CN102688497B - 一种多肽锌铁补剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽锌铁补剂的制备方法，解决了现有技术存在的生产安全性差，易给环境造成负担的问题。本发明首先使用室温固相法制得多肽锌螯合物，再以N2和Vc作为Fe2+保护剂，使剩余的多肽与Fe2+发生螯合反应，制得多肽锌铁复合补剂，生产过程安全可靠，不会给环境造成负担。制备的多肽锌铁补剂能同时为人体补充铁锌元素，化学稳定性好，吸收好。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物制品生产技术领域，特别涉及一种多肽锌铁补剂的制备方法。
背景技术
铁、锌是人体内需要的微量元素。一般人的体内含铁量为4.2-6.1克，相当于一个小铁钉的重量，约占人体体重的0.004%。70%的铁存在于血红蛋白和肌红蛋白内，25%以铁蛋白形式分布在肝、肾、骨髓中，一小部分铁是氧化酶的辅助因子。锌在人体中的正常含量为2-3克，绝大部分组织中都有极微量的锌分布，肝脏、肌肉和骨骼中含量较高。
传统的补铁方法是用铁锅煮饭炒菜、食用含铁量较多的蔬菜和肉类制品，或是服用含铁元素的药物，如补铁剂、葡萄糖酸铁等。国际上允许使用的补铁产品主要分为无机铁和有机铁，按在人体的存在形式可分为血红素铁和非血红素铁，一般有机铁比无机铁对肠胃刺激性小、易吸收，血红素铁较非血红素铁易于吸收。目前正在研的补铁产品有血红素铁（卟啉铁）、氨基酸螯合铁、EDTA铁钠、黑木耳多糖铁等。成人每日铁的适宜摄入量为15-20毫克，但近年来我国铁缺乏病的发生率却在上升，其中问题的关键是吸收率太低。研究表明，在妊娠母猪饲料中添加氨基酸螯合铁，仔猪体内铁贮和Hb含量显著高于对照组（饲料中添加硫酸亚铁），并明显提高了仔猪生长速度、抵抗力。
锌作为人体必需的微量元素，参加人体内许多金属酶的组成、促进机体的生长发育和组织再生、维持膜结构的完整性、参与体内多种生理生化活动。锌缺乏是我国及许多发展中国家的亟待解决的公共卫生问题，大部分少年儿童、孕妇及病人都不同程度的存在营养性锌缺乏，为改善这些人群的锌营养状况，人们开发了多种锌补剂，第一代补锌产品以硫酸锌为代表，第二代为葡萄糖酸锌、乳酸锌，再到第三代锌补剂氨基酸螯合锌和多肽螯合锌补剂，第三代锌补剂是通过氨基酸吸收途径，具有向体外排泄率低、稳定性好、毒性小、生物利用率高等特点。
锌、铁缺乏是人类微量元素缺乏最常见的两种情况，因此开发一种吸收性好、生物利用率高的能同时补充铁锌的补剂非常有必要。
现有锌补剂的制备方法，如2008年7月23日公开的，公开号为CN101225102A的“罗非鱼鱼皮多肽螯合锌盐的制备方法”专利文献，其公开的多肽螯合锌的方法：以鱼皮蛋白酶解液中多肽含量为指标，按其余硫酸锌的质量比3:1，pH为6，水浴恒温60℃，磁力搅拌0.5~1小时，所得溶液经过多次无水乙醇洗涤，析出黄色粘稠状鱼皮多肽螯合含锌盐。此法属于水体系合成法，主要缺点是产生大量废水。
另有关于铁补剂的制备方法，如《食品与发酵工业》2010年第36卷第6期报道的文献“猪血多肽铁螯合盐的制备工艺”，其方法是：分别准确称取3.0 g猪血多肽于5个锥形瓶中，将其配制成溶液浓度为30g/L，待多肽完全溶解后,加入1.0%的抗坏血酸，然后加入1.0 g氯化亚铁(多肽与铁的质量比为3∶1)，用质量分数20%的NaOH或HCl溶液分别调pH值至3、4、5、6、7，充N2,于室温下混合反应10min，冷却后将反应液在4 000r/min下离心20min，上清液用无水乙醇处理得到沉淀,抽滤,收集滤渣,并反复洗涤抽滤2~3次，最后真空干燥得多肽螯合铁。此方法的主要缺点是产物分离纯化使用无水乙醇，使用量大，易产生环境负担，且乙醇为易燃物，生产的安全性差。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述缺陷，提供一种多肽锌铁补剂的制备方法，生产过程安全可靠，不会给环境造成负担，制备的多肽锌铁补剂能同时为人体补充铁锌元素，吸收好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种多肽锌铁补剂的制备方法，所述的制备方法步骤如下：
（1）将鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末与硫酸锌按质量比2~4：1的比例混合，置于研钵中研磨10~30分钟，然后加入NaOH溶液，NaOH溶液的加入标准为使得NaOH质量为鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末质量的1/15~1/10，继续研磨30~60分钟，制得多肽锌螯合物粗品；
（2）将Vc和FeCl2粉末溶于蒸馏水中得FeCl2溶液，其中FeCl2浓度为1.4~1.6 mol/L，Vc的浓度为0.01~0.03mol/L；将步骤（1）制得的多肽锌螯合物粗品溶于蒸馏水中，得质量分数为40%~60%的多肽锌螯合物水溶液，将多肽锌螯合物水溶液与FeCl2溶液等体积混合，再用盐酸调节pH为4~6，在N2保护下，室温搅拌反应40~60分钟，制得多肽锌铁复合补剂粗品；
（3）将步骤（2）制得多肽锌铁复合补剂粗品离心，取上清液，在分子量为4500Da的纤维素膜透析袋中用蒸馏水进行透析，每8小时更换一次蒸馏水，48小时后取出，冷冻干燥，即得多肽锌铁复合补剂。
本发明首先使用室温固相法制得多肽锌螯合物，再以N2和Vc作为Fe2+保护剂，使剩余的多肽与Fe2+发生螯合反应，制得多肽锌铁复合补剂，生产过程安全可靠，不会给环境造成负担。
本发明通过Fe、Zn元素二价阳离子易与组成多肽分的氨基酸中具有的氧、氮、硫原子配对形成螯合物而实现的。由于螯合物中离子键与配位键共存，分子中电荷趋于中性，不易与其他物质结合生成不溶性化合物，因此具有良好的化学稳定性。
作为优选，步骤（1）中所述的鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末的分子量为5800~6200，鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末大小为80~100目。本发明的原料选择鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末，利用了海洋资源的优势。舟山是海洋资源丰富，鱿鱼皮是一种数量较大的下脚料，取用鱿鱼皮制备胶原蛋白多肽考虑当地资源量又能有效利用下脚料。鱿鱼皮胶原蛋白多肽是水产胶原蛋白的一个代表，水产动物中的胶原蛋白主要是Ⅰ型胶原蛋白，在骨骼和结缔组织中发挥作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性，在细胞微环境中起到维持细胞完整性及传递细胞外信号的作用。Ⅰ型胶原蛋白肽在人体中吸收效率高，且具有极强的肌肤靶向利用特性，吸收后能充分用于肌肤胶原蛋白合成，能强化肌肤弹性结构。鱿鱼皮胶原蛋白多肽更利于人体吸收。本发明的鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末的平均分子量在6000，鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末大小为80~100目，这样的粉末大小人体容易吸收。鱿鱼皮胶原蛋白多肽是将鱿鱼皮通过现有常规的酶解工艺获得。
作为优选，步骤（1）中所述的NaOH溶液中NaOH的质量分数为30~50%。NaOH的加入主要是调节pH，控制在5.3~6.2，便于螯合。
作为优选， 步骤（3）中所述的离心为在4500r/min~5000r/min下离心15~20min。
作为优选，步骤（3）中透析小时后取出的液体，加入液体体积30%~40%的无水乙醇洗涤，震荡，离心，弃去上清液，重复3~5次再将所得物质冷冻干燥。本操作为纯化操作，以提高产物的纯度。
本发明的有益效果是：
1、本发明首先使用室温固相法制得多肽锌螯合物，再以N2和Vc作为Fe2+保护剂，使剩余的多肽与Fe2+发生螯合反应，制得多肽锌铁复合补剂，生产过程安全可靠，不会给环境造成负担。
2、制备的多肽锌铁补剂能同时为人体补充铁锌元素，化学稳定性好，吸收好。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
（1）称取鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末（平均分子量6000，大小80目，鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末是将鱿鱼皮通过现有常规的酶解工艺而得，由于酶解鱿鱼皮制备胶原蛋白多肽为现有技术，在此不做赘述），使其与硫酸锌质量比为2:1，置于研钵中研磨10分钟，形成多肽锌螯合体系，加入NaOH溶液（质量分数30%的水溶液），NaOH溶液的加入标准为使得NaOH质量为鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末质量的1/15，继续研磨30分钟，制得多肽锌螯合物粗品。
（2）将Vc和FeCl2粉末溶于蒸馏水中得FeCl2溶液，其中FeCl2浓度为1.4 mol/L，Vc的浓度为0.01mol/L；将步骤（1）制得的多肽锌螯合物粗品溶于蒸馏水中，得质量分数为40%的多肽锌螯合物水溶液。将多肽锌螯合物水溶液与FeCl2溶液等体积混合，形成多肽锌铁螯合体系，用盐酸调节体系pH为4，N2保护下，搅拌反应40分钟，得多肽锌铁复合补剂粗品。
（3）将步骤（2）制得多肽锌铁复合补剂粗品在分子量为4500Da的纤维素膜透析袋中用蒸馏水进行透析，每8小时更换一次蒸馏水，48小时后取出液体，向所得液体加入其30%体积的无水乙醇洗涤，震荡，离心，弃去上清液，重复5次后，将所得物质冷冻干燥，即得多肽锌铁复合补剂。
经检测，锌元素螯合率：86.45%，铁元素螯合率：77.38%。
实施例2
（1）称取鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末（平均分子量6000，大小80目），使其与硫酸锌质量比为2:1，置于研钵中研磨20分钟，形成多肽锌螯合体系，加入NaOH溶液（质量分数40%的水溶液），NaOH溶液的加入标准为使得NaOH质量为鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末质量的1/12，继续研磨40分钟，制得多肽锌螯合物粗品。
（2）将Vc和FeCl2粉末溶于蒸馏水中得FeCl2溶液，其中FeCl2浓度为1.5 mol/L，Vc的浓度为0.02mol/L；将步骤（1）制得的多肽锌螯合物粗品溶于蒸馏水中，得质量分数为50%的多肽锌螯合物水溶液。将多肽锌螯合物水溶液与FeCl2溶液等体积混合，形成多肽锌铁螯合体系，用盐酸调节体系pH为5，N2保护下，搅拌反应50分钟，得多肽锌铁复合补剂粗品。
（3）将步骤（2）制得多肽锌铁复合补剂粗品在分子量为4500Da的纤维素膜透析袋中用蒸馏水进行透析，每8小时更换一次蒸馏水，48小时后取出液体，向所得液体加入其1/3体积的无水乙醇洗涤，震荡，离心，弃去上清液，重复4次后，将所得物质冷冻干燥，即得多肽锌铁复合补剂。
经检测，锌元素螯合率：83.22%，铁元素螯合率：77.94%。
实施例3
1）称取鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末（平均分子量6000，大小100目），使其与硫酸锌质量比为4:1，置于研钵中研磨30分钟，形成多肽锌螯合体系，加入NaOH溶液（质量分数50%的水溶液），NaOH溶液的加入标准为使得NaOH质量为鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末质量的1/10，继续研磨60分钟，制得多肽锌螯合物粗品。
（2）将Vc和FeCl2粉末溶于蒸馏水中得FeCl2溶液，其中FeCl2浓度为1.6 mol/L，Vc的浓度为0.03mol/L；将步骤（1）制得的多肽锌螯合物粗品溶于蒸馏水中，得质量分数为60%的多肽锌螯合物水溶液。将多肽锌螯合物水溶液与FeCl2溶液等体积混合，形成多肽锌铁螯合体系，用盐酸调节体系pH为6，N2保护下，搅拌反应60分钟，得多肽锌铁复合补剂粗品。
（3）将步骤（2）制得多肽锌铁复合补剂粗品在分子量为4500Da的纤维素膜透析袋中用蒸馏水进行透析，每8小时更换一次蒸馏水，48小时后取出液体，向所得液体加入其40%体积的无水乙醇洗涤，震荡，离心，弃去上清液，重复3次后，将所得物质冷冻干燥，即得多肽锌铁复合补剂。
经检测，锌元素螯合率：87.26%，铁元素螯合率：79.51%。
螯合率测定方法如下：
1、锌元素的螯合率测定
准确称取多肽锌螯合体系混合物5.0g于150ml容量瓶中，用蒸馏水定容，用EDTA络合法测定锌的含量。另取多肽锌铁复合补剂5.0g于150ml容量瓶中，用蒸馏水定容，用EDTA络合法测定锌的含量。
锌的螯合率%=(C×V1)/(C×V0)×100%，V0为滴定多肽锌螯合体系消耗的EDTA体积，V1为滴定多肽锌铁复合补剂消耗的EDTA体积。
EDTA法测定锌含量：
准确移取20ml试液于锥形瓶中，加入37ml蒸馏水，滴加2-3滴二甲酚橙指示剂，用0.025mol/LEDTA溶液滴定，溶液由紫色变为亮黄色即为滴定终点。
2、铁元素的螯合率测定
将多肽锌铁螯合体系液体烘干，准确称取5.0g用蒸馏水溶解，250ml容量瓶定容，移取1mL，用邻菲罗啉比色法测定铁的含量。另准确称取多肽锌铁复合补剂5.0g用蒸馏水溶解，250ml容量瓶定容，移取1mL，用邻菲罗啉比色法测定铁的含量。
铁的螯合率%=m 1 /m 0 ×100%
m1为多肽锌铁复合补剂中铁的总量，m0为反应体系中铁的总量，A1，A0分别为邻菲罗啉比色法测得对应的吸光度。
邻菲罗啉比色法测定铁含量：
标准曲线绘制：准确吸取25μg/mL铁标准溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别移入具塞试管中，再分别加2mL 5％ 盐酸羟胺和5mL 1mol／L醋酸一醋酸钠缓冲溶液，混匀，放置0.5h后，再加入2mL 0.12％邻菲罗啉溶液，用蒸馏水定容，以空白为参比，在波长510nm处，测得标准溶液系列的吸光度为纵坐标，以铁标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。在30-85μg/mL的浓度范围内，标准曲线的方程为：A=0.0063C+0.0405，r=0.998。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (1)
1.一种多肽锌铁补剂的制备方法，其特征在于：所述的制备方法步骤如下：
（1）将鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末与硫酸锌按质量比2~4：1的比例混合，置于研钵中研磨10~30分钟，然后加入NaOH溶液，NaOH溶液的加入标准为使得NaOH质量为鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末质量的1/15~1/10，继续研磨30~60分钟，制得多肽锌螯合物粗品；所述的鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末的分子量为5800~6200，鱿鱼皮胶原蛋白多肽粉末大小为80~100目；所述的NaOH溶液中NaOH的质量分数为30~50%；
（2）将Vc和FeCl2粉末溶于蒸馏水中得FeCl2溶液，其中FeCl2浓度为1.4~1.6 mol/L，Vc的浓度为0.01~0.03mol/L；将步骤（1）制得的多肽锌螯合物粗品溶于蒸馏水中，得质量分数为40%~60%的多肽锌螯合物水溶液，将多肽锌螯合物水溶液与FeCl2溶液等体积混合，再用盐酸调节pH为4~6，在N2保护下，室温搅拌反应40~60分钟，制得多肽锌铁复合补剂粗品；
（3）将步骤（2）制得多肽锌铁复合补剂粗品离心，所述的离心为在4500r/min~5000r/min下离心15~20min，取上清液，在分子量为4500Da的纤维素膜透析袋中用蒸馏水进行透析，每8小时更换一次蒸馏水，48小时后取出，透析后取出的液体，加入液体体积30%~40%的无水乙醇洗涤，震荡，离心，弃去上清液，重复3~5次再将所得物质冷冻干燥，即得多肽锌铁复合补剂。
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