CN116970072B - 一种胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胶原蛋白技术领域，具体公开了一种胶原蛋白肽的制备方法，该方法包括：使用胶东海参和牡蛎制作海鲜蛋白粉；处理海鲜蛋白粉并制成胶原蛋白肽；制作螯合有铁离子和锌离子的胶原蛋白肽。本发明使用恒温高压罐，能够增加螯合反应速率，提高铁离子、锌离子与胶原蛋白肽的结合度，采用分步结合与间断式重复法添加反应物，在维持螯合反应酸碱度的环境下，能够提高胶原蛋白肽的使用率，减少胶原蛋白肽的浪费，增加胶原蛋白肽‑铁‑锌螯合物产出量，提高胶原蛋白肽的抗氧化性和清除机体自由基的能力。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白技术领域，特别涉及一种胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
胶原蛋白肽具有多种生物活性，是胶原蛋白由水解酶分解后得到的小分子肽，能够为人体提供生长所需的物质，胶原蛋白肽具有特殊的氨基酸序列和结构，使其能够与人体所需的微量元素进行螯合反应，这种螯合反应能够赋予胶原蛋白肽新的性质和功能，全面补充人体所需物质。
铁和锌是人体经常缺少的微量元素，能够与胶原蛋白肽进行螯合并随着胶原蛋白肽在人体中的代谢轨迹，快速补充到全身，现有技术在胶原蛋白肽同时与铁和锌螯合时具有螯合率低，螯合产物不稳定，胶原蛋白肽与铁离子和锌离子结合位点易断开等问题，最终导致螯合过程中储存时间短，胶原蛋白用量大，成本增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白肽的制备方法，能够增加螯合反应速率，提高铁离子、锌离子与胶原蛋白肽的结合度，提高胶原蛋白肽的使用率，减少胶原蛋白肽的浪费，增加胶原蛋白肽-铁-锌螯合物产出量，且能够提高胶原蛋白肽的抗氧化性和清除机体自由基的能力。
为了达成以上目的，本发明采取的技术方案为：一种胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，使用胶东海参和牡蛎制作海鲜蛋白粉；
步骤二，处理海鲜蛋白粉并制成胶原蛋白肽；
步骤三，制作螯合有铁离子和锌离子的胶原蛋白肽。
作为本发明的进一步方案，在步骤一中，对清洗干净且去除内脏和皮的胶东海参和牡蛎进行液氮浸泡处理3-4h，随后使用40℃水浴30-60min，再放入液氮5-6h，最后打碎研磨成粉，胶东海参和牡蛎中海参的质量占比为10%-90%之间。
作为本发明的进一步方案，在步骤二中，海鲜蛋白粉制备成胶原蛋白肽的脱脂过程中，使用高压震荡的方式辅助进行脱脂，所用压力值为200-300Mpa，震荡频率为800-1000Hz。
作为本发明的进一步方案，在步骤二中，除去海鲜蛋白粉中的钙，使用螯合反应，所用试剂为乙二胺四乙酸。
作为本发明的进一步方案，在海鲜蛋白粉除钙体系中，加入乙二胺四乙酸后，使用20-25Hz的超声波结合37℃水浴进行海鲜蛋白粉的脱钙。
作为本发明的进一步方案，在步骤二中，在处理海鲜蛋白粉的过程中，使用磷酸氢盐和碳酸氢盐缓冲液去除海鲜蛋白粉中的杂蛋白，使用0.3-0.6mol/L的冰乙酸对提取胶原白的体系环境进行酸化后，加入7-9%的胃蛋白酶消化12h。
作为本发明的进一步方案，在步骤二中，在获取胶原蛋白溶液后，再经过盐析、透析和干燥，获取纯化后的胶原蛋白，再次使用冰乙酸对提取的胶原蛋白溶解，使用碳酸钠调节碱性蛋白酶的PH值在7-9，进行胶原蛋白酶解，其中酶解温度控制在45-50℃，使用95-100℃的水浴灭活碱性蛋白酶，使用离心机取上清，放置室内，降温至25℃，使用分子截留超滤渗析膜筛选小于3Kda的胶原蛋白肽，放置冰箱降至0℃，再进行液氮雾气干燥。
作为本发明的进一步方案，在步骤三中，胶原蛋白肽螯合铁离子的螯合物为硫酸亚铁和氯化亚铁，胶原蛋白肽螯合锌离子的螯合物为硫酸锌和乳酸锌，在螯合反应体系中，酸碱度为4-6，温度为20-30℃，反应时间为50-70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为3-5：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至4-6，加入硫酸亚铁和氯化亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽、硫酸锌和乳酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
本发明步骤三中，为了获取优异的螯合反应参数，对螯合反应体系中的不同酸碱度、温度和反应时间进行多因素分析，综合对比不同水平因素影响下胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，其中，恒定胶原蛋白肽和金属离子添加比例为4:1，分析不同酸碱、温度和反应时间的影响系数，首先对比线性曲线，对数曲线以及指数曲线在基于不同酸碱、温度和反应时间数据上的拟合度，确立对数曲线和指数曲线的拟合度高于线性曲线，随后以对数曲线和指数曲线相结合的形式，进行不同水平因素影响下胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量的综合相关性分析，所用的分析公式为：
Y=(alnT-blnp)/(e-ct)；
其中，Y为胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，a为不同温度对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数，b为不同酸碱度对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数,c为不同反应时间对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数，T为螯合反应中的不同温度值，p为螯合反应中的不同酸碱度值，t为螯合反应中的不同反应时间值。
确立螯合反应参数后，进行螯合物添加比例的优异值分析，所用螯合物为胶东海参和牡蛎制备的胶原蛋白肽以及铁锌金属离子，在分析过程中，使用单因素分析法分析铁锌金属离子对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响，使用单因素线性曲线和对数线性曲线进行结合分析，再通过螯合物添加比例的数据与真实胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物产量的结果进行验证，确立最终分析的结果中曲线拟合度大于0.85时，确立螯合物添加比例的优异值，所用确立螯合物添加比例的公式为：
Y=(r0+r1x2-r2lnx)/(x1/3+lnx)；
其中，Y为胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，r0为单因素线性曲线和对数线性曲线结合分析中的常数，r1为单因素线性曲线的相关系数，r2为对数曲线的相关系数，x为螯合物添加比例。
本发明的有益技术效果为：
1.使用液氮反复对牡蛎和胶东海参进行冻融，能够让牡蛎和胶东海参变脆，打磨出的粉粒更为细致，便于胶原蛋白肽的提取，高压震颤辅助去脂，在去除脂质上有着更为优异的性能，应用超声波除钙，能够加速粉粒中钙离子的去除，增加胶原蛋白的提取率，且在胶原蛋白酶解中能够快速得到胶原蛋白肽；
2.在胶原蛋白肽螯合铁和锌的过程中，使用恒温高压罐，能够维持螯合反应体系的反应温度，且不断变化压强，能够增加螯合反应速率，提高铁离子、锌离子与胶原蛋白肽的结合度；获取优异的螯合反应参数和螯合物添加比例的优异值，采用分步结合，间断式重复添加反应物，在维持螯合反应酸碱度的环境下，能够提高胶原蛋白肽的使用率，减少胶原蛋白肽的浪费，增加胶原蛋白肽-铁-锌螯合物产出量，提高胶原蛋白肽的抗氧化性和清除机体自由基的能力。
该方法中未涉及部分均与现有技术相同或能够采用现有技术加以实现。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理，特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，一种胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，使用胶东海参和牡蛎制作海鲜蛋白粉，对清洗干净且去除内脏和皮的胶东海参和牡蛎进行液氮浸泡处理3-4h，随后使用40℃水浴30-60min，再放入液氮5-6h，最后打碎研磨成粉，胶东海参和牡蛎中海参的质量占比为10%-90%之间；
步骤二，处理海鲜蛋白粉并制成胶原蛋白肽，海鲜蛋白粉制备成胶原蛋白肽的脱脂中，使用高压震荡的方式辅助进行脱脂，所用压力值为200-300Mpa，震荡频率为800-1000Hz；在海鲜蛋白粉除钙体系中，加入乙二胺四乙酸后，使用20-25Hz的超声波结合37℃水浴进行海鲜蛋白粉的脱钙；在处理海鲜蛋白粉的过程中，使用磷酸氢盐和碳酸氢盐缓冲液去除海鲜蛋白粉中的杂蛋白，使用0.3-0.6mol/L的冰乙酸对提取胶原白的体系环境进行酸化后，加入7-9%的胃蛋白酶消化12h；在获取胶原蛋白溶液后，再经过盐析、透析和干燥，获取纯化后的胶原蛋白，再次使用冰乙酸对提取的胶原蛋白溶解，使用碳酸钠调节碱性蛋白酶的PH值在7-9，进行胶原蛋白酶解，其中酶解温度控制在45-50℃，使用95-100℃的水浴灭活碱性蛋白酶，使用离心机取上清，放置室内，降温至25℃，使用分子截留超滤渗析膜筛选小于3Kda的胶原蛋白肽，放置冰箱降至0℃，再进行液氮雾气干燥；
步骤三，制作螯合有铁离子和锌离子的胶原蛋白肽。
胶原蛋白肽螯合铁离子的螯合物为硫酸亚铁和氯化亚铁，胶原蛋白肽螯合锌离子的螯合物为硫酸锌和乳酸锌，在螯合反应体系中，酸碱度为4-6，温度为20-30℃，反应时间为50-70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为3-5：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至4-6，加入硫酸亚铁和氯化亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽、硫酸锌和乳酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
为了获取优异的螯合反应参数，对螯合反应体系中的不同酸碱度、温度和反应时间进行多因素分析，综合对比不同水平因素影响下胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，其中恒定胶原蛋白肽和金属离子添加比例为4:1，分析不同酸碱、温度和反应时间的影响系数，首先对比线性曲线，对数曲线以及指数曲线在基于不同酸碱、温度和反应时间数据上的拟合度，确立对数曲线和指数曲线的拟合度高于线性曲线，随后以对数曲线和指数曲线相结合的形式，进行不同水平因素影响下胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量的综合相关性分析，所用的分析公式为：
Y=(alnT-blnp)/(e-ct)；
其中，Y为胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，a为不同温度对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数，b为不同酸碱度对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数,c为不同反应时间对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响的相关系数，T为螯合反应中的不同温度值，p为螯合反应中的不同酸碱度值，t为螯合反应中的不同反应时间值。
确立螯合反应参数后，进行螯合物添加比例的优异值分析，所用螯合物为胶东海参和牡蛎制备的胶原蛋白肽以及铁锌金属离子，在分析过程中，使用单因素分析法分析铁锌金属离子对胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量影响，使用单因素线性曲线和对数线性曲线进行结合分析，再通过螯合物添加比例的数据与真实胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物产量的结果进行验证，确立最终分析的结果中曲线拟合度大于0.85时，确立螯合物添加比例的优异值，所用确立螯合物添加比例的公式为：
Y=(r0+r1x2-r2lnx)/(x1/3+lnx)；
其中，Y为胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物的产量，r0为单因素线性曲线和对数线性曲线结合分析中的常数，r1为单因素线性曲线的相关系数，r2为对数曲线的相关系数，x为螯合物添加比例。
实施例1。
基于以上步骤，选用胶东海参和牡蛎进行制作胶原蛋白肽，使用前，用100摄氏度热水处理去除内脏和皮的胶东海参牡蛎10min，再使用一蒸水清洗，清洗结束后开始胶原蛋白肽的提取，提取的步骤为：
步骤1，使用胶东海参和牡蛎进行制作胶原蛋白，制作海鲜蛋白粉前，先对海鲜蛋白粉进行液氮浸泡处理4h，随后使用40℃水浴60min，再放入液氮5h，最后打碎研磨成粉，胶东海参和牡蛎中海参的质量占比为50%；
步骤2，进行海鲜蛋白粉制备成胶原蛋白肽的脱脂，使用乙酸乙酯有机溶剂与的海鲜蛋白粉中的脂质作用，期间使用高压震荡的方式，辅助进行脱脂，所用压力值为250Mpa，震荡频率为850Hz，脱脂结束后，使用恒温离心机，在4℃，12000rpm的转速下进行离心，去除上清，清洗沉淀；
步骤3，除去海鲜蛋白粉中的钙，使用乙二胺四乙酸与步骤2中的沉淀进行螯合反应，将反应体系放入37℃的水浴锅中，使用20Hz的超声波辅助除钙；
步骤4，使用磷酸氢盐和碳酸氢盐缓冲液去除海鲜蛋白粉中的杂蛋白，能够溶解杂蛋白，留下胶原蛋白；
步骤5，使用0.3-0.6mol/L的冰乙酸对提取胶原白的体系环境进行酸化后，加入7-9%的胃蛋白酶消化12h，其中酶解温度控制在50℃，使用95的水浴灭活碱性蛋白酶，使用碳酸钠调节碱性蛋白酶的PH值在7，进行胶原蛋白酶解；
步骤6，在获取胶原蛋白肽溶液后，再经过往溶液中加入氯化钠，改变胶原蛋白肽溶液中的溶解度，从而析出胶原蛋白肽，再使用冰乙酸溶解胶原蛋白肽，使用透析带及逆行透析，和干燥，获取纯化后的胶原蛋白，再次使用冰乙酸对提取的胶原蛋白溶解，使用离心机取上清，放置室内，降温至25℃，使用分子截留超滤渗析膜筛选1-20Kda的胶原蛋白肽，放置冰箱降至0℃，再进行液氮雾气干燥，最终获取牡蛎的胶原蛋白肽。
实施例2。
对实施例1中获取的不同大小胶原蛋白肽的抗氧化能力以及清除自由基的能力进行检测，目的为选出具有高抗氧化能力的胶原蛋白肽，其中，清除自由基能力的检测使用分光光度计仪器进行吸光度值变化的统计，检测自由基的类别为羟自由基和超氧阴离子，此外，引入DPPH和ABTS法进行不同大小牡蛎胶原蛋白肽对自由基清除能力的佐证，检测胶原蛋白肽的浓度为10mg/kg，所得结果如表1：
表1.不同大小胶原蛋白肽清除自由基能力的检测
实施例3。
本实施例基于实施例2的数据结果，使用分子截留超滤渗析膜筛选出小于3Kda的胶原蛋白肽，用于制作胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，所用铁离子为硫酸亚铁所用锌离子为硫酸锌，在螯合反应体系中，酸碱度为6，温度为30℃，反应时间为60min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为3：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至6，加入硫酸亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽和硫酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
通过计算螯合反应中铁和锌的质量与螯合反应中螯合物的质量的比值，统计胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，螯合率为80.8%。
实施例4。
本实施例基于实施例2的数据结果，在螯合反应体系中，设置酸碱度为5，温度为25℃，反应时间为65min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为5：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至5，加入硫酸亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽和硫酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
通过计算螯合反应中铁和锌的质量与螯合反应中螯合物的质量的比值，统计胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，螯合率为89.5%。
实施例5。
本实施例基于实施例2的数据结果，在螯合反应体系中，设置酸碱度为5，温度为20℃，反应时间为70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为4：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至5，加入硫酸亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽和硫酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
通过计算螯合反应中铁和锌的质量与螯合反应中螯合物的质量的比值，统计胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，螯合率为91.3%。
实施例6。
本实施例基于实施例2的数据结果，使用分子截留超滤渗析膜筛选出小于3Kda的胶原蛋白肽，用于制作胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，所用铁离子为硫酸亚铁和氯化亚铁，所用锌离子为硫酸锌，在螯合反应体系中，设置酸碱度为5，温度为20℃，反应时间为70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为4：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至5，加入硫酸亚铁和氯化亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽和硫酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
通过计算螯合反应中铁和锌的质量与螯合反应中螯合物的质量的比值，统计胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，螯合率为93.9%。
实施例7。
本实施例基于实施例2的数据结果，使用分子截留超滤渗析膜筛选出小于3Kda的胶原蛋白肽，用于制作胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，所用铁离子为硫酸亚铁和氯化亚铁，所用锌离子为硫酸锌和乳酸锌，在螯合反应体系中，设置酸碱度为5，温度为20℃，反应时间为70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为4：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至5，加入硫酸亚铁和氯化亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽、硫酸锌和乳酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇溶解，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
通过计算螯合反应中铁和锌的质量与螯合反应中螯合物的质量的比值，统计胶原蛋白肽-铁-锌螯合物，螯合率为95.0%。
实施例8。
检测实施例3-7中胶原蛋白肽-铁-锌螯合物的抗氧化能力，以及与小于3kda的胶原蛋白肽抗氧化能力进行对比，检测指标为羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力，对比结果如表2所示：
表2.实施例3-7胶原蛋白肽-铁-锌螯合物和小于3kda的胶原蛋白肽抗氧化能力的对比
由实施例3-7胶原蛋白肽-铁-锌螯合物和小于3kda的胶原蛋白肽抗氧化能力对比结果可知，使用铁和锌离子螯合胶原蛋白肽对胶原蛋白肽本身的抗氧化能力并无不良影响，且具有提高胶原蛋白肽抗氧化，清除自由基的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，使用胶东海参和牡蛎制作海鲜蛋白粉；
步骤二，处理海鲜蛋白粉并制成胶原蛋白肽；海鲜蛋白粉制备成胶原蛋白肽的脱脂过程中，使用高压震荡的方式辅助进行脱脂，所用压力值为200-300Mpa，震荡频率为800-1000Hz；除去海鲜蛋白粉中的钙，使用螯合反应，所用试剂为乙二胺四乙酸；在海鲜蛋白粉除钙体系中，加入乙二胺四乙酸后，使用20-25Hz的超声波结合37℃水浴进行海鲜蛋白粉的脱钙；在处理海鲜蛋白粉的过程中，使用磷酸氢盐和碳酸氢盐缓冲液去除海鲜蛋白粉中的杂蛋白，使用0.3-0.6mol/L的冰乙酸对提取胶原蛋白的体系环境进行酸化后，加入7-9%的胃蛋白酶消化12h；在获取胶原蛋白溶液后，再经过盐析、透析和干燥，获取纯化后的胶原蛋白，再次使用冰乙酸对提取的胶原蛋白溶解，使用碳酸钠调节碱性蛋白酶的PH值在7-9，进行胶原蛋白酶解，其中酶解温度控制在45-50℃，使用95-100℃的水浴灭活碱性蛋白酶，使用离心机取上清，放置室内，降温至25℃，使用分子截留超滤渗析膜筛选小于3Kda的胶原蛋白肽，放置冰箱降至0℃，再进行液氮雾气干燥；
步骤三，制作螯合有铁离子和锌离子的胶原蛋白肽，胶原蛋白肽螯合铁离子的螯合物为硫酸亚铁和氯化亚铁，胶原蛋白肽螯合锌离子的螯合物为硫酸锌和乳酸锌，在螯合反应体系中，酸碱度为4-6，温度为20-30℃，反应时间为50-70min，胶原蛋白肽和金属离子添加比例为3-5：1，具体的螯合步骤为：
步骤S1，使用超蒸水溶解胶原蛋白肽，加入维生素C，用于增强反应体系中的抗氧化能力，加入冰乙酸调节酸碱度至4-6，加入硫酸亚铁和氯化亚铁，在恒温高压罐中反应，压强为150-200kpa，其中，恒温高压罐中填充的气体为氮气；
步骤S2，在反应至40min时，在螯合反应体系中加入柠檬酸，再加入胶原蛋白肽、硫酸锌和乳酸锌；
步骤S3，将冰乙酸和柠檬酸按照1：3的比例混合后，加入螯合体系，并在反应10min后，加入硫酸亚铁和硫酸锌的混合物；
步骤S4，使用透析膜，透析除去游离铁离子和锌离子，并使用无水乙醇沉淀，使用75%乙醇清洗，液氮雾气干燥，获取胶原蛋白肽螯合铁-锌螯合物粉末。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，在步骤一中，对清洗干净且去除内脏和皮的胶东海参和牡蛎进行液氮浸泡处理3-4h，随后使用40℃水浴30-60min，再放入液氮5-6h，最后打碎研磨成粉，胶东海参和牡蛎中海参的质量占比为10%-90%之间。
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