CN102670576A - 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用 - Google Patents

树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102670576A
CN102670576A CN2012101196655A CN201210119665A CN102670576A CN 102670576 A CN102670576 A CN 102670576A CN 2012101196655 A CN2012101196655 A CN 2012101196655A CN 201210119665 A CN201210119665 A CN 201210119665A CN 102670576 A CN102670576 A CN 102670576A
Authority
CN
China
Prior art keywords
keto acid
tree bean
diabetes
bean
rat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012101196655A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102670576B (zh
Inventor
沈小玲
王璐
胡英杰
邱声祥
符林春
麦兆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU YUNZHONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU YUNZHONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU YUNZHONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical GUANGZHOU YUNZHONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201210119665.5A priority Critical patent/CN102670576B/zh
Priority to PCT/CN2012/075068 priority patent/WO2013155739A1/zh
Publication of CN102670576A publication Critical patent/CN102670576A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102670576B publication Critical patent/CN102670576B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Abstract

本发明公开了树豆酮酸A及其药用衍生物在制备糖尿病伴随症或高脂血症药物中的应用。动物实验数据表明，树豆酮酸A在降血糖的同时，可以显著降低2型糖尿病SD大鼠的血清甘油三酯水平、总胆固醇水平和低密度脂蛋白胆固醇水平，表明树豆酮酸A可以治疗或改善糖尿病伴高脂血症；病理学研究结果证实，树豆酮酸A可减少肝细胞的点状坏死，可以治疗或改善糖尿病伴肝脏损伤，逆转糖对大鼠胰岛组织的损伤，并对胰腺具有保护和修复作用。树豆酮酸A可以显著降低先天肥胖Zucker大鼠的血清甘油三酯水平、总胆固醇水平，表明树豆酮酸A可以治疗或改善高脂血症。

Description

树豆酮酸A在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用
技术领域
本发明涉及化合物的新用途，具体涉及树豆酮酸A及其药用衍生物，特别是树豆酮酸A及其药用盐或酯在制备糖尿病伴随症或高脂血症药物中的应用。 
背景技术
高脂血症是由于脂肪代谢紊乱引起的血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)单项或多项水平高于正常标准。高脂血症的主要危害是导致动脉粥样硬化。动脉血管堵塞使全身重要器官长期供血供氧不足，造成脏器器质性的和功能性的损伤，从而导致众多的相关疾病。其中最为常见的一种致命性疾病就是冠心病。高血脂是促进高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素，还会导致脂肪肝，肝硬化，胰腺炎，胆石症，高尿酸血症，肾功能衰竭等。高脂血症可分为原发性和继发性两类。其中原发性高血脂症主要是由于遗传或者饮食不当等原因造成。而继发性高血脂症则是由其他中间原发疾病如糖尿病、肥胖症、甲状腺疾病、肾脏疾病、肝病、胰腺疾病等引起。肥胖伴高脂血症者更容易出现胰岛素抵抗进而诱发糖尿病。 
糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引起的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱为主的内分泌疾病，其中2型糖尿病占整个糖尿病比例的93.7％，并且中国是全球2型糖尿病患病率增长较快的国家之一。由于长期慢性高血糖诱发脂肪和蛋白代谢紊乱，继而引起一系列的眼、肾、神经、心血管等并发症，对人类健康、寿命和生活质量构成了严重威胁，同时也是糖尿病患者致残和早亡的主要原因。很多糖尿病人都伴有高脂血症，因此人们通常把糖尿病与高脂血症称为姐妹病，并认为高血脂是糖尿病的继发症。高血脂诱发胰岛素抵抗进而诱发糖尿病，而糖尿病引起脂代谢紊乱进而引致高血脂，所以高血脂症和高血糖症之间之间是相互促进的关系。 
胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病因和显著特征，从理论上分析，糖尿病病人针对胰岛素抵抗的治疗将大大减少其他降糖药物的用量，减轻胰腺胰岛细胞分泌胰岛素的压力，延缓2型糖尿病向1型转化的进程，使糖尿病病人减少并发症的发生，降低死亡率。目前针对胰岛素抵抗的常用治疗药物为胰岛素增敏剂，噻唑烷二酮类(TZDs)是一类比较得到公认的胰岛素增敏剂。其代表药物有曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮。但是，这类药物通过激活过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)活性增强胰岛素敏感性的同时，还可增加脂肪细胞的增殖，从而导致水钠潴留，体重增加甚至肥胖等。TZDs还可致贫血、血红蛋白和红细胞减少， 对心功能不全者宜慎重应用。作为第一个噻唑烷二酮类药物，曲格列酮经过140万例人次研究，暴露有肝脏毒性的缺点，于上市后三年被美国FDA禁止临床使用。2010年9月以来，应用广泛的马来酸罗格列酮由于可能导致心脏出现问题而相继被欧盟药品管理局、美国食品药品管理局和中国国家食品药品监督管理局建议暂停使用，仅用于那些其他药品不能控制血糖的2型糖尿病患者，大大限制了这类药物的使用。因此，虽然有罗格列酮缓解糖尿病人高血脂症状的报道，但作为治疗慢性代谢疾病的药物，需要终身服用，其安全性是首要条件。因此PPARγ激活剂类型的胰岛素增敏剂并不适合糖尿病人长期服用，更不适合用于治疗高脂血症，或者糖尿病伴随的其他疾病如肝损伤，胰腺损伤或者肾损伤等。 
树豆酮酸A是本发明人发现的一种新化合物(CN101422450A)，并通过ob/ob型先天性肥胖高血糖小鼠证明其具有降糖减肥的功效。树豆酮酸A的药用衍生物，特别其药用酯或盐，可以按常规方法制备得到。这些衍生物在体内可以重新解离出树豆酮酸A，具有与树豆酮酸A类似的生物活性。在之前的申请文件中，并未涉及治疗糖尿病伴随症或高脂血症用途的研究。 
发明内容
本发明的目的在于提供树豆酮酸A及其药用衍生物在制备治疗糖尿病伴随症药物中的应用。 
特别的，树豆酮酸A药用衍生物为树豆酮酸A的药用盐或药用酯；其药用盐优选为树豆酮酸A的钠盐、钾盐、钙盐；其酯优选为树豆酮酸A的甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯、叔丁基酯。这些药用盐和酯在体内可以转化或水解成树豆酮酸A，产生与树豆酮酸A相一致的疗效。 
糖尿病伴随症为糖尿病伴高脂血症、糖尿病伴肝脏损伤、糖尿病伴肾脏损伤或糖尿病伴胰腺损伤。 
2型糖尿病SD大鼠模型动物的特点是糖尿病和高脂血症。动物实验数据表明，树豆酮酸A在降低2型糖尿病SD大鼠血糖的同时，显著降低了动物的血清甘油三酯水平、总胆固醇水平和低密度脂蛋白胆固醇水平，表明树豆酮酸A可以治疗或改善糖尿病伴高脂血症。 
2型糖尿病SD大鼠给予树豆酮酸A进行试验治疗，结果表明，与模型组相比，治疗组动物的肝体比、AST、ALT均有显著下降，病理学研究结果证实，树豆酮酸A可减少肝细胞的点状坏死，其预防肝肿大和保护肝脏的作用优于罗格列酮。实验数据表明树豆酮酸A可以治疗或改善糖尿病伴肝脏损伤。 
给予树豆酮酸A后，糖尿病SD大鼠与模型组相比，胰岛素敏感指数、胰岛β细胞功能指数显著升高，胰岛素抵抗指数显著下降。病理学研究结果证实，树豆酮酸A可逆转糖对大鼠胰岛组织的损伤，并对胰脏具有保护和修复作用。 
先天性肥胖Zucker大鼠模型动物的特点是血糖值基本正常，但出生后其血清甘油三酯水平、总胆固醇水平异常偏高，形成典型的高脂血症。动物实验数据表明，树豆酮酸A能够显著降低先天性肥胖Zucker大鼠的血清甘油三酯水平、总胆固醇水平，表明树豆酮酸A具有治疗或改善高脂血症的作用。 
附图说明
图1.不同治疗组大鼠胰脏组织HE染色病理切片图（×100），图中，（A）正常对照组，（B）2型糖尿病模型组，（C）树豆酮酸A治疗组，（D）文迪雅治疗组； 
图2.不同治疗组大鼠肝脏组织HE染色病理切片图（×100），图中，（A）正常对照组，（B）2型糖尿病模型组，（C）树豆酮酸A治疗组，（D）文迪雅治疗组；
图3.不同治疗组大鼠肾脏组织HE染色病理切片图，图中，（A）正常对照组，（B）2型糖尿病模型组，（C）树豆酮酸A治疗组，（D）文迪雅治疗组；
图4.药物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响图(×100)（油红染色法）；
图5.树豆酮酸A对脂肪细胞PPARγ和C/EBP αmRNA水平的影响图；
图6.药物对脂肪细胞GLUT4表达的影响。
具体实施方式
下面结合实验及实验数据，进一步说明本发明。 
树豆酮酸A在SD大鼠2型糖尿病动物模型上的药效学实验结果动物分组及给药：选取高糖高脂膳食伴腹腔注射小剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病SD雄性大鼠，根据空腹血糖和体重均匀分为模型组、治疗组以及阳性对照组。每组8只。另有8只正常大鼠作随行观察。 
(1)模型组：等体积混合的吐温-80和二甲基亚砜用蒸馏水十倍稀释，以每100g体重1mL进行腹腔注射，每日一次，直到实验结束。 
(2)治疗组：树豆酮酸A用等体积混合的吐温80和二甲基亚砜溶解，配成10mg/mL的储备液。临用时将储备液用蒸馏水十倍稀释，以每100g体重1mL进行腹腔注射，每日一次，直到实验结束，剂量为10mg/kg/d。 
(3)阳性药组：马来酸罗格列酮片(商品名文迪雅，葛兰素史克公司)加水崩解后制成0.4mg/mL的悬液，以每100g体重1mL灌胃，每日一次，直到实验结束，剂量为4mg/kg/d。 
测定方法： 
(1)空腹血糖测定：给药期间每隔7天大鼠尾静脉取血，用罗康全活力型血糖仪(罗氏)测定空腹8h血糖值；
(2)葡萄糖耐受量测定：末次给药后次日大鼠禁食4h，测定空腹4h血糖值(0时)后，立即按2g/kg灌服葡萄糖溶液，并测定灌服葡萄糖后30min、60min、120min血糖值，即大鼠葡萄糖耐受量OGTT；
(3)血清生化分析：末次给药后日大鼠禁食16h后，腹主动脉采血，离心分离得血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高/低密度脂蛋白(H/LDL-C)，肝脏谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT、尿素、肌酐水平。大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定血清胰岛素水平，并计算胰岛素敏感指数ISI[＝1/(空腹血糖×胰岛素)]，稳态胰岛抵抗指数HOMA-IR＝(FBG×FINS/22.5)、稳态胰岛β细胞功能指数HBCI [＝22.5×胰岛素/(空腹血糖-3.5)]。
(4)脏器组织及病理切片：处死大鼠，剖取肝脏称重，计算脏器系数RLB(＝肝重/体重)，同时取胰、肾脏。经HE染色显微镜下进行观察病理切片并拍照。 
实验结果： 
(1)树豆酮酸A显著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖水平：表1显示，正常大鼠在实验期间的FBG水平保持在7.5mM以下，而模型组大鼠的FBG则从实验开始时的22.5±4.5mM上升到实验结束时的26.8±4.7mM。说明建立的糖尿病模型稳定可靠。T2DM大鼠经连续四周的树豆酮酸A或文迪雅治疗后，其FBG水平分别为18.7±8.0mM和20.1±7.9mM，和模型组FBG比较有显著性差异(P＜0.05)。说明树豆酮酸A同文迪雅一样，可降低T2DM大鼠的FBG水平。
表1 树豆酮酸A对2型糖尿病大鼠的FBG水平的影响 
与正常动物组相比，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05。
(2)树豆酮酸A可改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖耐受性：由表2可知，治疗结束时，治疗组空腹4h血糖值明显低于模型组(P＜0.05)。在灌服葡萄糖溶液30min时各组血糖均达 最高值，且模型组大鼠空腹血糖值最高，随后各组血糖逐渐下降。两治疗组分别在60min、120min两个时间点血糖显著低于模型组(P＜0.05)，提示树豆酮酸A可有效改善糖尿病大鼠葡萄糖耐受量。 
表2 树豆酮酸A对T2DM大鼠的糖耐受性的影响(平均值±标准差) 
Figure BDA0000155679600000051
数据与模型组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
(3)树豆酮酸A可修复2型糖尿病大鼠的胰岛损伤，改善胰岛素抵抗状态：由表3可知，模型组大鼠和正常大鼠的血清胰岛素水平(INS)无明显差异，但ISI和HOMA-IR较正常组明显增大而HBCI明显降低，模型组大鼠显示出典型的胰岛素抵抗状态。经树豆酮酸A治疗的大鼠，INS较模型组无明显变化，但ISI、HBCI和模型组比较都显著升高(P＜0.05)，而HOMA-IR则显著降低(P＜0.05)，提示树豆酮酸A治疗糖尿病大鼠后，大鼠的胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能都有显著改善，胰岛素抵抗减少。 
表3 树豆酮酸A对大鼠胰岛素敏感性的影响(平均值±标准差) 
Figure BDA0000155679600000052
数据与正常对照组比较，***P＜0.001；数据与模型组比较，#P＜0.05。
不同治疗组大鼠的胰组织HE染色病理切片结果如图1显示。图中，(A)正常对照组，(B)2型糖尿病模型组，(C)树豆酮酸A治疗组，(D)文迪雅治疗组。 
和正常大鼠比较，模型组大鼠胰腺腺泡萎缩，腺泡缩小，间质增宽；胰腺间质呈泡间和小叶周围纤维化及脂肪变性；胰腺的脂肪浸润，脂肪分布呈灶性，脂肪多见于胰腺小叶的分隔中；胰小岛炎也较正常组严重。给药组胰岛腺泡发育良好，间质纤维和脂肪变性少见，其中树豆酮酸A对大鼠胰岛的修复更为明显，基本达到正常大鼠的胰岛形态，提示树豆酮酸A对可逆转糖尿病对胰岛组织造成的损伤。 
(4)树豆酮酸A可显著降低2型糖尿病大鼠的血脂水平：表4显示，T2DM模型大鼠的TG、TC、LDL-C水平都显著高于正常大鼠，表现出明显的高脂血症。经10mg/kg/d的树豆酮酸A连续四周治疗后，大鼠血清中TG、TC和LDL-C水平较模型组都有显著下降，而且效果稍强于4mg/kg/d的文迪雅。说明树豆酮酸A对高血脂症的T2DM大鼠具有调节血脂、改善高血脂症的作用。 
表4 树豆酮酸A对T2DM大鼠血脂水平的影响(平均值±标准差) 
Figure BDA0000155679600000061
与正常动物组相比，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
(5)树豆酮酸A可改善2型糖尿病大鼠的肝损伤，修复肝功能：由表5可知，2型糖尿病大鼠的AST和ALT较正常大鼠显著升高，肝体比显著增大，表现出明显的肝肿大和肝损伤。经树豆酮酸A治疗4周后的大鼠，其肝体比、AST及ALT水平较模型组均有显著下降(P＜0.05或P＜0.01)，其中AST和ALT水平已经达到正常大鼠的水平。经文迪雅治疗的大鼠ALT明显下降(P＜0.05)，肝体比和AST虽有下降，但与模型组大鼠比较不具有显著性差异(P＞0.05)。 
表5 树豆酮酸A对糖尿病大鼠肝损伤及肝功能的影响(Mean±SD) 
Figure BDA0000155679600000062
数据与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
肝脏组织HE染色病理切片结果如图2显示。图中，(A)正常对照组，(B)2型糖尿病模型组，(C)树豆酮酸A治疗组，(D)文迪雅治疗组。 
由图2可见，正常组大鼠肝组织结构完整、清晰、肝小叶结构正常，未见肝细胞点状坏死及脂肪变性等异常改变。模型组及各给药组均有不同程度的肝细胞点状坏死。以模型组 最重，表现为多数动物肝脏出现较为严重的肝细胞点状坏死。两给药组与模型比较，肝细胞点状坏死的程度有所好转，其中树豆酮酸A组肝细胞点状坏死的程度有明显好转，提示树豆酮酸A具有保护肝脏，预防肝肿大及恢复肝功能方面的作用，且作用该更优于文迪雅。 
(6)树豆酮酸A对2型糖尿病大鼠的肾脏损伤具有修复作用：如表6所示，糖尿病模型组大鼠的肾尿素和肌酐水平较正常大鼠均有显著增加(P＜0.001)，模型大鼠表现出一定程度的肾功能损伤。测得树豆酮酸A治疗组的尿素和肌酐水平略小于模型组，文迪雅的尿素水平略高于模型组，但和模型组比较均无显著性差异。 
表6 树豆酮酸A对大鼠肾功能指数的影响(平均值±标准差) 
Figure BDA0000155679600000071
与正常对照比，**P＜0.01。
但是肾脏HE染色病理切片结果(图3)却表明树豆酮酸A对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用。图中，(A)正常对照组，(B)2型糖尿病模型组，(C)树豆酮酸A治疗组，(D)文迪雅治疗组。 
由图3可见，和正常大鼠比较，模型组大鼠萎缩肾小管管腔扩张，基膜弥漫性增厚，近端小管上皮细胞出现糖原空泡；而树豆酮酸A组大鼠肾脏形态正常，未见糖原沉积；文迪雅组糖原沉积的程度小于模型组大鼠。提示树豆酮酸A保护肾脏的作用优于罗格列酮。 
树豆酮酸A在先天肥胖Zucker大鼠模型上的药效学实验结果动物分组及给药：选取8周龄的健康SPF级Zucker fa/fa大鼠，根据空腹血糖和体重均匀分为模型组(n＝7)、树豆酮酸A高中低剂量治疗组(n＝7)、文迪雅治疗组(n＝6)。另有8只同龄雄性Zucker瘦鼠做为随行观察。 
(1)模型组：等体积混合的吐温80和二甲基亚砜用蒸馏水十倍稀释，以每10g体重100μL进行腹腔注射，每日一次，直到实验结束。 
(2)治疗组：树豆酮酸A用等体积混合的吐温80和二甲基亚砜溶解，分别配成20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL的储备液。临用时将各储备液用蒸馏水十倍稀释，以每100g体重1mL进行腹腔注射，每日一次，直到实验结束，剂量分别为20、10、5mg/kg/d。 
(3)文迪雅治疗组：文迪雅加水崩解后制成0.4mg/mL的悬液，以每100g体重1ml灌胃，每日一次，直到实验结束，剂量为4mg/kg/d。 
测定方法：给药开始时和给药结束次日大鼠禁食16h，眼眶静脉丛采血，离心分离得血清。采用甘油三酯、胆固醇检测试剂盒(长春汇力生物公司)测定血清中甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)水平。 
实验结果： 
树豆酮酸A显著降低Zucker fa/fa大鼠的TG和TC水平：如表7所示，Zucker fa/fa大鼠在实验开始时血清中TG和TC水平分别为2.23±0.07mmol/L和3.37±0.09mmol/L，明显高于Zucker瘦鼠的0.63±0.07mmol/L(P＜0.001)和0.51±0.02mmol/L(P＜0.01)，已表现为高血脂症状。实验结束时，Zucker瘦鼠的血清TC和TG值保持稳定，而Zucker fa/fa模型组大鼠的血清TG和TC值已经稳步上升到了5.03±0.02mmol/L和4.35±0.06mmol/L，高血脂症状更加严重。经树豆酮酸A或文迪雅治疗的Zucker fa/fa大鼠，其血清TG和TC水平较同龄的模型鼠要低得多，尤其是血清TC水平较治疗前还有所下降。树豆酮酸A不仅显著抑制Zkcher fa/fa大鼠血清TG水平的上升趋势，还能有效降低大鼠的血清TC水平，同时并不加剧大鼠的肥胖。而文迪雅治疗组在调节血脂的同时粗肥胖作用也很明显：治疗结束时大鼠体重达453±22g，明显高于模型组的396±37g(P＜0.01)。再此树豆酮酸A作为血脂调节剂表现出优于文迪雅的应用前景。
表7.树豆酮酸A对Zucker fa/fa大鼠血脂的影响 
Figure BDA0000155679600000081
数据与Zucker瘦鼠相比，**P＜0.001，***P＜0.001；与模型组相比，##P＜0.01，###P＜0.001。
树豆酮酸A对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响 
细胞株：小鼠前脂肪细胞3T3-L1。采用含10％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基常规培养，当细胞融合达80％左右时需传代。
药物配制： 
树豆酮酸A：DMSO溶解成20mM的储备液，临用时以培养基稀释到工作浓度；
马来酸罗格列酮：纯度＞98％，购自广州市药检所。DMSO溶解成20mM储备液，临用时以培养基稀释到工作浓度；
洛伐他汀：纯度≥99％，购自广州市药检所。精密称取4mg，溶解150μL乙醇，加入0.1MNaOH 225μL，50℃水浴2h，HCl调pH值至7.5，最后加入蒸馏水至终体积1mL，配制成10mM储备液备用。临用时以培养基稀释为工作浓度。
增殖抑制试验：收集对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞用培养基配成5×104个/mL的单细胞悬液，以每孔100μL接种于96孔培养板，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞培养箱中培养24小时使细胞贴壁。吸去培养基，加入含有不同浓度的树豆酮酸A的新鲜培养基，在细胞培养箱中作用48小时。每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h。弃去上清，每孔加入150μL DMSO，待沉淀完成溶解混匀后，用酶标仪在492nm波长下测定吸光度，求得不同浓度药物对细胞生长的抑制率和半数抑制浓度。实验中每个浓度设置三个复孔，并设立溶剂空白对照。马来酸罗格列酮和洛伐他丁作为对照药物。实验结果为三次重复实验的平均值。 
实验结果：见表8。树豆酮酸A作用48小时对3T3-L1前脂肪细胞的增殖具有一定的抑制作用，半数抑制浓度IC50＝301μM。其抑制效果和马来酸罗格列酮相当，后者IC50＝362μM。洛伐他丁的细胞毒性相对要强于树豆酮酸A和马来酸罗格列酮，IC50＝37.5μM。 
表8.树豆酮酸A对3T3-L1前脂肪细胞的增殖抑制作用 
Figure BDA0000155679600000091
树豆酮酸A对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响 
细胞株和药物：同树豆酮酸A对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。
成脂分化诱导实验：将3T3-L1细胞悬液接种于96孔板，待其生长融合汇片后2天，用含有10μg/mL胰岛素、1μM地塞米松和0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的新鲜培养基进行分化诱导48小时，再用含有10μg/mL胰岛素的新鲜培养基继续诱导48小时，最后用不含诱导剂的新鲜培养基继续于细胞培养箱继续培养4天，期间2天须更换一次新鲜培养基。整个分化过程持续8天。为了测试树豆酮酸A对成脂分化的影响，不同浓度的树豆酮酸A从分化诱导的第一天开始即随同分化试剂一起加入到培养基。马来酸罗格列酮和洛伐他丁作为对照药物。 
数据测定：将结束分化的细胞先用10％的福尔马林于室温固定20分钟，PBS洗涤两次后再用5mg/mL的油红异丙醇液染色30分钟。蒸馏水洗去多余的油红，晾干培养板。先于一百倍显微镜下观察脂肪细胞被油红染色的情况并拍照，后每孔加入150μL异丙醇溶解细胞内油红，于540nm波长处测定油红的吸收值(油红吸收值和生成脂肪的数量成正比)。根据吸收值计算不同浓度的药物对脂肪生成率的影响，分析药物对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响。试验中，每个样品浓度设置三个复孔。每个实验重复三次。 
实验结果：树豆酮酸A抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。图4表明，未分化的3T3-L1前脂肪细胞基本未被油红染色，说明无脂肪生成。添加分化诱导剂进行正常分化的细胞内则可见大量红色油状点，说明细胞内存在大量油滴，3T3-L1前脂肪细胞已经完成了向脂肪细胞的转化。当树豆酮酸A与分化诱导剂共同作用于分化的细胞时，可见随着树豆酮酸A浓度的增加，被油红染色的细胞越少，说明树豆酮酸A剂量依赖地抑制了脂肪的形成。洛伐他丁和马来酸罗格列酮组则分别表现出了预期的抑制和促进脂肪形成的作用。量化的数据如表9所示：和正常分化组(模型)油红吸收值比较发现，50μM、75μM、100μM和150μM的树豆酮酸A作用组油红吸收值也就是生成脂肪数量较正常分化组分别减少了24.6％、39.1％、57.6％和74.2％。而马来酸罗格列酮在25μM时使脂肪生成率高出了正常分化组41％。本实验的结果表明，树豆酮酸A可有效抑制前脂肪细胞向脂肪细胞分化，减少脂质的堆积，在调节血脂的时候可避免马来酸罗格列酮促体重增加的副作用。 
表9 药物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响(平均值±标准偏差) 
Figure BDA0000155679600000111
数据与正常分化组相比，**P＜0.001，***P＜0.001。
树豆酮酸A对3T3-L1细胞中PPARγ和C/EBP α表达的影响 
PPARγ和C/EBPα是脂肪生成中两个非常重要的调节子，在脂肪生成过程中被激活。上一实验已证实树豆酮酸A显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化，因此本实验采用实时定量PCR技术探讨了树豆酮酸A对处于成脂分化过程的3T3-L1细胞中这两个调节子表达的影响。
细胞株和药物作用：同树豆酮酸A对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。 
实时定量PCR：处于成脂分化诱导第5天的3T3-L1细胞的总RNA采用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取；第一链cDNA则采用cDNA synthesis kit(TOYOBO，日本)合成；实时定量PCR实验使用了基因特异性引物(Maygene表1，广州)和实时定量PCR扩增的预混和溶液(THUNFRTBIRD SYBR qPCR Mix，TOYOBO，日本)。所有试剂盒的使用都遵照厂家的说明书要求进行操作。基因表达水平采用ABI 7300RT-PCR系统进行分析。实验重复三次，以β-actin作为内标。 
实验结果：如图5所示，树豆酮酸A呈剂量依赖性地抑制PPARγ和C/EBPαmRNA水平的表达。提示树豆酮酸A不仅是作为PPARγ活性的特异性抑制剂被公开于前一专利ZL200810199012.6，同时也是PPARγ表达的抑制剂，该结果为树豆酮酸A的体内、体外减脂作用提供了进一步的机制说明。 
树豆酮酸A对胰岛素抵抗型脂肪细胞葡萄糖代谢的影响及其机理研究结果 
如前所述，树豆酮酸A在2型糖尿病鼠模型上具有降血糖、增加胰岛素敏感性的作用。糖尿病的原因是由于动物胰岛素抵抗，导致细胞对葡萄糖的摄取下降从而使血糖中葡萄糖含量过高所致。罗格列酮作为胰岛素增敏剂的机制是：激活PPARγ，刺激对胰岛素更为敏感的小脂肪细胞增生，并刺激葡萄糖转运蛋白GLUT4在脂肪细胞内的表达。为了进一步探讨树豆酮酸A有别于罗格列酮的胰岛素增敏机制，本实验利用胰岛素抵抗的脂肪细胞，探讨了树豆酮酸A对细胞葡萄糖摄入的影响，以及对细胞内葡萄糖转运蛋白GLUT4表达的影响。
实验方法：首先3T3-L1前脂肪细胞如实施例4所述进行8天的分化诱导，使其转化成为成熟的脂肪细胞，该细胞对胰岛素敏感。为了诱导其产生胰岛素抵抗，在其培养基中加入了1μM的地塞米松。将胰岛素敏感细胞的培养基更换为新鲜的高糖DMEM，胰岛素抵抗细胞的培养基更换为含1μM地塞米松新鲜高糖DMEM，分别加入25μM的树豆酮酸A或10μM马来酸罗格列酮，并以不加药的细胞为空白对照，于24h、48h时用GOD-POD葡萄检测试剂盒测定培养基上清液中的葡萄糖含量，分析药物对3T3-L1正常脂肪细胞和胰岛抵抗脂肪细胞葡萄糖代谢的影响。3T3-L1脂肪细胞经地塞米松和药物作用第5天时Western Blot法检测正常敏感细胞、胰岛抵抗细胞及给药的胰岛素抵抗细胞中GLUT4蛋白的表达。 
实验结果： 
(1)树豆酮酸A增加了胰岛素抵抗的脂肪细胞对葡萄糖的消耗：测得不同药物处理的细胞经过24h或48h培养后，培养基中剩余葡萄糖的浓度见表10。可以看出，胰岛素可显著增加敏感细胞的糖消耗，但树豆酮酸A和马来酸罗格列酮都不影响胰岛素敏感的脂肪细胞的糖消耗，两组细胞的培养基中葡萄糖剩余浓度和对照组比较无明显差异(P＞0.05)。和敏感细胞相比较，地塞米松处理过的脂肪细胞培养基中葡萄糖含量明显较高(P＜0.05)，说明其葡糖糖消耗减少，胰岛素抵抗状态明显。但是当树豆酮酸A或马来酸罗格列酮作用于该细胞时，培养基中葡萄糖含量都大为减少(P＜0.001)，说明二者都能改善细胞的胰岛素抵抗状态。其中，25μM的树豆酮酸A使抗性细胞的葡萄糖摄取恢复到了敏感细胞的水平，而马来酸罗格列酮则是葡萄糖的摄取超过了敏感细胞的水平。且两者逆转地塞米松致胰岛素抵抗的作用更优于10-8M的胰岛素。本实验说明树豆酮酸A具有逆转脂肪细胞胰岛素抵抗，增加糖代谢的作用。 
表10 3T3-L1胰岛抵抗/敏感脂肪细胞培养基中葡萄糖含量(平均值±标准差) 
Figure BDA0000155679600000131
数据与胰岛素敏感细胞对照相比，***P＜0.001；与胰岛素抵抗细胞对照相比，###P＜0.001。
(2)树豆酮酸A不影响胰岛素抵抗的脂肪细胞内GLUT4水平。蛋白印迹试验结果如图6显示，模型组胰岛素抵抗细胞的GLUT4蛋白表达水平与胰岛素素敏感细胞正常对照组比较明显降低，树豆酮酸A组GLUT4蛋白的表达与模型组相比无显著性差异，而罗格列酮组GLUT4蛋白的表达与模型组相比显著升高，恢复到正常细胞的表达水平。树豆酮酸A降糖作用不是通过增加葡萄糖转运子GLUT4起效的。 

Claims (8)

1.树豆酮酸A及其药用衍生物在制备治疗糖尿病伴随症药物中的应用。
2.树豆酮酸A及其药用衍生物在制备有益于糖尿病伴随症患者食用的功能性保健品中应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：糖尿病伴随症为糖尿病伴高脂血症、糖尿病伴肝脏损伤、糖尿病伴肾脏损伤或糖尿病伴胰脏损伤。
4.树豆酮酸A及其药用衍生物在制备治疗高脂血症药物中的应用。
5.树豆酮酸A及其药用衍生物在制备有益于高脂血症患者食用的功能性保健品中应用。
6.根据权利要求1、2、4或5所述的应用，其特征在于：树豆酮酸A药用衍生物为树豆酮酸A的药用盐或药用酯。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：树豆酮酸A药用盐为树豆酮酸A的钠盐、钾盐、钙盐。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：树豆酮酸A药用酯为为树豆酮酸A的甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯、叔丁基酯。
CN201210119665.5A 2012-04-20 2012-04-20 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用 Active CN102670576B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210119665.5A CN102670576B (zh) 2012-04-20 2012-04-20 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用
PCT/CN2012/075068 WO2013155739A1 (zh) 2012-04-20 2012-05-04 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210119665.5A CN102670576B (zh) 2012-04-20 2012-04-20 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102670576A true CN102670576A (zh) 2012-09-19
CN102670576B CN102670576B (zh) 2014-04-02

Family

ID=46803570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210119665.5A Active CN102670576B (zh) 2012-04-20 2012-04-20 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN102670576B (zh)
WO (1) WO2013155739A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103772189A (zh) * 2014-01-23 2014-05-07 苏州美诺医药科技有限公司 一种菧类化合物甲基树豆酮酸a的合成方法
CN106309419A (zh) * 2015-06-19 2017-01-11 广州允中生物科技有限公司 树豆酮酸a及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物或保健食品中的应用
CN106397207A (zh) * 2016-05-13 2017-02-15 贵州医科大学 树豆酮酸a结构类似物、其组合物及其在药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101422450A (zh) * 2008-10-09 2009-05-06 广州市允中投资发展有限公司 一种具有降血糖和减肥作用的菧类天然药物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101204418B (zh) * 2006-12-22 2011-06-15 中国医学科学院基础医学研究所 木豆叶芪类提取物在制备治疗高脂血症药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101422450A (zh) * 2008-10-09 2009-05-06 广州市允中投资发展有限公司 一种具有降血糖和减肥作用的菧类天然药物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张敬芳等: "胰岛素信号转导调节分子PTP1B及其抑制剂研究的进展", 《中国糖尿病杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103772189A (zh) * 2014-01-23 2014-05-07 苏州美诺医药科技有限公司 一种菧类化合物甲基树豆酮酸a的合成方法
CN103772189B (zh) * 2014-01-23 2015-05-27 苏州美诺医药科技有限公司 一种菧类化合物甲基树豆酮酸a的合成方法
CN106309419A (zh) * 2015-06-19 2017-01-11 广州允中生物科技有限公司 树豆酮酸a及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物或保健食品中的应用
CN106309419B (zh) * 2015-06-19 2019-09-10 广州允中生物科技有限公司 树豆酮酸a及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用
CN106397207A (zh) * 2016-05-13 2017-02-15 贵州医科大学 树豆酮酸a结构类似物、其组合物及其在药物中的应用
CN106397207B (zh) * 2016-05-13 2020-12-08 贵州医科大学 树豆酮酸a结构类似物、其组合物及其在药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102670576B (zh) 2014-04-02
WO2013155739A1 (zh) 2013-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Constituents from Terminalia species increase PPARα and PPARγ levels and stimulate glucose uptake without enhancing adipocyte differentiation
Kwon et al. The lignan-rich fractions of Fructus Schisandrae improve insulin sensitivity via the PPAR-γ pathways in in vitro and in vivo studies
Alonso-Castro et al. The antidiabetic plants Tecoma stans (L.) Juss. ex Kunth (Bignoniaceae) and Teucrium cubense Jacq (Lamiaceae) induce the incorporation of glucose in insulin-sensitive and insulin-resistant murine and human adipocytes
CN101450963B (zh) 葫芦烷型三萜皂苷化合物、其药物组合物及其制备方法和用途
Arha et al. Deoxyandrographolide promotes glucose uptake through glucose transporter-4 translocation to plasma membrane in L6 myotubes and exerts antihyperglycemic effect in vivo
CN105560390A (zh) 一种紫堇提取物、包含其的药物组合物及其用途
CN102670576B (zh) 树豆酮酸a在制备糖尿病伴随症及高脂血症药物中的应用
CN109939120A (zh) 含烟酰胺单核苷酸和罗汉果苷的组合物及其应用
CN103585632A (zh) 胆汁酸螯合剂或/和维生素d在制备防治非酒精性脂肪性肝病药物中的应用
CN102702303A (zh) 丹参酮衍生物，其药物组合物及其在制药中的应用
CN104523742A (zh) 一种具有护肝和提高免疫作用的多糖组合物及其应用
Nadwa et al. Comparing the Effects of Febuxostat and Allopurinol in an Animal Model of Metabolic Syndrome
TWI761032B (zh) 蒲公英萃取物用於製備促進脂肪代謝的組合物之用途
CN102784237A (zh) 一种预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物
CN107854692A (zh) 一种治疗脂肪蓄积病症的药物组合物及其应用
CN102920991B (zh) 山药多糖和山药蛋白质的组合物的用途
CN112156120B (zh) 一种帚枝香青正丁醇提取物的用途
CN102526227A (zh) 藏边大黄提取物在制备防治脂肪性肝病药物中的应用
CN108653269B (zh) 一种具有降低心脏肌酸激酶同工酶含量功能的复方组合物及其应用
Chen et al. Alleviative effect of Ruellia tuberosa L. on insulin resistance and abnormal lipid accumulation in TNF-α-treated FL83B mouse hepatocytes
CN110279757A (zh) 减肥组合物及其制备方法
TWI484973B (zh) 金線連（蓮）經微生物發酵之混合物及其用途
CN102552238A (zh) 木犀草素的新用途
CN111214514B (zh) 续断及续断中活性组分在降糖中的应用
KR101241435B1 (ko) 메주 추출물을 함유하는 항당뇨제

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 2, building 13, 39 Lane 203, Qianjin Road, North Bridge Road, Panyu District, Guangdong, Guangzhou

Applicant after: Guangzhou Yunzhong Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 511486, Meishan building, No. 403 middle ring road, Shiqiao street, Guangzhou, Guangdong, Panyu District, 63.65.67.69

Applicant before: Guangzhou Yunzhong Biotechnology Co., Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant