CN106309419B - 树豆酮酸a及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了树豆酮酸A及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用，属于制药领域。发明人选用hMSC作为测试骨质疏松药效的细胞模型，试验结果能够反映受试药物对人骨生成、骨质疏松症的影响。细胞水平药效试验数据表明，树豆酮酸A能够促进hMSC的增殖和成骨分化，提示树豆酮酸A具有促进骨生成、减少骨质疏松的药用价值。CAA同时具有极好的安全性，有望开发为治疗骨质疏松症的药物。

Description

树豆酮酸A及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用

技术领域

本发明涉及树豆酮酸A及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis) 是一种常见病，主要累及中老年人。随着老龄化社会的到来，骨质疏松症已成为威胁中老年人健康、严重影响其生活质量的一个不容忽视的公共健康问题。骨质疏松症是一种代谢性骨疾病，可分为原发性和继发性两类，其中的原发性骨质疏松症占骨质疏松症的90%，又可分为2种亚型，其中的I型称绝经后骨质疏松症，Ⅱ型为老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症可继发于其他疾病或由药物引起。

骨质疏松症的防治药物通常使用包括钙剂和促进钙吸收的维生素D，以及抑制骨吸收的降钙素类药、双磷酸盐类药，促进骨形成的甲状旁腺激素药，阻止骨丢失的雌激素或选择性雌激素受体调节剂类药等。这些药物的疗效有限，存在一定的安全性问题。

间充质干细胞( Mesenchymal stem cells，MSC) 是干细胞家族的重要成员，存在于骨髓、脂肪、脐血、外周血，以及骨膜、肌肉等组织中。当前研究得较多的是骨髓来源的MSC。其基本特性，一是自我更新能力，在体内可增殖和维持自身的数量，在体外可克隆性生长；二是分化增殖能力，在一定环境和诱导因素作用下，可以分化为肌肉、神经、骨、软骨、脂肪、肌腱等不同组织类型的细胞。例如，MSC在含有一定浓度维生素C、β-磷酸甘油和地塞米松的培养液中可分化为成骨细胞。细胞外的钙结节生成是骨髓间充质干细胞（MSC）分化形成成骨细胞的标志，钙沉着可被茜素红S试剂染色，形成红色斑块，色斑面积与钙结节生成量正相关（① Maniatopoulos C, et al. Bone formation in vitro by stromal cellsobtained from bone mallow of young adult rats. Cell Tissue Res 1998; 254(2):317-330；② Vilmann, H. The in vivo staining of bone with alizarin red S.Journal of Anatomy 1969, 105 (Pt 3): 533–545.）。细胞膜碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase; AP) 的高表达则是成骨分化成功的另一指标，碱性磷酸酶可被BCIP/NBT试剂染色形成蓝紫色，色斑面积与其表达量正相关（① Foster LJ, et al. Differentialexpression profiling of membrane proteins by quantitative proteomics in ahuman mesenchymal stemcell line undergoing osteoblast differentiation. StemCells 2005, 23,1367-77；② Halbhuber KJ, et al. A modified Ce/Mg-BCIP-NBTformazan/indigoblue technique for demonstration of non-specific alkalinephosphatase activity.Cell Molecular Biology (Noisy-le-grand) 2004, 50 OnlinePub:OL507-514.）。预防和治疗骨质疏松症药物的作用原理，就包括了诱导或促进MSC成骨分化，即对于骨生成的促进作用。

树豆酮酸A是本发明人发现的一种天然有机化合物，其化学结构在CN101422450A中已获表征（化合物4）。在本发明中，树豆酮酸A的类似物指的是药用衍生物，特别其药用酯或盐，可以按常规方法制备得到。这些衍生物在体内可以重新解离出树豆酮酸A，具有与树豆酮酸A类似的生物活性。

CN102670576 A公开了树豆酮酸A及其药用衍生物具有治疗糖尿病伴随症或高脂血症的功效。但是现有技术中，并未公开树豆酮酸A及其药用衍生物具有治疗骨质疏松症的功效。

发明内容

本发明的目的在于提供树豆酮酸A及其类似物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

发明人选用人骨髓间充质干细胞（hMSC）作为测试骨质疏松药效的细胞模型，试验结果能够反映受试药物对人骨生成、骨质疏松症的影响。细胞水平药效试验数据表明，树豆酮酸A (Cajanonic Acid A; 简称CAA)能够促进hMSC的增殖和成骨分化，提示树豆酮酸A具有促进骨生成、减少骨质疏松的药用价值。

附图说明

图1 树豆酮酸A作用48 h对hMSC增殖的影响（CCK-8法）；

图2 树豆酮酸A作用14天对人骨髓间充质干细胞（hMSC）成骨分化的影响 (×100)（茜素红S染色法）；

图3树豆酮酸A作用17天对人骨髓间充质干细胞（hMSC）成骨分化的影响 (×100)（茜素红S染色法）；

图4树豆酮酸A作用20天对人骨髓间充质干细胞（hMSC）成骨分化的影响 (×100)（茜素红S染色法）；

图5 BCIP/NBT染色碱性磷酸酶法观察CAA作用14天对hMSC成骨分化的影响 (×100)；

图6 BCIP/NBT染色碱性磷酸酶法观察CAA作用17天对hMSC成骨分化的影响 (×100)。

具体实施方式

树豆酮酸A的药用衍生物，指可在体内重新解离出树豆酮酸A或其活性代谢物的化合物，特别是树豆酮酸A的药用盐或药用酯。更进一步的，树豆酮酸A的药用盐为树豆酮酸A的钠盐、钾盐、钙盐；树豆酮酸A的药用酯为树豆酮酸A的甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯、叔丁基酯。

下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

树豆酮酸A 促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化

测定树豆酮酸A （CAA）对人成骨细胞的前体细胞——人源性骨髓间充质干细胞（hMSC）的增殖、以及成骨分化的作用。

实验步骤：

细胞及培养：人源性骨髓间充质干细胞（hMSC）、MSC生长培养基以及成骨分化培养基购自德国的PromoCell 生物技术公司 （Promocell Biotech Co., Germany）。细胞平时用MSC生长培养基培养，细胞生长到80%满时传代。细胞培养环境：37℃、5% CO₂、95% 湿度的培养箱。

待测药物：树豆酮酸A（英文名称：Cajanonic Acid A），代号为CAA，纯度98.9%（HPLC检测）。

树豆酮酸A对人骨髓间充质干细胞（hMSC）增殖的影响

为了解CAA对hMSC增殖的影响，发明人将第四代的hMSC 用MSC生长培养基配成3×10⁴个/mL的悬液，以每孔100 μL接种于96孔板，培养24 h后加入不同浓度的CAA，继续培养48 h。实验中每个浓度设置6个复孔，并设置未添加药物的细胞对照孔和不含细胞的培养基溶剂孔空白孔。采用Cell Counting Kit 8（CCK-8）法测定细胞活力。对照孔细胞活力设定为1，CAA各浓度组的细胞活力以相对于对照组活力的比值表示。

在MSC生长培养基中，5 μmol·L^-1 - 80 μmol·L^-1的CAA与hMSC共同孵育48 h对细胞活力的影响见图1。由图可知，CAA在80 μmol·L^-1时使hMSC的活力较对照组增加了20%，说明80 μmol·L^-1的CAA能促进hMSC的增殖。CAA在25 μmol·L^-1时也有一定的促增殖作用，但10 μmol·L^-1及以下浓度则不能促进hMSC的增殖，说明CAA对hMSC的增殖促进作用具有剂量依赖性。

树豆酮酸A对人骨髓间充质干细胞（hMSC）成骨分化的影响

为了解CAA对人骨髓间充质干细胞（hMSC）成骨分化作用的影响，发明人将第四代的hMSC 用MSC生长培养基配成3×10⁴个/mL的悬液，以每孔100 μL接种于96孔板，培养至细胞完全融合。更换培养液为含有不同浓度CAA、或0.16% DMSO的MSC成骨分化培养基进行成骨分化诱导培养，期间每3天更换一次培养基；不含药物的细胞孔作为正常分化对照。另设置用MSC生长培养基继续培养的不诱导孔。于成骨分化诱导培养14天、17天或20天后对细胞进行茜素红S染色，通过形成的红色斑块观察细胞间钙结节生成的情况；或于成骨分化诱导培养的第14天或第17天用BCIP/NBT细胞碱性磷酸酶染色试剂盒染色，通过染出的蓝紫色斑块观察膜碱性磷酸酶表达的情况。

不同组hMSC在测试药物的存在下经成骨分化诱导14天、17天或20天，采用茜素红S对成骨细胞外钙沉积进行染色，以观察药物作用下的成骨分化情况，结果见附图2、3和4。以MSC生长培养基培养的hMSC不会分化为成骨细胞，所以不能被茜素红染色（图2 A、3 A、4A）；采用成骨分化培养基诱导培养14天、17天和20天的细胞 （对照组），有部分细胞能被茜素红S染色，且随着诱导培养时间延长，茜素红S染色程度增加，说明随着诱导时间的延长，有更多的细胞分化成为了成骨细胞（图2 B、3 B、4 B）；助溶剂二甲基亚砜(DMSO)在其最大工作浓度（0.16%）时不影响细胞的染色，采用成骨分化培养基诱导培养14天、17天和20天的结果与对照组的相一致，说明DMSO在本实验中不会影响hMSC的成骨分化（图2 C、3 C、4 C）。实验结果显示，CAA在2 μmol·L^-1、8 μmol·L^-1 或32 μmol·L^-1 浓度下作用于进行成骨分化诱导的hMSC，可使茜素红S染色程度和对照组相比明显增强，且这种增强具有量效性和时效性（图2 D-F、图3 D-F、图4 D-F）。CAA能增强茜素红S对细胞的染色，说明CAA能促进hMSC的成骨分化。

不同组hMSC在测试药物的存在下经成骨分化诱导14天或17天后，采用BCIP/NBT细胞碱性磷酸酶染色试剂盒对细胞碱性磷酸酶染色的结果，见附图5和6。与茜素红S染色情况相似，BCIP/NBT对细胞的细胞膜碱性磷酸酶（AP)染色（蓝紫色）与CAA的作用浓度和诱导分化时间均成呈正相关关系。亦说明CAA增强了成骨细胞活性，具有促进成骨的作用。

结论

CAA 能够促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，具有促进骨生成、减少骨质疏松的作用。CAA的上述特性使得其可以应用于治疗各种类型的骨质疏松，包括原发性骨质疏松或继发性骨质疏松。同时，其可以与现有的抗骨质疏松药物或保健品联合使用，以起到更好地抗骨质疏松效果。

Claims (2)

1.树豆酮酸A或其药用衍生物在制备治疗骨质疏松症药物的应用，其中，树豆酮酸A药用衍生物为树豆酮酸A的药用盐或药用酯，其中，树豆酮酸A药用酯为树豆酮酸A的甲基酯、乙基酯、丙基酯、异丙基酯、丁基酯、异丁基酯或叔丁基酯。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：树豆酮酸A药用盐为树豆酮酸A的钠盐、钾盐或钙盐。