CN106538844A - 一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，该方法具体如下：将海洋鱼加工下脚料通过碱性复合蛋白酶酶解，离心过滤得到蛋白肽溶液；调节蛋白肽溶液pH值，加入可溶性铜盐进行螯合反应；螯合反应结束后，将反应液通过纳滤系统，去除游离的铜离子，滤出液三效浓缩后进行高温喷雾干燥，即得海洋生物蛋白肽螯合铜。本发明产品中铜螯合率高，添加到饲料中可显著增强动物体内酶的活性，提高蛋白质、脂肪和维生素的利用率，从而提高动物的生长性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，属于饲料添加剂技术领域。
背景技术
铜是动物体所必需的微量元素之一，它在动物体内参与血红蛋白的合成和某些氧化酶的合成与激活，铜的缺乏会影响动物体对铁的利用，从而产生贫血，因此，铜作为一种高效且低廉的添加剂，已在动物生产中进行了广泛应用。但第一代无机铜，如硫酸铜、氯化铜等，这些无机铜添加剂量大，吸收利用率低，与其他营养素之间存在拮抗，因此由其引起的动物中毒、畜产品安全和环境污染等问题越来越为人们所重视。
继第一代无机盐和第二代有机酸盐之后，出现了第三代氨基酸螯合物。氨基酸螯合铜吸收效率高、口感好、对胃肠无刺激，但是价格昂贵、专一性强，且存放过程中易聚合形成不易被机体吸收的化合物。蛋白肽螯合铜较氨基酸螯合铜更稳定，具有吸收快、不易饱和、耗能低、与氨基酸无竞争吸收等优点。同时蛋白肽螯合铜还具有很好的营养优势：吸收利用率高；生物学效价高；适口性强，毒副作用小；增强免疫力，提高抗病、抗应激能力；添加剂量小，有利于环保。目前市场上关于蛋白肽螯合铜的报道非常少，尤其是海洋生物蛋白肽螯合铜尚属于空白领域，亟待开发研究并形成产业化。
张俊敏等《鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜工艺条件探究》中以鳕鱼皮胶原蛋白肽作为原料,合成了鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜,运用正交实验优选鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜最佳实验条件。实验结果表明,鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜最佳的实验条件是:铜盐与肽摩尔比为2∶1、反应时间为115 min、pH为6.5以及反应温度为65℃。采用水相合成法制备鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜,以紫外分光光谱、红外分光光谱以及TG热稳定性分析对产物进行表征。该研究中胶原蛋白肽螯合铜产物中螯合率低、蛋白肽载铜量低，不利于实现产业化。
本发明旨在提供一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，该方法能有效提高铜螯合率，提高蛋白肽螯合铜补铜效果，同时降低环境污染是本发明需要解决的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，该制备工艺通过蛋白肽与可溶性铜盐螯合的方式得到蛋白肽铜，采用该工艺制备得到的产品螯合铜含量高，铜螯合率高，同时蛋白肽活性高，可为实现鱼资源的综合利用、提高其附加值开辟新的途径。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其具体包括如下步骤：
（1）将海洋鱼加工下脚料通过碱性复合蛋白酶酶解，离心过滤得到蛋白肽溶液；
（2）调节蛋白肽溶液pH值，加入可溶性铜盐进行螯合反应；
（3）螯合反应结束后，将反应液通过纳滤系统，除去游离的铜离子，滤出液三效浓缩进行高温喷雾干燥，即得海洋生物蛋白肽螯合铜。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，还包括后处理步骤，所述的后处理步骤具体包括如下步骤：纳滤系统产生的含游离铜离子的废液加入强碱，将铜离子沉淀，过滤分离氢氧化铜沉淀并集中处理。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（1）中海洋鱼加工下脚料通过绞肉机破碎成鱼浆，将鱼浆泵入酶解罐中，调节滤液pH至7.0-9.0，同时升温并将温度维持在50±5℃，向其中添加鱼浆质量0.1%的碱性复合蛋白酶，酶解5-8小时，升温至90℃灭酶30min，经过两步离心处理，第一阶段低速离心4000-5000转/分，离心30-40min，第二阶段高速离心6000-8000转/分，离心15-20min，最终得到酶解蛋白肽溶液。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（1）中碱性复合蛋白酶由米曲霉发酵，以胶原蛋白酶为主并含有脂肪、糖元、核酸等水解酶的复合体，其中胶原蛋白酶占80%左右。米曲霉发酵培养基为10%鱼皮打浆后溶液，0.5%蔗糖，0.1%K2HPO4，0.1%MgSO4，装液量10%，接种量107/ml，在30℃，180r/min下培养84h。将发酵液加入90%饱和度硫酸铵，离心后蒸馏水复溶，冻干即得复合酶。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（1）中得到的酶解蛋白肽溶液中固形物含量在25-30%范围内，蛋白肽的分子量分布在600-1000Da范围内。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（2）中调节蛋白肽溶液pH值在6.5-7.5范围内。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（2）中可溶性铜盐为硫酸铜、氯化铜中的一种或两种。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（2）中蛋白肽溶液与可溶性铜盐中铜的质量比为1:0.02-0.04，螯合温度维持在55-65℃范围内，螯合反应时间为2-4h。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（3）中螯合反应液浓缩至固形物含量在40-50%范围内。
上述所述海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，步骤（3）中最终得到的蛋白肽螯合铜产品螯合铜含量8-14%，铜螯合率88-94%，蛋白肽含量65-70%。
本发明技术具有如下技术优势：本发明中采用蛋白酶法降解鱼下脚料，所得蛋白肽分子量分布稳定且活性高，反应过程中螯合条件温和，螯合铜含量高，铜螯合率高，环保无污染，且制备过程操作步骤简单、可实施性强，成本较低，适合大批量处理鱼下脚料。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述的实施例并不以任何方式限定本发明的专利保护范围。本领域技术人员在本发明技术方案基础上所作出的修饰或替换均应包括在本发明的专利保护范围之内。
实施例1：
将海洋鱼下脚料1000kg用绞肉机破碎成鱼浆，泵入酶解罐中，开启搅拌系统，调节鱼浆pH值至8.0，打开加热系统升温，升至50℃停止加热并保温，加入1kg碱性复合蛋白酶，酶解5h。酶解反应结束后，升温至90℃，灭酶30min，经低速卧式离心机离心30min,经高速碟式离心机离心15min，过滤得到酶解蛋白肽溶液。测定蛋白肽溶液固形物为23%，调节蛋白肽溶液pH至7.0，保持温度在60℃，加入35kg硫酸铜（五水），螯合反应3h。反应液通过纳滤系统，后经三效浓缩浓缩至固形物45%，经干燥塔进行喷雾干燥，得到海洋生物蛋白肽螯合铜，其产品指标为：螯合铜含量13.0%，铜螯合率93.7%，蛋白肽含量66%。同时，纳滤系统产生的含游离铜离子的废液加入氢氧化钠固体，将铜离子沉淀，过滤分离氢氧化铜沉淀并集中处理。
实施例2：
将海洋鱼下脚料5000kg用绞肉机破碎成鱼浆，泵入酶解罐中，开启搅拌系统，调节鱼浆pH值至8.5，打开加热系统升温，升至45℃停止加热并保温，加入5kg碱性复合蛋白酶，酶解7h。酶解反应结束后，升温至90℃，灭酶30min，离心过滤得到蛋白肽溶液。测定蛋白肽溶液固形物为25%，调节蛋白肽溶液pH至7.0，保持温度在60℃，加入175kg硫酸铜，螯合反应3.5h。反应液通过纳滤系统，后经三效浓缩浓缩至固形物50%，经干燥塔进行喷雾干燥，得到海洋生物蛋白肽螯合铜，其产品指标为：螯合铜含量13.1%，铜螯合率93.5%，蛋白肽含量68%。同时，纳滤系统产生的含游离铜离子的废液加入氢氧化钠固体，将铜离子沉淀，过滤分离氢氧化铜沉淀并集中处理。
对比实施例按照张俊敏等《鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜工艺条件探究》中所述的工艺制备得到蛋白肽螯合铜，具体制备步骤如下：
称量一定质量的鳕鱼皮胶原蛋白肽，放置于烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解，调节pH6.5，然后加入一定质量的氯化铜，铜盐与肽摩尔比为2:1，搅拌均匀，在水浴加热65℃条件下，振荡反应115min,待反应结束后，过滤、醇沉、真空烘干6-8小时，得到鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜样品。
实施例3 本发明蛋白肽螯合铜产品其螯合率及蛋白肽载铜量的实验研究
1.试验材料
对比实施例；实施例1组；实施例2组。
实验方法
2.1 螯合率的测定
（1）总铜含量的测定
原理：试样消化后，在pH为5的条件下，EDTA可与铜离子络合，用1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）指示剂指示滴定终点计算铜含量。
试剂：硝酸；盐酸；乙二胺四乙酸二钠标准溶液：c（EDTA-2Na）=0.02mol/L;1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）指示剂：0.2g溶于100ml95%乙醇；氨水：10%溶液；乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5）：82g乙酸钠加25ml乙酸，加水稀释至200ml。
分析步骤：称取0.25g试样，称准0.002g，置于250ml三角瓶中，加入3ml硝酸，加3ml盐酸，温热消化近干，冷却，加入20ml水加热至近干，冷却后加水80ml，用氨水调溶液pH约为5左右，此时溶液呈深蓝色，加入乙酸-乙酸钠缓冲液10ml。加入PAN指示剂3滴，然后加热煮沸，趁热用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定至变黄绿色为终点，同时做空白试验。
结果计算：样品中铜含量X1以质量分数（%）表示，可按式（1）计算：
…………………………（1）
式中：V0- 滴定空白消耗的乙二胺四乙酸二钠标准溶液的体积，单位为毫升（ml）；
V1- 乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，单位为毫升（ml）；
c1- 乙二胺四乙酸二钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；
m1- 样品的质量，单位为克（g）;
0.06355- 每豪摩尔铜的质量克数。
（2）游离铜含量的测定
称取1g样品加入25g无水乙醇，超声10min进行醇沉，5000转/min离心10min，然后过滤取滤液用PAN指示剂法测定铜含量，此铜含量即为游离铜含量。
（3）螯合率的计算
2.2蛋白肽载铜量的测定
蛋白肽载铜量（%）=总铜含量（%）-游离铜含量（%）
3.结果与讨论
表1本发明蛋白肽螯合铜产品与对照样品螯合率及蛋白肽载铜量的对比数据
由表1数据可以看出，本发明蛋白肽螯合铜产品螯合率高于90%，蛋白肽载铜量高于12%，均显著高于对比实施例（螯合率43%左右，蛋白肽载铜量8.7%左右），说明本发明蛋白肽螯合铜螯合率高，蛋白肽载铜量高，成本较低，适合大批量处理鱼下脚料，易实现产业化。
动物实验
1、试验动物与分组
将9周龄健康褐蛋鸡216只随机分成6组，每组设3个重复，每个重复12只，放入按防疫要求消毒后的3层笼舍中饲养，每笼12只。
2、试验设计
选用蛋白肽螯合铜实施例1作为铜源，在相同日粮基础上添加蛋白肽螯合铜，第1组0mg/kg、第2组15mg/kg、第3组30mg/kg、第4组60mg/kg，按常规程序进行免疫、驱虫，每日饲喂两次，自由采食与饮水，定期清理粪便。预试期7d，正式试验期35d。测定血清和肝脏组织铜锌超氧化物歧化酶的活性。基础日粮配方及营养水平见表2。血清和肝脏组织铜锌超氧化物歧化酶的活性见表3。
表2基础日粮配方及营养水平
| 日粮 | 组成 | 营养水平 | |
| 玉米 | 69 | 代谢能（MJ/kg） | 11.9 |
| 豆粕 | 23.1 | 粗蛋白（%） | 16.5 |
| 麦麸 | 4 | 赖氨酸（%） | 0.7 |
| 磷钙 | 1.5 | 蛋氨酸（%） | 0.32 |
| 石粉 | 0.95 | 钙（%） | 0.8 |
| 食盐 | 0.3 | 总磷（%） | 0.6 |
| DL-Met | 0.05 | 有效磷（%） | 0.35 |
| 预混料 | 1 | 铜实测值（mg/kg） | 4.76 |
3、结果
表3 血清和肝脏组织铜锌超氧化物歧化酶活性
铜锌超氧化物歧化酶广泛存在于动物组织内，是抗氧化防御体系所必要的组成成分，是抗自由基毒性的关键酶之一，可有效清除体内的自由基。本试验表明日粮中添加适宜蛋白肽螯合铜可显著提高育成蛋鸡的抗氧化功能和肝脏功能。
需要指出的是，上述实施例虽对本发明作了比较详细的文字描述，但这些文字描述只是对本发明设计思路的简单描述，而不是对本发明思路的限制。任何不超过本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法具体包括如下步骤：
将海洋鱼加工下脚料通过碱性复合蛋白酶酶解，离心过滤得到蛋白肽溶液；
调节蛋白肽溶液pH值，加入可溶性铜盐进行螯合反应；
螯合反应结束后将反应液通过纳滤系统去除游离的铜离子，滤出液三效浓缩进行高温喷雾干燥，即得海洋生物蛋白肽螯合铜。
2.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）具体包括下述步骤：将海洋鱼加工下脚料通过绞肉机破碎成鱼浆，将鱼浆泵入酶解罐中，调节滤液pH至7.0-9.0，同时升温并将温度维持在50±5℃，向其中添加鱼浆质量0.1%的碱性复合蛋白酶酶解5小时，升温至90℃灭酶30min，经过两步离心处理，第一阶段低速离心4000-5000转/分，离心30-40min，第二阶段高速离心6000-8000转/分，离心15-20min，最终得到酶解蛋白肽溶液。
3.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中碱性复合蛋白酶由米曲霉发酵制得，其中米曲霉发酵培养基为10%鱼皮打浆后溶液，0.5%蔗糖，0.1%K2HPO4，0.1%MgSO4，装液量10%，接种量107/ml，在30℃，180r/min下培养84h，将发酵液加入90%饱和度硫酸铵，离心后蒸馏水复溶，冻干即得碱性复合蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（1）中得到的酶解蛋白肽溶液中固形物含量在25-30%范围内，蛋白肽的分子量分布在600-1000Da范围内。
5.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中调节蛋白肽溶液pH值在6.5-7.5范围内。
6.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中可溶性铜盐为硫酸铜、氯化铜中的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（2）中蛋白肽溶液与可溶性铜盐中铜的质量比为1:0.02-0.04，螯合温度维持在55-65℃范围内，螯合反应时间为2-4h。
8.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（3）中滤出液浓缩至固形物含量在40-50%范围内。
9.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：步骤（3）中最终得到的海洋生物蛋白肽螯合铜中螯合铜含量为8-14%，铜螯合率为88-94%，蛋白肽含量为65-70%。
10.根据权利要求1所述的海洋生物蛋白肽螯合铜的制备方法，其特征在于：其还包括后处理步骤，所述的后处理步骤具体包括如下步骤：纳滤系统产生的含游离铜离子的废液加入强碱，将铜离子沉淀，过滤分离氢氧化铜沉淀并集中处理。
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