得到对甲苯磺酰化O-羧甲基壳聚糖，然后将胍基丁胺与对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖溶于水中，并加入三乙醇胺，在惰性气体保护下进行反应，即得到胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖。具体来说，需要注意以下几点：

（1）将O-羧甲基壳聚糖溶于水中，并调节pH至碱性并在冰水浴中搅拌，然后将对甲苯磺酰氯的乙腈溶液中滴入O-羧甲基壳聚糖的水溶液中，立刻会有沉淀产生，冰水浴下进行反应后，将沉淀抽滤，透析后冻干，即得对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖，优选在0-5℃下反应3-6小时；至于O-羧甲基壳聚糖、对甲苯磺酰氯的比例应当结合反应机理和转化程度进行选择，为提高O-羧甲基壳聚糖的对甲苯磺酰化，优选等摩尔比或者对甲苯磺酰氯略微过量，如1：（1.1—1.2）。

（2）胍基丁胺、对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖、三乙醇胺的用量应当结合反应机理和转化程度进行选择，为提高反应转化率，优选胍基丁胺和三乙醇胺的用量基本相等，且都大于对甲苯磺酰化O-羧甲基壳聚糖的用量，优选80—90℃下反应至少24小时，以保证效果；待反应结束后，将溶液pH调到7，透析后冻干，即得到胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖。

用400MHz高分辨超导核磁共振仪Varian UNITY plus-400检测样品氢谱，如说明书附图1所示，通过（1）和（2）的对比可知，在化学位移为1.5时，出现了出现胍基丁胺的亚甲基特征峰（a），证实了通过O-羧甲基壳聚糖的羟基与胍基丁胺的伯胺反应，成功的合成了胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖。

利用本发明的产品进行细胞毒性试验,采用MTT比色法进行测试。MTT比色法是最常用的测定细胞毒性的实验方法，MTT的化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。MTT比色法是用于检测细胞存活和生长的一种方法，外源性的MTT可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为一种难溶性的蓝紫色结晶物甲臢，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。并且在一定细胞数量范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。细胞中的有色物质甲臢用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在多功能酶标仪上测定490nm波长处的吸光度值，该吸光度值可以间接的反映活细胞的数量。具体实验步骤为：

1)称量25mg MTT放入小烧杯中，加入5mL PBS（pH=7.4），搅拌使其溶解。溶解后，在超净台用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃避光待用（两周内有效，长期保存在-20℃）。

2)将活细胞以1×104/孔的密度接种到96孔板中后，在37℃，5%CO2条件下培养24h。然后每孔换上180μl新鲜的10%FBS的细胞培养液，并加入20μl不同浓度的O-羧甲基壳聚糖-胍基丁胺的水溶液，再在37℃，5%CO2条件下培养24h后，将每孔的培养液完全吸出，每孔加入180μl DMEM和20μl MTT溶液，继续培养4h。

3)小心吸出96孔培养板内的培养液，每孔加入150μl DMSO，在振荡器上振荡10min，使每孔底部物质完全溶解均匀。

4)选择490nm波长，在多功能酶标仪上测定每孔的吸光度值，记录结果

5)选用未做任何处理的活细胞作为正对照，以空白孔吸光度值调零。细胞存活率计算方法为：样品吸光度/正对照吸光度×100%（每个样品以三个孔重复实验，所得结果取均值和标准偏差）。

6)经测算细胞存活率在95%以上。

本发明的技术方案中，利用羧甲基壳聚糖和胍基丁胺的优点，并进行两种物质的有效结合，利用胍基丁胺改性羧甲基壳聚糖，胍基化羧甲基壳聚糖通过对甲苯磺酰化的羧甲基壳聚糖与胍基丁胺的伯胺进行亲核反应，这种共聚方式不会损害羧甲基壳聚糖的主链并能将伯胺变成仲胺以降低对生物大分子生物功能的破坏性，降低毒性。

附图说明

图1是本发明中原料和产物的核磁共振谱图，其中（1）为未修饰O-羧甲基壳聚糖核磁图，（2）为胍基丁胺修饰的O-羧甲基壳聚糖核磁图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。下面实施例中使用的羧甲基壳聚糖数均分子量是十万，小分子修饰剂选用胍基丁胺。

实例1：

1.精确称量羧甲基壳聚糖1g，溶于100ml 1mol/L NaOH水溶液中，混合均匀。称为溶液①。

2.精确秤取对甲苯磺酰氯3g，溶解于50ml已腈中，混合均匀，称为②。

3.将溶液①放置于冰水浴中，并将溶液②滴入其中，大约两个小时滴完。滴完后将混合溶液溶升至室温，反应3小时。

4.将200ml乙醇，加到3中的溶液中，出现白色沉淀，用乙醇洗涤三次，后用真空干燥箱干燥24小时。

5.将胍基丁胺3.6g、对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖、三乙醇胺40ml、水60ml，混合，搅拌均匀。

6.用油浴加热5中溶液，温度设置为85℃。反应48小时，并通氮气保护。

7.反应结束后，将反应溶液的pH值为7，用截留分子量为3500的透析袋透析4天。期间更换10次去离子水。然后冻干，即得到目标产物。

实例2：

1.精确秤取羧甲基壳聚糖1g，溶于100ml 1mol/L NaOH中，混合均匀。称为溶液①。

2.精确秤取对甲苯磺酰氯6g，溶解于50ml已腈中，混合均匀，称为②。

3.将溶液①放置于冰水浴中，并将溶液②滴入其中，大约两个小时。滴完后将混合溶液溶升至室温，反应3小时。

4.将200ml乙醇，加到3中的溶液中，出现白色沉淀，用乙醇洗涤三次，后用争控干燥箱干燥24小时。

实例3：

2.精确秤取对甲苯磺酰氯9g，溶解于50ml已腈中，混合均匀，称为②。

实例4：

2.精确秤取对甲苯磺酰氯15g，溶解于50ml已腈中，混合均匀，称为②。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖，其特征在于，以O-羧甲基壳聚糖为主链，利用主链上的羟基将胍基丁胺键接到O-羧甲基壳聚糖分子主链上，形成如下述化学式所示的分子结构：

其中x，y分别表示两种重复单元的聚合度，R不能全为羟基。

2.胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于，首先（即步骤1）利用对甲苯磺酰氯改性O-羧甲基壳聚糖，得到对甲苯磺酰化O-羧甲基壳聚糖，然后（即步骤2）将胍基丁胺与对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖溶于水中，并加入三乙醇胺，在惰性气体保护下进行反应，即得到胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖。

3.根据权利要求2所述的胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，将O-羧甲基壳聚糖溶于水中，并调节pH至碱性并在冰水浴中搅拌，然后将对甲苯磺酰氯的乙腈溶液中滴入O-羧甲基壳聚糖的水溶液中，立刻会有沉淀产生，冰水浴下进行反应后，将沉淀抽滤，透析后冻干，即得对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖。

4.根据权利要求3所述的胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，优选在0—5℃下反应3—6小时；至于O-羧甲基壳聚糖、对甲苯磺酰氯的比例应当结合反应机理和转化程度进行选择，为提高O-羧甲基壳聚糖的对甲苯磺酰化，优选等摩尔比或者对甲苯磺酰氯略微过量，如1：（1.1-1.2）。

5.根据权利要求2所述的胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，胍基丁胺、对甲苯磺酰化的O-羧甲基壳聚糖、三乙醇胺的用量应当结合反应机理和转化程度进行选择，为提高反应转化率，优选胍基丁胺和三乙醇胺的用量基本相等，且都大于对甲苯磺酰化O-羧甲基壳聚糖的用量，优选80-90℃下反应至少24小时，以保证效果；待反应结束后，将溶液pH调到7，透析后冻干，即得到胍基丁胺改性O-羧甲基壳聚糖。