JP2019536596A - 羊膜組織グラフトとその調製方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、羊膜組織グラフトの調製方法、並びにそのグラフト自体を提供する。特定の実施形態では、この組織グラフトは、臍帯から得られた単層の乾燥羊膜を含む。

Description

本出願は、羊膜組織グラフトとその調製方法及び使用方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０１６年１１月２日に出願された米国特許仮出願第６２／４１６，５２８号の利益を主張するものである。

組織グラフトは、様々なタイプの外科手術や創傷治療に有用である。グラフト手術で使用される組織は、ヒト又は動物標本から収集されてよい。或いは、グラフト組織は人工的に製作されてよい。ヒトの組織の一原料として胎盤膜があり、胎盤膜は何十年にもわたって外科手術で利用されてきた。

胎盤は、妊娠中に成長して、胎児を取り囲み、胎児を子宮壁につないでいる器官である。この一時的な器官は、ガス及び栄養を胎児に運ぶことを可能にし、同時に他の代謝機能及び内分泌機能を提供する。胎盤膜は２つの組織層からなる。１つは羊膜であり、これは発育中の胎児を取り囲む最も内側の層である。もう１つは絨毛膜であり、これは羊膜及び胎児を取り囲む外側の層である。羊膜は、胎児の周囲に、血管のない、体液によって満たされた嚢を形成して、発育中の胎児を保持及び保護する。

羊膜嚢以外の、別の主要な胎盤構成要素が臍帯である。この紐状構造物は、胎児を胎盤につないでおり、発育中の胎児に栄養を供給し、胎児を支持する。ヒトの臍帯は、典型的には、長さが約５０〜６０ｃｍ、直径が約２ｃｍである。臍帯は、ワルトン膠質と呼ばれる滑らかな保護的間葉物質に取り囲まれた血管で構成されており、これらが全て、羊膜で形成された管に収容されている。

羊膜組織グラフトは、一般に、組織再生や創傷治癒を促進する為に使用される。羊膜グラフトの既知の臨床の処置又は用途として、眼球再建、火傷治療、歯肉組織置換、一般的な創傷ケア等があり、これらに限定されない。

羊膜組織は、外科手術に使用される場合にユニークなグラフト特性を提供する。羊膜組織グラフトには、自己粘着可能なものや、例えば、フィブリン接着剤又は縫合によって所定位置に固定されることが可能なものがある。

典型的には新鮮な膜を使用することが理想的であるが、新鮮な組織を保管できる期間に限りがある為、そのような使い方は困難である。そこで、組織が手術用途で必要になるまでの組織の保全及び保管を容易にする処理方法が必要とされている。組織の処理及び保全の主たる目標は、手術まで持つように十分長い保存可能期間を達成しつつ、新鮮な組織の有用な構成要素を維持することである。適正に調製された羊膜組織グラフトであれば、長期保管が可能である。

本発明は、上記従来技術における問題を解決するためになされたものである。

本発明は、羊膜組織グラフトの調製方法、並びにそのグラフト自体を提供する。特定の実施形態では、組織グラフトは、臍帯から得られた単膜の乾燥羊膜を含む。

一実施形態では、本方法は以下のステップを含む。
ａ）臍帯の羊膜に長手方向の切れ目を入れて、臍帯の内腔の内容物を露出させる。
ｂ）臍帯の内腔から血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成する。
ｃ）任意選択で、創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートする。
ｄ）創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を保持液で洗浄する。
ｅ）洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐ。
ｆ）すすいだ羊膜を乾燥させる。

別の実施形態では、部分的に創面切除された羊膜が取得され、これに対し、更に、洗浄、すすぎ、及び乾燥、並びに任意選択で、洗浄ステップまでの保持による処理が行われる。

乾燥の実施から得られる圧力及び温度のチャートを示す図である。

羊膜は、胎児の発育中の胎盤及び臍帯の内壁を形成する。羊膜には３つの別個の層があり、それらは、上皮細胞からなる単層、厚い基底膜、及び血管のないストロマ層である。羊膜は、ＨＬＡ抗原もＭＨＣ分子も含まない為、免疫学的に特権を与えられた物質である。羊膜の主要な構造的構成要素は、コラーゲン及びタンパク質（フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、グリコサミノグリカンなど）で構成される細胞外マトリックスである。羊膜において見られる他の分子として、成長因子、メタロプロテイナーゼ、及び組織性メタロプロテアーゼ阻害因子があり、これらは細胞外マトリックスと一緒になって、創傷治癒及び細胞内方成長に関与することが可能である。

本発明は、羊膜組織グラフトの調製方法、並びに羊膜組織グラフト自体を提供する。特定の実施形態では、組織グラフトは、臍帯から得られた乾燥単層羊膜を含む。

一実施形態では、本方法は以下のステップを含む。
ａ）臍帯の羊膜に長手方向の切れ目を入れて、臍帯の内腔の内容物を露出させる。
ｂ）臍帯の内腔から血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成する。
ｃ）任意選択で、創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートする。
ｄ）創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を保持液で洗浄する。
ｅ）洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐ。
ｆ）すすいだ羊膜を乾燥させる。

別の実施形態では、部分的に創面切除された羊膜が取得され、これに対し、更に、洗浄、すすぎ、及び乾燥、並びに任意選択で、洗浄ステップまでの保持による処理が行われる。

選択された定義
「被験者」は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトを意味する。本明細書に記載の方法は、ヒト及びヒト以外の動物の両方から羊膜を切り離すことに役立ちうる。実施形態によっては、被験者は哺乳動物である。本発明は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、マウス、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、又はネコの非限定的な例から選択された被験者において用いられてよい。

本明細書では、「羊膜」は臍帯の羊膜を意味する。

「臍帯」は、妊娠中に胎児を胎盤につないでいる、血管を含む紐状構造物を意味する。臍帯は、幾つかある物質の中でも特にワルトン膠質及び血管を含む内腔を取り巻く羊膜壁を含む。

羊膜組織グラフトの形成
一実施形態では、臍帯の全長に沿って羊膜に長手方向の切れ目が入れられる。次に、臍帯が平らに配置されてよく、羊膜を下側にし、羊膜の上に内腔の内容物が来るようにして、ほぼ矩形形状に配置されてよい。羊膜の「創面切除」と呼ばれる処理において、臍帯の内腔内容物が羊膜から取り除かれてよい。創面切除の処理は、適切な道具（例えば、鉗子、はさみ等の手術用具）を使用して、臍帯の内容物を羊膜から切り離すステップを含む。

創面切除ステップの目的は、内腔の内容物を全て、又はほぼ全て、取り除くことである。ワルトン膠質は、アモルファスゲル状の塊であり、ワルトン膠質を１００％取り除くことが可能でない場合があり、或いは１００％取り除かなくてもよい場合がある。従って、本発明の目的上、「臍帯の内腔内容物からワルトン膠質を取り除く」ことは、臍帯の内腔にあるワルトン膠質のおよそ５０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、更には９９％超を羊膜から切り離すことを意味する。従って、創面切除された羊膜には、ワルトン膠質が多少残ってよい。

一実施形態では、ある程度のワルトン膠質が残り、これらは、ワルトン膠質が残らなかったら羊膜組織内に存在するであろう、リッジ間の谷をほぼ埋めるか完全に埋める。

一実施形態では、創面切除ステップはすすぎ液中で実施される。一実施形態では、すすぎ液はリン酸緩衝生理食塩水であって、以下を含む。
１）ＮａＣｌ：７〜１１ｇ／Ｌ、好ましくは８〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは約９ｇ／Ｌ。
２）無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４：０．２〜１．５ｇ／Ｌ、好ましくは約０．５〜１ｇ／Ｌ、より好ましくは約０．８ｇ／Ｌ。
３）ＫＨ_２ＰＯ_４：０．１〜０．２ｇ／Ｌ、好ましくは約０．１５ｇ／Ｌ。

ｐＨが７〜８．８、好ましくは約７．４である。

特定の実施形態では、すすぎ液は、約９ｇ／ＬのＮａＣｌ、約０．８ｇ／Ｌの無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４、約０．１４ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４を含み、ｐＨが約７．４である。

実施形態によっては、すすぎ液はカルシウム又はマグネシウムを含有しない。

一実施形態では、創面切除された羊膜は、保持期間の間、保持液中で保管される。保持期間は約２〜５時間であってよく、具体的には、約２時間、約３時間、約４時間、又は約５時間であってよい。保持ステップは、２０〜３０℃の温度で実施されてよく、好ましくは約２５℃で実施されてよい。

一実施形態では、保持液は以下を含む。
１）ツイーン２０：０．４〜０．６％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）。
２）抗菌性化合物：例えば、０．０４〜０．０６％（ｗ／ｖ）のポリアミノプロピルビグアニド（ポリヘキサメチレンビグアニドヒドロクロリド又はＰＨＭＢとも呼ばれる）。別の実施形態では、抗菌性化合物は、グルコン酸クロルヘキシジンであり、その濃度は、例えば、０．０１〜１．５％であり、より好ましくは０．０３〜０．０８％である。別の抗菌性化合物、例えば、抗生物質又は抗カビ剤とそれらの適切な濃度が当業者には知られており、そのような実施形態は本発明の範囲内である。
３）ＮａＣｌ：７〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは８〜９ｇ／Ｌ、より好ましくは約９ｇ／Ｌ。
４）適切な緩衝剤。ｐＨが６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．０、好ましくは約６．６〜６．８、より好ましくは６．７±０．１。保持液中で使用可能な緩衝剤の一例としてビス−トリスプロパン緩衝剤があり、これは８〜１２ｍＭ、好ましくは９〜１１ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。緩衝剤の別の例として、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ（ＨＥＰＰＳ）、トリシン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳ等がある。

特定の実施形態では、保持液は、約０．５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０と、約９ｇ／ＬのＮａＣｌと、約０．０５％（ｗ／ｖ）のＰＨＭＢと、約１０ｍＭのビス−トリスプロパン緩衝剤とを含み、ｐＨが６．７±０．１である。

一実施形態では、創面切除された羊膜は、保持ステップの有無にかかわらず、洗浄ステップまで約４℃で約１０〜１５時間、保管される。創面切除された羊膜を４℃で保管するステップは、保持液中で実施されてよい。

別の実施形態では、創面切除された羊膜は、保持ステップの有無にかかわらず、洗浄ステップにおいて洗浄される。好ましくは、洗浄ステップは、創面切除された羊膜を保持液中で攪拌することを含む。

洗浄ステップ中の攪拌は、例えば、攪拌機上で、約２〜５時間、具体的には、約２時間、約３時間、約４時間、又は約５時間にわたって実施されてよい。攪拌は、５０〜３００ＲＰＭ（毎分５０〜３００回転）で実施されてよく、好ましくは約１００〜２００ＲＰＭ、より好ましくは約１２５〜１７５ＲＰＭ、更により好ましくは約１５０ＲＰＭで実施されてよい。

一実施形態では、保持ステップにおいて、創面切除された羊膜が保持液中で保管され、その羊膜を攪拌機に移すことにより、同じ保持液中で洗浄ステップが実施される。

洗浄ステップ後、すすぎステップにおいて、洗浄された羊膜のすすぎが行われる。すすぎステップは、上述のすすぎ液中で実施される。特定の実施形態では、すすぎステップで使用されるすすぎ液は、約９ｇ／ＬのＮａＣｌ、約０．８ｇ／Ｌの無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４、及び約０．１４ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４を含み、ｐＨが約７．４である。

一実施形態では、すすぎステップは、３〜５回、すすぎ液中で実施される。各すすぎステップは、約５〜３０分にわたって実施されてよく、好ましくは約１０〜２５分、更により好ましくは約１５分にわたって実施されてよい。

すすぎステップは、攪拌機上で、５０〜３００ＲＰＭで実施されてよく、好ましくは約１００〜２００ＲＰＭ、より好ましくは約１２５〜１７５ＲＰＭ、更により好ましくは約１５０ＲＰＭで実施されてよい。
すすぎステップは、洗浄液の成分をグラフトから取り除き、且つ、創面切除ステップで残った血液又は残骸を取り除くように設計されている。

一実施形態では、すすいだ羊膜を乾燥させる。乾燥ステップは、約５〜２５時間にわたって実施されてよく、好ましくは約１０〜２０時間、更により好ましくは約１５時間にわたって実施されてよい。一実施形態では、乾燥は、大気圧より低い圧力下で実施され、例えば、約１５〜６０ｍＢａｒの圧力下で実施される。減じられた圧力の下での典型的な乾燥処理では、乾燥ステップの開始時に、約４０〜６０ｍＢａｒ、好ましくは４５〜５５ｍＢａｒ、より好ましくは約５０ｍＢａｒの圧力が使用される。図１に示されるように、乾燥ステップの間に、圧力は時間とともに変化してよい。約１２〜１６時間の乾燥処理の終了時の圧力は、例えば、約１０〜１５ｍＢａｒであってよい。

特定の実施形態では、乾燥ステップは、約５０ｍＢａｒの初期圧力下で、３０〜４０℃の温度で約１５時間にわたって実施され、この圧力は、乾燥ステップの終了に向かって約１５ｍＢａｒに減じられる。

本発明の別の実施形態は、臍帯から乾燥羊膜を調製する方法を提供し、この方法は以下のステップを含む。
ａ）部分的に創面切除された羊膜を取得する。
ｂ）血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成する。
ｃ）任意選択で、創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートする。
ｄ）創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を保持液中で洗浄する。
ｅ）洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐ。
ｆ）洗浄された羊膜を乾燥させる。

部分的に創面切除された羊膜は、冷凍された状態で取得されてよく、この場合、冷凍された、部分的に創面切除された羊膜は、解凍されてから、その後の処理が行われる。解凍は、約６〜２０時間にわたって実施されてよく、好ましくは約８〜１５時間、より好ましくは約１０〜１２時間にわたって実施されてよい。解凍は、２０〜３０℃の温度で実施されてよく、好ましくは２２〜２８℃、更により好ましくは約２４〜２５℃で実施されてよい。

血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成するステップと、創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートするステップと、創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を保持液中で洗浄するステップと、洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐステップと、すすいだ羊膜を乾燥させるステップと、については既に説明したが、そのような説明は、部分的に創面切除された羊膜が出発物質である、本発明の実施形態に適用可能である。

羊膜組織グラフト
本発明に従って形成される臍帯／羊膜組織グラフトは、幅が、例えば、０．５〜４ｃｍ、長さが、例えば、２〜６ｃｍであってよい。

一実施形態では、グラフトに、どちらの側が臍帯の外側からのものであって、どちらの側が臍帯の内側からのものであるかを示すしるしが付けられる。一実施形態では、しるしは、グラフトの特定のコーナーに与えられたタブである。本明細書での「タブ」は、グラフトのエッジからの突出を意味する。突出の形状は、例えば、矩形、正方形、又は三角形であってよい。一実施形態では、内皮側を上にしてグラフトを配置すると、タブは左上コーナーにある。タブは、実際に使用される場合には、ユーザが組織グラフトを器具（例えば、鉗子）で掴むことにも役立つ。タブは、組織グラフトを手術部位において姿勢変換することにも役立ち、例えば、ユーザが、組織グラフトを器具（例えば、鉗子）で掴んで所望のとおりに姿勢変換することによって、手術部位において組織グラフトを動かすことが可能である。

本発明に従って調製される組織グラフトは、含水率が２０％を下回るように処理される。含水率は、約１２〜１８％であることが好ましい。好ましい実施形態では、含水率が１５％以下である。

グラフトは、血管、又は絨毛膜組織を含まないことが好ましい。すなわち、グラフトは、典型的には多少のワルトン膠質を含む羊膜組織で構成され、或いは本質的に構成される。

組織グラフトは、（例えば、処理後に）乾燥されると、厚さが約１５０〜２５０μｍであり、好ましくは約１７５〜２２５μｍである。上述のように、組織グラフトは、ある程度のワルトン膠質を含み、これは、表面を滑らかにする（例えば、リッジがあってもごくわずかにする）。グラフトの厚さは均一であることが好ましく、表面全体にわたる変動が２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、更には１％未満、であることが好ましい。

組織グラフトは、電子ビーム照射によって滅菌されてよく、その線量は、例えば、約２５ＫＧｙ未満、好ましくは約１５〜１９ＫＧｙであってよい。

組織グラフトは、生細胞、グリセロール、又は氷晶を含まない。

一実施形態では、グラフトは、例えば、白色度を高める為にアスコルビン酸で処理される。

一実施形態では、グラフトは、グラフトの移植後の感染を軽減及び／又は防止する為に、グラフトとともに存続する抗菌性組成物を塗布又は注入される。抗菌性組成物は、例えば、ポリヘキサニド（ポリヘキサメチレンビグアニド、ＰＨＭＢ）又はグルコン酸クロルヘキシジン（ＣＨＧ）（又は他の、その塩）であってよく、その量は、病原菌が約０．０１〜１．０％、好ましくは約０．０２〜０．０８％のＣＨＧに曝露されるような量であってよい。最も好ましいＣＨＧ濃度は、約０．０３〜０．０５％である。グラフトは他の物質を含んでよく、例えば、成長因子、抗炎症薬、及び幹細胞を含んでよく、これらに限定されない。本明細書に記載の方法に従って形成される羊膜組織グラフトが示す生物活性化合物のレベルは、組織グラフトの形成に使用される羊膜中に存在する生物活性化合物のレベルと同等である。そのような生物活性化合物として、インターロイキン、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子、表皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管内皮成長因子、処理の前後に存在するトランスフォーミング成長因子などがある。これらの生物活性化合物は、本発明の組織グラフトが外科手術で使用される場合に治癒を促進する。

有利なことに、本発明の羊膜組織グラフトは、縫合の為の強度が十分である。縫合糸は、例えば、サイズが７−０、８−０、更には９−０ ＵＳＰサイズ、又はそれ以下であってよく、これらは、有利なことに、グラフトを引き裂くことはない。

組織グラフトは、第１のフォイルパッケージの内側にパッケージされてよく、第１のフォイルパッケージは、内側及び外側が滅菌されていて、第２のパッケージの滅菌された内側に配置される。

羊膜組織グラフトの使用
羊膜組織グラフトは、例えば、組織再生や創傷治癒を促進する為に使用されてよい。本発明の羊膜グラフトに関する臨床処置又は用途の例として、腱修復、硬膜欠損、腹腔内癒着、腹膜再建、生殖器再建、眼球再建、火傷治療、歯肉組織置換、神経修復、手術部位の治癒促進、一般的な急性又は慢性の創傷のケア等がある。

組織グラフトは、手術部位にすぐに配置されてよく、或いは再水和されてから配置されてよい。再水和が必要な場合は、室温の滅菌生理食塩水又は滅菌乳酸リンゲル液（ＬＲＳ）が再水和に使用されてよい。

本発明の組織グラフトは、乾燥状態であれ、再水和後であれ、手術部位に配置される際には、組織又は器官の上に掛けられて、その組織又は器官の形状に順応する。そうして、組織グラフトは、掛けられた組織又は器官に自己粘着することが可能である。組織グラフトの、組織又は器官への粘着は、組織グラフトをその部位に縫合することによって促進されうる。本発明の組織グラフトの自己粘着特性は、組織グラフトのコーナーに丸みを持たせる設計によって強化されうる。コーナーに丸みを持たせることにより、組織グラフトを体の部位に配置しやすくなる。これは、コーナーがとがっている場合（例えば、直角の場合）より、コーナーに丸みがある場合のほうが標的部位の形状に順応しやすい為である。組織グラフトは、組織又は器官の形状に順応して粘着するが、ユーザ（例えば、外科医）によって姿勢変換されることに対し、壊れたり、ばらばらになったりしない十分な強度を有する。

組織グラフトは、移植された後、その場所に８週間、１０週間、１２週間、１６週間、又はそれ以上とどまる。有利なことに、本発明の組織グラフトの使用は、（例えば、損傷部位における関門機能によって）宿主免疫反応を都合よく改質することにより、瘢痕組織を無くしたり減らしたりすることに役立ちうる。

本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに矛盾する場合を除き、複数形も同様に包含するものとする。更に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」などの語句、又はこれらの変種は、詳細説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りにおいては、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語句と同様に包含的であるものとする。

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句は、特定の値に関して当業者によって決定される許容誤差範囲内であることを意味しており、これは、その値が測定又は特定される方法、即ち、測定システムの限界に、部分的に依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野の慣例に従って、１標準偏差以上の範囲内であることを意味しうる。或いは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値の、最大で０〜２０％、０〜１０％、０〜５％、又は最大で１％の範囲を意味しうる。或いは、特に生物学的なシステム又は処理に関しては、この語句は、ある値の一桁差以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味しうる。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合、特に断らない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」という語句は、その特定の値に関して許容誤差範囲内であることを意味するものと見なされたい。「約（ａｂｏｕｔ）」又は「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語句が使用されている量の成分を含有する組成物の文脈においては、これらの組成物に含有されるその成分のその述べられた量は、その値を中心として０〜１０％のばらつき（誤差範囲）がある（Ｘ±１０％）。

本開示では、範囲の記載を略記で行うことにより、範囲内の全ての値を１つ１つ長々と提示及び説明しなくてもいいようにしている。必要に応じて、範囲内の任意の適切な値が、上限値、下限値、又は範囲の限界値として選択されてよい。例えば、範囲０．１〜１．０は、境界値０．１及び１．０、並びに中間値０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、及び０．１〜１．０に包含される全ての中間範囲（例えば、０．２〜０．５、０．２〜０．８、０．７〜１．０等）を意味する。ある範囲内の、有効桁数が少なくとも２である値が想定され、例えば、範囲５〜１０は、５．０と１０．０の間、並びに５．００と１０．００の間の、境界値を含む全ての値を表す。

本明細書中において言及又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、全ての図面及び表を含む全内容が、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、参照により本明細書に組み込まれている。

以下は、本発明を実施する手順を示す実施例である。これらの実施例は、限定的として解釈されるべきではない。特に断らない限り、全てのパーセント値は重量パーセント値であり、全ての溶剤混合比は体積比である。

実施例１−ヒトの臍帯膜の処理の卓上実施
この実施例は、組織からの物質の抽出、及び組織内での処理残留物の保持の手順を示す。

この実施例で採用された水性処理時間は、物質（例えば、細胞外マトリックスの成長因子又は構成要素）を試験前の組織から抽出する可能性を最大化することを意図された。処理条件を緩くすると、抽出量が減る。

更に、リカバリ後、且つ冷凍前に、臍帯を切開してストロマ面からバルク組織を取り除くことによって調製された組織を使用することにより、創面切除の前のリカバリ処理及び解凍の間に物質を組織から拡散させる為の表面積が最大化される。洗剤洗浄処理と乾燥処理との間のすすぎの繰り返しの時間及び量を減らすと、処理剤が保持される可能性が高まり、それによって、生体適合性に影響するリスクが最大化される。
設備：
１．攪拌機インキュベータ
２．バイオセーフティキャビネット
３．真空乾燥オーブン
４．真空シーラー
５．天秤
６．プッシュゲージ
７．冷蔵庫

創面切除
組織は冷凍状態で取得されており、主要な創面切除は既に実施されていた。この「事前創面切除」により、バルク組織と不定量の血液が取り除かれた。冷凍された組織の解凍は、周囲温度（〜２４℃）で夜通し実施された。解凍時間には１４：３４時間から１７：０３時間という幅があり、平均は１５：２１時間であった。

創面切除では、切開して残留血管を鉗子で全て取り除くことが必要であった。次に、湾曲したアイリスはさみでバルク組織（主にワルトン膠質）が取り除かれた。これは、アドソン鉗子でしっかり掴まれる可能性のある、組織面より上にある組織（例えば、膜自体までは掴まれずに掴まれる可能性がある組織「リッジ」）が全て取り除かれるまで行われた。

臍帯の平均長さは４４．５ｃｍであった（長さは３２ｃｍから６８ｃｍの幅があった）。創面切除によって湿組織膜が形成され、その厚さは約１３００±３００ミクロンであり、５１０ミクロンから１９００ミクロンの幅があった。

未処理の組織膜は創面切除後ただちに集められ、測定が行われた後、それらの膜は、乾燥ステップまで冷蔵庫内の滅菌円錐管で保管された。

処理済み試料も創面切除後ただちに集められ、測定されたが、これらは、乾燥の前に臍帯の他の部分とともに処理された。

処理
以下の表１Ａ及び表１Ｂは、この実施例において実施された処理の継続時間及び設定点を示す。ｎ＝３は、処理が３回実施されたことを示す（当該ステップがいつ個々のドナーを参照をしたかの記載がある場合を除く）。

乾燥
乾燥は、以下に記載のように実施された。

乾燥処置により、組織は、約３０〜４０℃、好ましくは約３３〜３７℃、更により好ましくは約３４〜３６℃、特に約３５℃で乾燥された。乾燥ステップは、中程度の真空で実施される。最終真空圧力（絶対）は、約１０〜２０ｍＢａｒ、好ましくは約１２〜１８ｍＢａｒ、更により好ましくは約１４〜１６ｍＢａｒ、特に約１５ｍＢａｒであってよい。しかしながら、乾燥処理中の任意の時刻における真空圧力は、組織の含水量に関係する。

乾燥時間は１５〜１６時間であった（なお、実際の時間は、圧力及び温度が適合するまで第１のステップが続くにつれて変動する可能性があり、初期条件に基づいて変動する）。例えば、一実施形態では、約１〜１０分以内、又は約２〜５分以内、又は約２〜３分以内に、必要とされる温度及び圧力に到達する。

３つの作成の実施の圧力及び温度のプロファイルを図１に示す。

３つの実施の全てにおいて、チャンバは、実施開始から７３０分まで約１５ｍＢａｒであった。実施開始から約５０分で観察された圧力増加とほぼ同じ時間帯に、チャンバの前面窓の内側に結露が観察された。圧力プロットの３０ｍＢａｒと２５ｍＢａｒとの間に「肩部」が観察されており、これは、主要な乾燥（即ち、他の分子と結合していない水分の除去）の終了を表している可能性がある。チャンバ温度の、設定点に達してからの、実施を通しての設定点からの変動は０．５℃未満であった。

大気中から湿気を吸収する可能性を減らす為に、乾燥袋に入ったままの乾燥アセンブリが、使用時までポリ袋に入れられ、ジップタイで封止された（サイジング及びパッケージングがすぐに開始されなかった場合）。処理済み及び未処理の試料は、乾燥による質量減少の平均が９５％であった（表３）。

外観及び最終サイジング
試料のサイジングは、外科用メスと定規とにより手動で行われた。バイオバーデン試験用とされた試料を有する最初のロットのサイジングは、高圧蒸気滅菌されたまな板を使用して行われた。各実施における後続のロットのサイジングは、ｃｍ目盛グリッドがあらかじめ印刷されている使い捨てのまな板を使用して行われた。この使い捨てまな板は、蒸気滅菌可能ではなかったが、使用前に７０％イソプロピルアルコールで清浄化され、空気乾燥された。

組織の厚さ
測定の有効桁数を考慮すると、創面切除後の湿組織の厚さは１３００±３００ミクロンであり、乾燥組織の厚さは２００±６０ミクロンであった。湿組織の場合の観察された範囲（２４個の試料、６４回の測定）は、５１０〜１９００ミクロンであった。乾燥組織の場合の観察された範囲（２４個の試料、７２回の測定）は、５０〜３００ミクロンであった。

結論
組織の解凍は、周囲温度（〜２４℃）で夜通し、１４〜１８時間実施された。創面切除によって得られた湿膜は、厚さが約１．３ｍｍであり、これが乾燥後には約０．２ｍｍまで薄くなった。観察された、乾燥による重量減少は、全ての試料において約９５％であった。

表６は、試験された水性処理条件と、代替処理の場合の潜在的条件とをまとめたものである。潜在的な代替処理条件は、組織に対する処理条件が全体的に緩くなるように（主に、総接触時間が短くなるように）、且つ、残留処理剤が除去される可能性が高くなるように（ステップ３〜７において時間が長くなるように、攪拌が多くなるように、且つ温度が高くなるように）選択される。

表７は、試験された乾燥処理条件と、代替処理の場合の潜在的条件とをまとめたものである。潜在的な代替処理条件は、観察される乾燥が、少なくとも、このプロトコルで観察されるものと同等にロバストであるように選択される。

最終的な保持ステップとして、窒素パージに代わるソリューションも可能であり、例えば、加熱要素をシャットオフして真空を維持するソリューションが可能である。このプロトコルの下で作られる試料は、特性評価試験用として適切である。

Claims (41)

1. 臍帯から乾燥羊膜組織グラフトを調製する方法であって、
   ａ）内腔を有する臍帯の羊膜に長手方向の切れ目を入れて、前記内腔の内容物を露出させるステップと、
   ｃ）前記内腔の前記内容物のうちの血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成するステップと、
   ｄ）任意選択で、前記創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートするステップと、
   ｅ）前記創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を前記保持液で洗浄するステップと、
   ｆ）前記洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐステップと、
   ｇ）前記すすいだ羊膜を乾燥させるステップと、
   を含む方法。
2. 前記長手方向の切れ目は、前記臍帯の全長に沿って入れられる、請求項１に記載の方法。
3. 前記保持液は、
   ａ）ツイーン２０：０．４〜０．６％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）と、
   ｂ）抗菌性化合物と、
   ｃ）ＮａＣｌ：７〜１０ｇ／Ｌと、
   ｄ）ｐＨが６．５〜７．０の緩衝剤と、
   を含む、
   請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記保持液は、
   ａ）０．５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０と、
   ｂ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポリヘキサメチレンビグアニドヒドロクロリドと、
   ｃ）ＮａＣｌ：９ｇ／Ｌと、
   ｄ）ｐＨが６．７±０．１の適切な緩衝剤と、
   を含む、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記洗浄ステップは、前記創面切除された羊膜を前記保持液中で攪拌するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記洗浄ステップは約３時間にわたって実施され、前記攪拌は、毎分約１００〜２００回転実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記すすぎ液は、
   ａ）ＮａＣｌ：７〜１０ｇ／Ｌと、
   ｂ）無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４：０．５〜１．５ｇ／Ｌと、
   ｃ）ＫＨ_２ＰＯ_４：０．１〜０．２ｇ／Ｌと、
   を含み、
   ｐＨが約７．４である、
   請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記すすぎ液は、約９ｇ／ＬのＮａＣｌと、約０．７９５ｇ／Ｌの無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４と、約０．１４４ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４とを含み、ｐＨが約７．４である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記すすぎステップは、３〜５回、前記すすぎ液中で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 各すすぎステップは、約１００〜２００ＲＰＭで、約１０分にわたって実施される、請求項９に記載の方法。
11. 前記創面切除された羊膜は、前記洗浄ステップまで、約４℃で保管される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記乾燥ステップは、１５〜５０ｍＢａｒの圧力下で、３０〜４０℃の温度で、約１５時間にわたって実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 臍帯から乾燥羊膜を取得する方法であって、
    ａ）部分的に創面切除された羊膜を取得するステップと、
    ｂ）血管及びワルトン膠質を取り除いて、創面切除された羊膜を形成するステップと、
    ｃ）任意選択で、前記創面切除された羊膜を保持液中でインキュベートするステップと、
    ｄ）前記創面切除及びインキュベート（実施された場合）された羊膜を前記保持液中で洗浄するステップと、
    ｅ）前記洗浄された羊膜をすすぎ液で１回以上すすぐステップと、
    ｆ）前記すすいだ羊膜を乾燥させるステップと、
    を含む方法。
14. 前記部分的に創面切除された羊膜は冷凍状態で取得され、前記冷凍された、部分的に創面切除された羊膜を解凍するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記解凍ステップは、２４℃で、約１０〜１５時間にわたって実施される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記保持液は、
    ａ）ツイーン２０：０．４〜０．６％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）と、
    ｂ）抗菌性化合物と、
    ｃ）ＮａＣｌ：７〜１０ｇ／Ｌと、
    ｄ）ｐＨが６．５〜７．０の緩衝剤と、
    を含む、
    請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記保持液は、
    ａ）０．５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０と、
    ｂ）約０．０５％（ｗ／ｖ）のポリヘキサメチレンビグアニドヒドロクロリドと、
    ｃ）ＮａＣｌ：９ｇ／Ｌと、
    ｄ）ｐＨが６．７±０．１の適切な緩衝剤と、
    を含む、
    請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記洗浄ステップは、前記創面切除された羊膜を前記保持液中で攪拌するステップを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記洗浄ステップは約３時間にわたって実施され、前記攪拌は、毎分約１００〜２００回転実施される、請求項１8に記載の方法。
20. 前記すすぎ液は、
    ａ）ＮａＣｌ：７〜１０ｇ／Ｌと、
    ｂ）無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４：０．５〜１．５ｇ／Ｌと、
    ｃ）ＫＨ_２ＰＯ_４：０．１〜０．２ｇ／Ｌと、
    を含み、
    ｐＨが約７．４である、
    請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記すすぎ液は、約９ｇ／ＬのＮａＣｌと、約０．７９５ｇ／Ｌの無水Ｎａ_２ＨＰＯ_４と、約０．１４４ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４とを含み、ｐＨが約７．４である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記すすぎステップは、３〜５回、すすぎ液中で実施される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 各すすぎステップは、約１００〜２００ＲＰＭで、約１０分にわたって実施される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記創面切除された羊膜は、前記洗浄ステップまで、約４℃で保管される、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記乾燥ステップは、１５〜５０ｍＢａｒの圧力下で、３０〜４０℃の温度で、約１５時間にわたって実施される、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法で調製される羊膜組織グラフト。
27. 単膜の臍帯羊膜と、円滑な稼働の為の十分なワルトン膠質と、２０％未満の水分と、１５０〜２５０μｍの厚さと、を含む羊膜組織グラフト。
28. グリセロールを含まない、請求項２７に記載の組織グラフト。
29. 本質的には、単膜の羊膜と、円滑な稼働の為の十分なワルトン膠質と、２０％未満の水分と、１５０〜２５０μｍの厚さと、からなる、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の組織グラフト。
30. ８−０ ＵＳＰの縫合糸で縫合される為の十分な強度を有する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組織グラフト。
31. 厚さの変動が２０％以下である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の組織グラフト。
32. 前記組織グラフトの上皮側と前記組織グラフトのストロマ側とを区別するしるしを含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の組織グラフト。
33. 前記しるしは、前記グラフトの特定の領域からの突出である、請求項３２に記載の組織グラフト。
34. 前記突出は、矩形、正方形、又は三角形のタブである、請求項３３に記載の組織グラフト。
35. 前記突出は、鉗子で掴まれることに適するように設計されている、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の組織グラフト。
36. 前記組織グラフトの形成に使用される前記羊膜中に存在する生物活性化合物と同等レベルの生物活性化合物を含む、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の組織グラフト。
37. 前記生物活性化合物として、インターロイキン、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子、表皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管内皮成長因子、トランスフォーミング成長因子などがある、請求項３６に記載の組織グラフト。
38. 前記組織グラフトは、組織又は器官の上に配置されると、前記組織又は器官の形状に順応して粘着する、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の組織グラフト。
39. 前記組織グラフトは、前記組織又は器官の形状に順応して粘着した後に、ユーザによって姿勢変換された場合に、壊れたり、ばらばらになったりせずに姿勢を変える、請求項３８に記載の組織グラフト。
40. 前記組織グラフトは、前記組織又は前記器官の上に配置された後、その場所に少なくとも８週間、１０週間、１２週間、１６週間、又はそれ以上とどまる、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載の組織グラフト。
41. 前記組織グラフトは、前記組織又は前記器官の上に配置された後、その場所に少なくとも１６週間とどまる、請求項４０に記載の組織グラフト。

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