CN102686118A - 冷冻方法 - Google Patents

Abstract

一种在存在磁场的情况下以非破坏状态对食品、脏器等对象物进行冷冻的方法，其中，磁场的频率为200Hz以上。

Description

冷冻方法

技术领域

本发明涉及冷冻方法。更具体地讲，涉及在存在磁场的情况下，以非破坏状态对食品、脏器等进行冷冻的方法。

背景技术

作为能够抑制对食品等进行冷冻保存时的水分分离和组织破坏，从而在不损害食品的鲜度和味道的情况下进行冷冻的方法，提出过利用磁共振的方法(日本特开2000-325062号公报)。该方法包括如下步骤：对配置于静磁场内的食品等被冷冻物连续地或者间歇地照射规定频率的电磁波，使构成被冷冻物中含有的水分子的氢原子核产生磁共振，使水分的结冰温度下降，从而以通常情况以下的结冰温度进行急速冷冻。由于该方法能够实现不产生细胞破坏的冷冻，所以作为能够融解并重现未损害冷冻前的食品的味觉和味道的食品的方法而得到关注（以下，在本说明书中有时将该冷冻方法称为“磁共振冷冻方法”）。关于能够用于该磁共振冷冻方法的装置等，例如在国际公开WO 01/24647、日本特开2003-139460号公报或者日本特开2004-81133号公报等中有所记载。另外，已揭示了实现如下方法的可能性：通过在食蟹猿的卵巢冷冻中使用磁共振冷冻方法，能够在不破坏细胞的状态下长期地对卵巢进行冷冻保存（山海，第25回日本受精着床学会总会，2007年8月31日）。

磁共振冷冻方法是这样的方法：通过在磁场内冷却对象物而以良好的再现性创造出过冷却状态，并以极短的时间完成此后的从开始冷凝到完全冷凝为止的过程，由此来抑制冷冻过程中的对象物中的细胞破坏。该方法包括如下步骤：向与一般为100Hz以下的交流电源（典型为50Hz或者60Hz的商用交流电源）连接的线圈流入交流电，在线圈中央部形成与交流频率对应的频率的变化磁场，在该磁场内进行对象物的冷却。然而以往，并没有充分理解由交流电形成的变化磁场与过冷却状态之间的关系，尤其是完全没有理解磁场频率与过冷却状态之间的关联。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】日本特开2000-325062号公报

【特许文献2】国际公开WO 01/24647

【专利文献3】日本特开2003-139460号公报

【专利文献4】日本特开2004-81133号公报

【非专利文献】

【非专利文献1】第25回日本受精着床学会总会,Organon Sponsored SpecialSymposium,Cryopreservation and Transplantation of Ovarian Tissue,A Novel Method forCryopreservation of Ovarian Tissue in Cynomolgus Monkeys,2007年8月31日,http://jsfi2007.umin.jp/program.html

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是提供一种在存在磁场的情况下以非破坏状态对食品、脏器等对象物进行冷冻的方法。更具体地讲，本发明的课题是提供一种与现有的磁共振冷冻方法相比，对象物的破坏（例如细胞破坏等）更少的冷冻方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题而进行了深刻研究的结果是，发现了如下情况：在磁共振冷冻方法中，通过使磁场频率比以往的频率(100Hz以下)高，能够改善冷凝开始前的过冷度，并且，通过使磁场频率成为2000Hz左右，能够达到极高的过冷度，能够大幅缩短从冷凝开始到结束为止的时间，以非破坏状态对对象物进行冷冻。本发明正是基于上述认识而完成的。

即，本发明提供了一种磁共振冷冻方法，该方法包括在磁场内冷却对象物的步骤，其中，磁场频率为200Hz以上。

根据本发明的优选方式，提供如下各种方式的上述磁共振冷冻方法，所述各种方式有：磁场频率为1000Hz～10000Hz；磁场强度为0.01mT～0.4mT，优选为0.2mT；在-2℃以下且-40℃以上的范围的温度下进行冷冻：按照每分钟温度下降0.1℃～1.0℃的方式进行上述冷冻。

根据更优选的方式，提供如下各种方式的上述磁共振冷冻方法，所述各种方式有：对象物为食品；对象物为生物个体、或者从活体分离出的脏器或组织；对象物为细胞；对象物为核酸或者蛋白质。

另外，根据其他观点，提供一种使用对从手术中的患者分离/采集的组织进行冷冻而调制出的标本在手术中进行病理诊断的方法，其中，该方法包含利用上述磁共振冷冻方法进行冷冻的步骤。

发明效果

根据本发明所提供的磁共振冷冻方法，与现有的磁共振冷冻方法相比，能够达到更高的过冷度，能够大幅缩短从对象物的冷凝开始到结束为止的时间。其结果，基于本发明的磁共振冷冻方法，能够在实质上未发生破坏的状态下对食品、组织等对象物进行冷冻。

附图说明

图1是作为对照而示出了以磁场频率50Hz进行3次冷冻试验后的温度变化的图。

图2是示出改变磁场频率而求取过冷度的平均值以及方差所得的结果的图。

图3是示出在显微镜下观察非冷冻组织(non-frozen)、和利用急速冷冻法(traditional freezing)、CAS(磁场频率100Hz以下)、以及本发明的方法(2kHz过冷却冷冻)对全身进行冷冻后的小白鼠的脑组织切片所得的结果的图。

图4是示出在显微镜下观察非冷冻组织(non-frozen)、和利用急速冷冻法(traditional freezing)、CAS(磁场频率100Hz以下)、以及本发明的方法(2kHz过冷却冷冻)对全身进行冷冻后的小白鼠的小肠组织切片所得的结果的图。

图5是示出在显微镜下观察非冷冻组织(non-frozen)、和利用急速冷冻法(traditional freezing)、CAS(磁场频率100Hz以下)、以及本发明的方法(2kHz过冷却冷冻)对全身进行冷冻后的小白鼠的肺泡组织切片所得的结果的图。

图6是示出以磁场频率2kHz反复执行6次ALP溶液的冷冻/融解后的ALP活性的图。示出了使用不锈钢管时的结果。

图7是示出以磁场频率2kHz反复执行6次ALP溶液的冷冻/融解后的ALP活性的图。示出了不使用不锈钢管时的结果。

图8示出以磁场频率2kHz反复执行6次GFPP溶液的冷冻/融解后的GFP的荧光强度的图。

具体实施方式

本发明的磁共振冷冻方法的特征在于，在磁场内冷却对象物时，磁场频率为200Hz以上。关于包含了在磁场内冷却对象物的步骤的磁共振冷冻方法的基本概念，例如已经记载于日本特开2000-325062号公报中，而关于应用于该方法的装置等，已经记载于国際公开WO 01/24647、日本特开2003-139460号公报以及日本特开2004-81133号公报等中，所以本领域技术人员通过参照这些刊物能够正确地理解磁共振冷冻方法的概念。通过引证的方式将这些刊物所公开的全部内容包含于本说明书公开的内容中。

在进行磁共振冷冻方法时，需要在形成磁场的线圈中流过交流电流，但是磁场的频率与交流电流的频率一致，所以在本发明的方法中，为了调节磁场的频率，只要调节流入线圈的交流电流的频率即可。例如，可通过能够容易地得到的函数发生器产生期望频率的交流电流，在线圈内形成与该频率对应的频率的磁场。

一般而言，只要磁场的频率为200Hz以上即可，没有特别限定，不过，例如，优选的是选择400Hz以上的频率，更优选的是选择600Hz以上的频率，进一步优选的是选择800Hz以上的频率，特别优选的是选择1000Hz以上的频率。频率的上限没有特别限定，不过，例如为200000Hz以下，优选的是100000Hz以下，更优选的是10000Hz以下，特别优选的是5000Hz以下。根据本发明的优选方式，磁场的频率为1000Hz～10000Hz的范围，特别优选的是2000Hz左右的频率。

磁共振冷冻方法中的磁场强度没有特别限定，可以根据对象物的种类、大小等适宜地选择，不过，例如在冷冻卵巢等小型脏器或者细胞的情况下，例如可以设定为0.01mT～0.4mT，优选设定为0.2mT左右。进行冷冻操作的温度没有特别限定，例如可以在-2℃以下且-40℃以上的范围内进行，优选的是在-20℃以下且-33℃以上的范围或者-20℃以下且-40℃以上的温度下进行。在冷冻时，例如可以使温度以每分钟0.1℃～1.0℃的比例下降，优选的是，使温度以每分钟大约0.5℃的比例下降。优选的是，将开始时的线圈内冷却槽温度设为-2℃左右，并以-0.5℃/分钟的比例使温度下降，例如使最终的线圈内温度成为-33℃。

作为用于磁共振冷冻方法的装置，例如ABI公司（株式会社アビー）已提出了各种装置(http://www.abi-net.co.jp/,CAS:Cell Alive System)，而在进行本发明的磁场共振冷冻法时，只要在这些冷冻装置中添加调节磁场频率的装置即可。例如优选的是，添加如上述那样借助函数发生器向线圈流入交流电流的装置。这些装置中的任何一个都可以作为执行如下功能的装置来提供：在冷冻仓内，通过50Hz或者60Hz的商用交流电流形成磁场，使对象物中的水分子振动，在-10℃左右的温度下创造出不发生冷凝的过冷却状态，并在-20℃以下使全体细胞一下子冷凝起来。通过将磁场的频率提高到上述频率，能够以更低的温度实现过冷却状态，使得对象物以极短的时间从过冷却状态达到完全冷凝状态。另外，可以在冷却槽中填充乙醇或者水/乙二醇的混合物等作为防冻液。

本发明的磁共振冷冻方法所能够冷冻的对象物只要含有水分即可，没有特别的限定，例如可以列举出：蔬菜类、谷类、肉类或者加工食品等食品类；包含人在内的哺乳类动物、昆虫或者线虫等已经死亡的生物个体；卵巢、精巢或者肝脏等从活体分离出的脏器；肌肉、脂肪或者皮肤等从活体分离出的组织；血液、淋巴液或者精液等从活体分离出的体液；培育细胞、卵细胞、精细胞或者受精卵等细胞或细胞小器官；DNA或RNA等核酸类；骨胶原、各种受体或者各种酶等蛋白质类；为了生成病理诊断用标本而从活体分离出的组织切片；或者生理盐水、缓冲液/冷冻保护剂等溶液等，但不限于此。由于本发明的磁共振冷冻方法在冷冻时不会发生组织或细胞的破坏，因此，除了例如食品类的冷冻以外，还适合用于进行卵巢、精巢等脏器或者组织的冷冻的情况。

另外，可使用本发明的磁共振冷冻方法，对从手术中的患者分离/采集的组织进行冷冻，调制病理标本，还可以使用该病理标本在手术中进行病理诊断。例如，可以在患者的手术中，利用本发明的磁共振冷冻方法对从患者分离/采集的组织进行冷冻。手术的种类没有特别限定，可以是侵入性手术或者非侵入性手术中的任意一者，还可以是利用了内窥镜的手术。作为组织，除了例如肿瘤组织等外观上能够识别的病变组织以外，还可以将任意组织作为对象，例如外观上无法与正常组织区分但疑似已被恶性肿瘤所侵染的淋巴组织等。“组织”这一用语除了包含脏器的全部或者一部分以外，还包含体液等，需要按照最广义的方式来解释，在任何含义下都不应限定地进行解释。例如，对于摘除恶性肿瘤的手术而言，可以利用磁共振冷冻法对摘除的恶性肿瘤组织的周边部组织进行冷冻，确认在周边部位不存在恶性肿瘤细胞的情况。

对从患者分离/采集的组织进行冷冻之前的处理没有特别限定，例如可以进行如下处理：使用冰凉的生理盐水等对组织进行清洗，将组织搁到放有包埋剂（例如OCT化合物（フナコシ）等）的包埋盘中，利用莎伦膜（Saran Wrap）等将该组织和包埋盘包好后，放入尼龙袋中，进行排气而密闭起来。不过，可以对该工序进行适当的改变或者修饰，也可以根据情况而适当地省略。

关于从冷冻后的组织调制出切片来制作病理诊断用标本的方法，没有特别限定，可以采用现有的手术中迅速病理诊断法等中使用的通常方法。一般而言，可以从冷冻后的组织调制出几微米（优选为5～7μm左右）的厚度的切片，并将切片贴在载玻片上进行风干，按照通常的方法进行基于苏木精/曙红的染色。通过在显微镜下对这样得到的标本进行观察，确认细胞的形态等，能够进行病理诊断。

另外，从冷冻后的组织调制出几微米（优选为5～7μm左右）的厚度的切片，并将切片贴在载玻片上进行风干，之后，根据需要利用通用的固定液（例如乙醇、丙酮、福尔马林、甲醇、或者其混合物）对组织进行固定，对特定的膜蛋白质作用特殊的抗体（一次抗体），并且进一步作用二次抗体，进行组织免疫化学染色，由此，能够确认标本中的组织的膜蛋白质的存在或者局部存在。在上述方法中，也可以应用只使用一次抗体而不使用二次抗体的染色法。

更具体地讲，例如，可经过冷冻切片制作→固定15秒→PBS清洗10秒（3次）→与HRP标识聚合物结合一次抗体的反应(3分钟)→PBS清洗10秒（5次）→DAB染色2分钟→水洗5秒→5%甲基绿核染色→水洗＋脱水＋透徹＋密封合计20秒的工序，进行染色，但不限于该工序。由此，能够证明在特定疾病的病变组织中存在特异地发现的膜蛋白质，能够确定病理诊断。作为特定的膜蛋白质，例如可以列举出作为癌标记的EMA（上皮性肿瘤标记）等，但不限于此。

【实施例】

以下，通过实施例进一步对本发明进行具体说明，但是，本发明的方法不限于下述的实施例。

例1

在内径40mm、深40mm的铝制冷却槽的外侧配置内径80mm、深80mm的线圈(匝数为6)，将线圈以及冷却槽装在冷却装置(斯特林发动机，Twinbird公司，SC-UD08)上。将用于产生交流电流的函数发生器连接至线圈。使用该装置对1ml的生理盐水(凝固点：-0.65℃)进行冷却而实施了冷冻实验。设磁场强度为0.12±0.02mT、冷却速度为0.8K/min，并且设交流电流的频率为0Hz(无磁场)、50Hz、200Hz、2000Hz、20000Hz或者200000Hz，对不同的磁场频率分别进行了12次实验。图1示出了在磁场频率为50Hz的情况下进行3次试验后的温度变化。对于各次试验，把“过冷度”设为生理盐水的凝固点与过冷却即将消失之前的温度之差的绝对值而进行求取，求出平均值以及方差，针对0Hz(无磁场)的情况，使用Welch95%单侧检测，检测总体平均值的有意差。

结果表示在图2中。在磁场频率为200Hz、2000Hz、20000Hz以及200000Hz中的任何一个频率时，都确认到促进了过冷却的情况，但是，在50Hz的情况下，与0Hz(无磁场)的情况相比，未确认到有意差。

例2

使2只Lewis雌性小白鼠（285g，280g）绝食24小时后，在乙醚麻醉下使它们安乐死，紧接着不摘除脏器而直接用于冷冻实验。在冷冻装置的冷却槽中充满60％的乙二醇，尽可能地排除空气，将封入到尼龙袋中的小白鼠放入带有坠子的测量仪器中，沉入冷却槽。把磁场强度设为0.1mT～0.2mT，在2℃下冷却1小时后，以-0.5℃/分钟的速度进行冷却，一直冷却到-30℃而进行了冷冻。从冷却开始到冷冻结束用了2小时45分钟。磁场频率为2000Hz。

从冷冻组织按照5～7μm的厚度切取组织切片，将切片贴在载玻片上风干30分钟。组织切片的染色是利用苏木精/曙红染色，并通过以下方法进行的。将载玻片浸渍到95%的乙醇中2分钟，用流动水进行清洗；浸渍到苏木精液中1分钟，用流动水进行清洗；浸渍到曙红Y液中30秒，用流动水进行清洗；将载玻片按照70%、80%、90%、100%乙醇的顺序进行脱水后，浸渍到二甲苯中，用屈大麻酚进行密封。作为对照，从在100Hz以下的磁场频率下进行冷冻后的组织、以及用液体氮进行急速冷冻后的控制试料调制出切片，同样地进行了染色。用光学显微镜（×100或者×400）对得到的标本进行了观察。

关于脑(图3)，虽然脑组织自身的构造被破坏，但是，在利用本发明的方法以磁场频率2000Hz进行冷冻后的组织中，确认到在形态上保存了10倍左右的脑神经细胞。关于小肠(图4)，在急速冷冻法以及100Hz以下的磁场频率的情况下，确认到粘膜脱落以及基底膜的组织间空隙，但是在基于本发明的方法的冷冻中，基本未确认到脱落以及空隙。关于肺泡(图5)，在急速冷冻法以及100Hz以下的磁场频率的情况下，肺泡构造被破坏，但是在基于本发明的方法的冷冻中，肺泡构造被保存下来，并且毛细血管内的红血球也被保存下来。

例3

使用碱性磷酸酶(ALP)以及绿色荧光蛋白(GFP)，反复进行基于本发明的方法的冷冻和融解，确认改性的程度。将100μl的样本放入聚乙烯制的样本管中，存储到填充有铝球(直径0.5mm)的不锈钢管(1×1×4cm)中，在磁场频率为30Hz或者2000Hz、磁场强度为0.8mT的条件下，将冷冻条件：以45分钟从30℃到达-40℃、融解条件：冷冻结束后以20分钟到达30℃设为1个周期，反复执行6次冷冻/融解。

使用了ALP的活性测定是通过以下方法进行的。当使样本作用于包含对硝基磷酸苯酯（p-nitrophenyl phosphate）的炭酸盐缓冲液(pH9.8)时，由于检测体中的碱性磷酸酶的作用，对硝基磷酸苯酯分解为对硝基苯酚（p-nitrophenol）和磷酸，生成的对硝基苯酚在碱性侧呈现为黄色。用405nm的吸光度对该呈现的颜色进行测定，由此求出了检测体中的碱性磷酸酶活性值。使用蒸馏水将ALP(10units/μl)稀释150倍(0.67units/μl)，在上述条件下反复进行冷冻/融解，用蒸馏水将第2次、第4次以及第6次融解后的样本稀释1000倍(100％残留时的活性：0.67munits/μl），然后进行了活性测定。同样地在不使用不锈钢管而将样本管沉在铝球上的状态下进行了试验。结果如图6(存在不锈钢管)以及图7(不存在不锈钢管)所示。在以磁场频率2kHz下反复进行了冷冻/融解的情况下，特别是未使用不锈钢管的情况下，在第6次的冷冻/融解后，ALP活性仍有相当程度的残留。通过在磁场内进行冷冻/融解，认为能够抑制冷冻过程中的蛋白质的高次构造的改性，保持酶的活性。

用蒸馏水将GFP(1μg/ml)稀释25倍(40ng/ml)，按上述条件反复进行6次冷冻/融解，用蒸馏水将第2次、第4次以及第6次融解后的样本稀释4倍(100%残留时的含有量：10ng/ml)，照射485nm的激励光，检测出535nm的荧光。结果表示在图8中。以磁场频率2kHz反复进行了冷冻/融解的情况下，在第6次的融解后仍然在GFP中确认到很高的荧光强度。

产业上的可利用性

根据本发明所提供的磁共振冷冻方法，能够大幅缩短从对象物的冷冻开始到结束为止的时间，能够在实质上未发生破坏的状态下对食品、组织等对象物进行冷冻。

Claims (5)

1.一种磁共振冷冻方法，该方法包括在磁场内冷却对象物的步骤，其中，

磁场频率为200Hz以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

磁场频率为1000Hz～10000Hz。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

磁场强度为0.01mT～0.4mT。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中，

在-2℃以下且-40℃以上的范围的温度下，进行冷冻。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中，

按照每分钟温度下降0.1℃～1.0℃的方式进行所述冷冻。

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