CN102666589B

CN102666589B - EphA3抗体

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Publication number: CN102666589B
Application number: CN201080056618.XA
Authority: CN
Inventors: 肯尼思·鲁尔森; 大卫·马迪尼兹; 克里斯蒂娜·伊; 克里斯托弗·R·贝炳东; 杰弗里·T·亚兰东
Original assignee: Kalobios Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Hermanigan
Priority date: 2009-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: US9290571B2; EP2488554A1; CA2777068C; CA2777068A1; JP2013508292A; US8664365B2; JP2016094424A; US20140120114A1; US20110123549A1; EP2488554B1; PT2488554T; DK2488554T3; AU2010313621B2; AU2010313621C1; AU2010313621A1; CN102666589A; WO2011053465A1; PL2488554T3; ES2743558T3

Abstract

本公开内容涉及高亲和力的EphA3抗体以及使用此类抗体的方法，当将其给予人体时可减少免疫原性以治疗疾病。

Description

EphA3抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月14日提交的美国临时专利申请第61/251,668号的权益，通过引用将该临时申请并入本文。

发明背景

Eph受体酪氨酸激酶(Ephs)属于使酪氨酸残基上的蛋白磷酸化的激酶——受体酪氨酸激酶(RTKs)的大群体。Ephs与它们的膜结合ephrin配体(ephrins)控制着细胞定位和组织结构((Poliakov,A.等,Dev Cell7:465-80(2004))。与其他的受体酪氨酸激酶相比，Eph受体活化不仅需要配体结合及二聚化而且还涉及预先形成的配体寡聚物。因此，Eph受体的酪氨酸磷酸化需要ephrin配体以它们聚合的或膜附着的形式呈递(Davis等,Science266:816-819(1994))。功能性和生物化学的Eph反应都发生在较高的配体寡聚化状态下(Stein等,Genes Dev12:667-678(1998))。

除了其他的模式功能以外，已证实各种Ephs和ephrins在血管发育中发挥作用。也已观察到下调一些ephrins和它们的受体在成年人中的再出现可促进肿瘤侵袭、转移及血管新生。例如，显性抑制的、可溶的EpbA2或A3蛋白显现出在体外对ephrin诱导的内皮细胞功能的作用以及在体内对肿瘤血管生成和进展的作用(Nakamoto等,Microsc Res Tech59:58-67(2002);Brantley-Sieder等,Curr Pharm Des10:3431-42(2004);Brantley等，Oncogene21:7011-26(2002);Cheng等，Neoplasia5:445-56(2003).Dobrzanski等，Cancer Res64:910-9(2004))。而且已发现Eph家族成员在来源于各种各样的人实体肿瘤的肿瘤细胞上过表达(Brantley-Sieders等,Curr Pharm Des10:3431-42(2004);Marme,D.Ann Hematol 81 Suppl2:S66(2002);Booth,C等,Nat Med8:1360-1(2002))。

也已报道在慢性骨髓性白血病(CML)患者的加速期及急性转化期Epha3在CD34⁺细胞上被活化并过表达(Cilloni等,American Society ofHematology,Abstract1092,2008(2008年11月14日网上可见))。Cilloni等报道了当将原代CML细胞或EphA3转染的正常细胞与特异性单克隆抗体孵育时，该抗体诱导原代细胞和转染细胞增殖的显著减少，减少集落生长并且诱导粘附特性的改变。该抗体在正常对照细胞或来源于慢性期CML患者的细胞中没有诱导任何的显著改变。

本发明部分地基于新的抗EphA3抗体的发现。

发明概述

本发明涉及有效的抗EphA3抗体以及使用此类抗体的方法，例如，用于治疗涉及EphA3的疾病。本发明的抗体具有如本文所述的特征。因此，在一方面，本发明的抗体包含V_H区(重链可变区)，所述V_H区包含CDR3，所述CDR3包含氨基酸序列X₁GX₂YEX₃FDX₄，其中X₁为S或G，X₂为Y或V，X₃为E或D，以及X₄为S、V或I，附加条件是当氨基酸序列为SGYYEDFDS时，CDR1不是SYWIN，并且当氨基酸序列为SGYYEEFDS时，CDR1不是TYWIS。在一些实施方案中，抗体具有包含氨基酸序列GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV或SGYYEDFDI的CDR3。在一些实施方案中，抗体具有J区段，其包含与人生殖细胞系J区段氨基酸序列的至少80%、通常85%或至少90%同一性，或其与人生殖细胞系J区段在不超过两个位置不同；以及V区段，其包含与人生殖细胞系V区段氨基酸序列的至少80%、通常至少85%和优选90%或更高的同一性。在一些实施方案中，J区段包含与人JH6氨基酸序列的至少90%同一性并且V区段包含与人VH11-02氨基酸序列的至少90%同一性。在一些实施方案中，抗体具有包含WGQGTTVTVS的FR4或与WGQGTTVTVS不超过1个氨基酸不同的FR4。在一些实施方案中，抗体包含如图1中列出的V_H区所示的V_HCDR1、或V_H CDR2、或V_H CDR1与V_HCDR2二者。例如，本发明的抗体可具有V_H CDR1和/或CDR2，所述V_H CDR1包含氨基酸序列GYWMN、TYWIS或SYWIN，所述CDR2包含氨基酸序列DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG、DIYPGSGNTNYDEKFEG或DIYPGSGNTNYDEKFKR。在一些实施方案中，抗体具有V_H CDR1GYWMN和CDR2DIYPGSGNTNYDEKFQG。在一些实施方案中，抗体具有V_H CDR1TYWIS和V_H CDR2DIYPGSGNTNYAQ(K/E)F(Q/R/L)G。在一些实施方案中，本发明的抗体具有来自于如图1中所示的V区的其中之一的V_H CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗体具有图1中所示的V区段序列的V_H V区段氨基酸序列。在一些实施方案中，V_H具有图1中所列出的V_H区的序列。

本发明也提供了具有V_L区的抗体，所述V_L区包含具有序列X₁X₂YX₃X₄YPYT的CDR3结合特异性决定簇，其中X₁为G、V或A；X₂为Q、R或G；X₃为A、S或L；以及X₄为N或K。在一些实施方案中，CDR3包含GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT或VQYLNYPYT。在一些实施方案中，当CDR3为VQYANYPYT时，CDR1不是RASQEISGYLG或RASQGllSYLA和/或CDR2不是AASTLDS或AASSLQS。在一些实施方案中，V_L区包含J区段，其包含与人生殖细胞系J区段氨基酸序列的至少80%、通常85%或90%同一性，或其与人生殖细胞系区段在不超过两个氨基酸不同；以及V区段，其包含与人生殖细胞系V区段氨基酸序列的至少80%、通常至少90%或更高的同一性。在一些实施方案中，J区段相对于来源于人生殖细胞系Jκ2氨基酸序列的序列FGQGTKLEIK，具有不超过两个氨基酸的改变，经常不超过1个氨基酸的改变，并且V区段包含与人生殖细胞系JκI L15氨基酸序列的至少90%同一性。在一些实施方案中，抗体的FR4具有氨基酸序列FGQGTKLEIK或相对于序列FGQGTKLEIK有不超过1个氨基酸残基的改变。在一些实施方案中，V_L区包含图1中所示的V_L区序列的CDR1、或CDR2、或CDR1与CDR2二者。例如，CDR1可具有序列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG或RASQSISSYLA；和/或CDR2可具有序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR或AASTLDS序列。在一些实施方案中，CDR1具有序列RASQGIISYLA并且CDR2具有序列GASSLQS。在一些实施方案中，CDR1具有序列QASQDISTYLN并且CDR2具有序列AASSLQR或AASSLQS。在一些实施方案中，CDR1具有序列RASQSISSYLA并且CDR2具有序列AASSLQR。在一些实施方案中，V_L区包含图1中所列出的V_L区其中之一的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，V_L区包含具有如图1中所示的V区段序列的V区段。在一些实施方案中，V_L区具有图1中所列出的V_L区的序列。在典型的实施方案中，抗体的V_H区包含任一以上段落中所述的V_H区。

在一些实施方案中，本发明提供了包含具有CDR3的V_L区的抗体，所述CDR3包含GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT或VQYLNYPYT。在一些实施方案中，抗体包含含有氨基酸序列X₁GX₂YEX₃FDX₄的重链CDR3，其中X₁为S或G，X₂为Y或V，X₃为E或D以及X₄为S、V或I。在一些实施方案中，重链CDR3包含氨基酸序列GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV或SGYYEDFDI。在一些实施方案中，抗体包含图1中所列出的轻链CDR1或CDR2，或图1中所列出的重链CDR1或CDR2。在一些实施方案中，抗体包含如图1中所列出的轻链CDR1和CDR2和/或图1中所列出的重链CDR1与CDR2。在一些实施方案中，抗体包含图1中所列出的V_L V区段。

本发明还提供了包含V_H区和以上段落中所列出的V_L区CDR3序列的抗体，所述V_H区包含具有序列SGYYE(E/D)FDS的CDR3，附加条件是V_L区CDR3序列不是VQYANYPYT或VQYMNYPYT。在一些实施方案中，抗体包含图1中所列出的重链CDR1或CDR2，或图1中所列出的轻链CDR1或CDR2。在一些实施方案中，抗体包含如图1中所列出的重链CDR1与CDR2和/或图1中所列出的轻链CDR1与CDR2。

在一些实施方案中，本发明的抗EphA3抗体包含来自于图1中所列出的V_H区其中之一的V_H CDR1、CDR2和CDR3以及来自于图1中所列出的V_L区其中之一的V_L CDR1、CDR2和CDR3。

本发明的抗体可包含如图1中所列出的V_H区或如图1中所列出的V_L区。抗体经常包含如图1中所列出的V_H区和如图1中所列出的V_L区。在一些实施方案中，抗体包含V_H区与V_L区的组合，所述组合包括：a)SEQID NO:l与SEQ ID NO:20，b)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:l1，c)SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:12，d)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:19，e)SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:21，f)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:22，g)SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:23，h)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:11，i)SEQ IDNO:3与SEQ ID NO:12，j)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:21，k)SEQ IDNO:3与SEQ ID NO:22，1)SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:11，m)SEQ IDNO:4与SEQ ID NO:13，n)SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:11，o)SEQ IDNO:5与SEQ ID NO:13，p)SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:21，q)SEQ IDNO:6与SEQ ID NO:14，r)SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:15，s)SEQ IDNO:7与SEQ ID NO:14，t)SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:15，u)SEQ IDNO:8与SEQ ID NO:14，v)SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:15，w)SEQ IDNO:9与SEQ ID NO:16，x)SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:17，y)SEQ IDNO:9与SEQ ID NO:19，z)SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17，aa)SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:18，或bb)SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:20。

在一些实施方案中，例如，具有选自图1中V_H区序列的V_H区序列和选自图1中V_L区序列的V_L区的本发明的抗体，具有通过37℃下进行的质子表面共振分析所测定的，优于约10nM的单价亲和力，而且经常优于约5nM或1nM。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体具有约10nM、约5nM、约2.5Nm、约1nM、约0.5nM、约0.25nM或约0.1nM或更好的亲和力(使用质子表面共振所测量的)。

如本文所述的本发明的抗体可具有在N末端上含有蛋氨酸的V_H区和/或V_L区。

在一些实施方案中，抗体为IgG。在一些实施方案中，抗体为IgG1或IgG3。在一些实施方案中，抗体为IgG2或IgG4。

在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列的重链恒定区和/或具有SEQ ID NO:25中所列出的氨基酸序列的κ轻链恒定区。

在一些实施方案中，抗体的重链恒定区为去岩藻糖基化的。在一些实施方案中，包含本发明抗体的抗体制剂为低岩藻糖基化的或去岩藻糖基化的。

在一些实施方案中，本发明的抗EphA3抗体具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列各自包括SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35，或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:27；而且，抗体为去岩藻糖基化。

在一些实施方案中，抗体为(Fab')₂。

在一些实施方案中，抗体为聚乙二醇化的。

在一些实施方案中，抗体活化EphA3。

在一些实施方案中，抗体不与诸如ephrin A5的天然配体竞争性结合EphA3。

在另一方面，本发明提供了治疗患有EphA3依赖性疾病的患者的方法，所述方法包括给予患者治疗上有效量的本文所述的本发明的抗体。例如患者可能患有癌症。在一些实施方案中，给予患有实体肿瘤的患者抗体，所述实体肿瘤包含表达EphA3的肿瘤细胞。在一些实施方案中，给予患有肿瘤的患者抗体，所述肿瘤没有表达EphA3的肿瘤细胞。

在一些实施方案中，给予患有骨髓增生性病症的患者抗体。在一些实施方案中，给予患有急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病的患者抗体。在一些实施方案中，给予患有淋巴瘤的患者抗体。在一些实施方案中，给予患有骨髓增生异常综合征、脾大性红细胞增多症、特发性血小板增多症或特发性骨髓纤维变性的患者抗体。

附图简要说明

图1提供了本发明抗EphA3抗体的示例性V_H和V_L序列。

图2提供了重链CDR2/FR3盒式结构的示意图。

图3显示了抗EphA3 IgGs的抗原结合ELISA结果。将EphA3-Fc包被的ELISA平板用嵌合的IIIA4(圆圈)、本发明的示例性基因工程的抗体(方块)或对照的IgG(三角形)处理，探针探测与HRP标记的抗人κ链的结合。

图4显示了本发明基因工程的抗体对于EphA3的特异性。将各种Eph蛋白包被到ELISA平板上，用基因工程的抗体处理，探针探测与HRP标记的抗人κ链的结合。

图5显示了评估示例性基因工程的本发明的抗EphA3抗体与表达EphA3的细胞表面结合的能力的实验中，对三种细胞系的流式细胞术分析的数据。用2%的牛血清白蛋白(BSA)和鼠IgG封闭B16、SKmel28以及LnCAP细胞，用基因工程的抗EphA3IgG、嵌合的IIIA4或同型对照的IgG作探针探测。使用Facs Caliber流式细胞仪(BD)通过藻红蛋白标记的抗人IgG检测结合抗体。通过碘化丙啶染色排除死细胞。对每幅图表而言，对照抗体的图谱为图表中所示的最左边的曲线。

图6提供了数据，该数据显示与岩藻糖基化的抗EphA3抗体相比，去岩藻糖基化的抗EphA3抗体增强抗AML细胞的ADCC活性。

发明详述

本文所用的“EphA3”指的是Eph受体A3。这一受体也被称作“人胚胎激酶”、“hek”、“eph样酪氨酸激酶1”、“etk1”或“tyro4”。EphA3属于蛋白-酪氨酸激酶家族的ephrin受体亚家族。EPH和EPH相关的受体参与介导发育事件。EPH亚家族中的受体通常具有单个的激酶结构域，和包含富含半胱氨酸的结构域及两个III型粘连蛋白重复的细胞外区域。基于ephrin受体的细胞外结构域序列的相似性和它们结合ephrin-A及ephrin-B配体的亲合力，将ephrin受体分成两组。EphA3结合ephrin-A配体。EphA3核酸和蛋白序列是已知的。通过登录号(EAW68857)可获得示例性的人EphA3氨基酸序列。

在本发明中，EphA3的“活化”引起EphA3的磷酸化。因此，在本发明语境中，活化EphA3，即引起EphA3磷酸化，的抗体被认为是激动剂。可通过二聚化活化EphA3。此类活化可导致磷酸化及凋亡，尽管对细胞变圆不是必需的。例如当发生EphA3簇集时，活化可额外地导致形态学的改变，典型地就是细胞变圆。

在本发明中，“EphA3抗体”或“抗EphA3抗体”可互换地使用，指的是特异性结合EphA3的抗体。在一些实施方案中，抗体可使EphA3二聚化。该术语包括在ephrin配体(例如ephrin A5)结合存在的情况下结合EphA3的抗体，以及结合配体结合位点并与配体竞争性结合EphA3的抗体。

“在ephrin配体结合存在的情况下结合EphA3的EphA3抗体”指的是不能显著阻止诸如ephrin A5的ephrin配体结合EphA3的抗体。在包含诸如ephrin A5的ephrin配体和EphA3的结合反应中，此类抗体的存在减少了ephrin配体结合EphA3小于约30%，通常小于20%或10%。

术语“mAb IIIA4”指的是单克隆抗体IIIA4，其最初通过抗LK63人急性前B白血病细胞以亲和力分离EphA3而产生(Boyd等，J Biol Chem267:3262-3267,1992)。mAb IIIA4与天然EphA3的球形ephrin结合结构域结合(例如Smith等,J.Biol.Chem279:9522-9531,2004)。它以登录号91061920被储存在欧洲动物细胞培养协会(European Collection of AnimalCell Cultures)(参见例如欧洲专利第EP0590030号)。

本文所用的“具有活性同型的抗体”指的是具有人Fc区的抗体，所述Fc区结合免疫效应细胞上存在的Fc受体。“活性同型”包括IgGl、IgG3、IgM、IgA和IgE。该术语包括具有人Fc区的抗体，所述的Fc区包含调节Fc效应功能的修饰，例如糖基组分和/或糖基化水平的突变或改变。

“Fc区”指的是除了免疫球蛋白功能区第一恒定区以外抗体其余的恒定区。因此，Fc指的是IgA、IgD和IgG的后两个免疫球蛋白功能区的恒定区，IgE和IgM的后三个免疫球蛋白功能区的恒定区以及这些功能区的柔性铰链区N末端。对IgA和IgM而言，Fc可包括J链。对IgG而言，Fc包含Cγ1与Cγ间的铰链以及免疫球蛋白功能区Cγ2和Cγ3。本领域中应理解的是Fc区的界限是可变的，然而，人IgG重链Fc区通常被定义为包含C226或P230位残基至其羧基末端，如Kabat等使用根据EU索引的编号(1991,NIH Publication91-3242,National TechnicalInformation Service,Springfield,Va.)。术语“Fc区”可指分离的该区域或在抗体或抗体片段语境下的该区域。“Fc区”包含天然存在的Fc区等位基因变体以及调节效应功能的修饰。Fc区也包括不导致生物学功能改变的变体。例如可从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸而没有实质的生物学功能缺失。根据本领域中已知的通用规则选择此类变体以使其对活性的影响最小(参见例如Bowie等,Science247:306-1310,1990)。

术语“平衡解离常数”或缩写为(K_D)的“亲和力”指的是解离速率常数(K_d，时间^-1)除以结合速率常数(K_a，时间^-1，M^-1)。可使用本领域中已知的任何方法测量平衡解离常数。本发明的抗体为高亲和力抗体。通过37℃下进行的质子表面共振分析所测定的，此类抗体具有优于(小于)约50nM，并且经常小于约10nM的单价亲和力。因此，在一些实施方案中，(如使用质子表面共振所测量的)本发明的抗体具有的亲和力小于约50nM，通常小于约25nM或甚至小于10nM，例如约5nM或约1nM。在本发明的背景下，如果亲和力较高，例如以较低的K_D数值为证，那么该亲和力是“较好的”。

短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“与……特异性(或选择性)免疫反应”，当其关于蛋白或肽时，指的是其中抗体与目的蛋白结合的结合反应。在本发明的背景下，抗体通常以至少大于它对其他抗原亲和力100倍的亲和力结合EphA3。

本文所用的“抗体”指的是功能上被定义为结合蛋白而且结构上被定义为包含本领域技术人员所识别的氨基酸序列的蛋白，所述的氨基酸序列就是衍生于编码动物产生抗体的基因的免疫球蛋白的骨架区。抗体可由一个或多个多肽组成，所述的多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段所编码。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其各自依次定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知的典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻链”(约25KD)和一条“重链”(约50-70KD)。每条链的N末端定义为约100-110个或更多的氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变的轻链(V_L)和可变的重链(V_H)各自指的是这些轻链和重链。

本文所用的术语“抗体”包括保留结合特异性的抗体片段。例如，存在着许多很好特征化的抗体片段。因此，例如胃蛋白酶消化抗体C末端至铰链区的二硫键而产生F(ab)’₂，Fab的二聚体，其自身是通过二硫键连接到VH-CH1的轻链。温和条件下，破坏铰链区的二硫键，还原F(ab)’₂，因此将F(ab)’₂二聚体转化为F(ab)’单体。F(ab)’单体本质上是带有部分铰链区的Fab(见基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993)，对其他的抗体片段更为详细的描述)。虽然依据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是技术人员应理解片段可以化学方法地或通过利用重组DNA方法学重新合成。因此，本文所用的术语抗体也包括抗体片段，通过整个抗体的修饰产生或利用重组DNA方法学合成该片段。

抗体包括V_H-V_L二聚体，其包括单链抗体(以单一的多肽链存在的抗体)，诸如单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变的重链区与可变的轻链区连接在一起(直接地或通过肽连接体)以形成连续多肽。单链Fv抗体为共价连接的V_H-V_L，其可表达于包括编码序列的V_H-和V_L-的核酸，所述的序列直接连接或通过肽编码连接体连接(例如Huston等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。虽然V_H与V_L彼此连接成单一的多肽链，但是V_H与V_L功能区为非共价地联合。可选择地，抗体可以是另一片段。例如利用重组技术也可以产生其他的片段，如可溶性蛋白或获取于筛选方法的片段。抗体也可以包括双抗体和微抗体。本发明的抗体也包括重链二聚体，诸如骆驼科(camelids)来源的抗体。

本文所用的“V区”指的是抗体可变区功能区，其包含骨架1、CDR1、骨架2、CDR2和骨架3的区段，包括由于B细胞分化期间重链和轻链V区重排而将其区段添加到V区段的CDR3和骨架4。本文所用的“V区段”指的是V基因所编码的V区的区域(重链或轻链)。重链可变区的V区段编码FR1-CDR1-FR2-CDR2和FR3。出于本发明的目的，轻链可变区的V区段被定义为延伸通过FR3直至CDR3。

本文所用的术语“J区段”指的是编码可变区的子序列，其包括CDR3和FR4的C末端部分。生殖细胞系J区段由免疫球蛋白J基因区段编码。

本文所用的“互补决定区(CDR)”指的是每条链中的3个超变区，其中断了由轻链和重链可变区所建立的4个“骨架”区。CDRs主要负责结合抗原表位。每条链的CDRs通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始按序编号，而且通常通过特定CDR所处于其中的链以鉴定。因此，V_HCDR3位于抗体重链的可变功能区，在其中可找到它，而V_LCDR1为来自于抗体轻链的可变功能区的CDR1，在其中可找到它。

不同轻链或重链的骨架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的骨架区，即构成轻链和重链的合并的骨架区，用于在三维空间内定位及排列CDRs。

利用各种本领域中熟知的定义可确定CDRs和骨架区的氨基酸序列，例如Kabat,Chothia,international ImMunoGeneTics database(IMGT),和AbM(参见例如Johnson等,supra;Chothia&Lesk,1987,Canonicalstructures for the hypervariable regions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917;Chothia C等,1989,Conformations of immunoglobulinhypervariable regions.Nature342,877-883;Chothia C等,1992,structuralrepertoire of the human VH segments J.Mol.Biol.227,799-817;Al-Lazikani等,J.Mol.Biol1997,273(4))。抗原结合位点的定义也如以下所述：Ruiz等,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.,28,219-221(2000);以及Lefranc,M.-P.IMGT,the internationalImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.Jan l;29(l):207-9(2001);MacCallum等,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and bindingsite topography,J.Mol.Biol,262(5),732-745(1996);以及Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin等,Methods Enzymol.,203,121-153,(1991);Pedersen等,Immunomethods,1,126,(1992);以及Rees等,In Sternberg M.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction.OxfordUniversity Press,Oxford,141-1721996)。

“表位”或“抗原决定簇”指的是位于抗原上与抗体结合的位点。表位可由连续的氨基酸或非连续的由蛋白的三级折叠所并列的氨基酸组成。通常暴露于变性溶剂时由连续氨基酸组成的表位仍可保留而用变性溶剂处理时由三级折叠所形成的表位通常会丧失。表位通常包括独特空间构象中至少3个、更经常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如X射线结晶学及二维核磁共振。参见例如分子生物学方法中的表位定位方案(Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology)，第66卷(Vol.66)，Glenn E.Morris,Ed(1996)。

本文所用的“嵌合的抗体”指的是免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、取代或交换从而使得抗原结合位点(可变区)连接不同的或改变的类别、效应功能和/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分，被改变、取代或与具有不同的或改变的抗原特异性的可变区或其部分交换；或与来源于其他的物种，或来自于其他的抗体类别或亚类相一致的序列。

本文所用的“人源化抗体”指的是来自于供体抗体的CDRs中的免疫球蛋白分子被移植到人骨架序列。人源化抗体也可包含源于骨架序列的供体的残基。人源化抗体也可包含至少人免疫球蛋白恒定区的一部分。人源化抗体也可包含既在受体抗体中找不到也在输入的CDR或骨架序列中也找不到的残基。可利用本领域中已知的方法进行人源化(例如Jones等,Nature321:522-525;1986;Riechmann等,Nature332:323-327,1988;Verhoeyen等,Science239:1534-1536,1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992;美国专利申请第4,816,567号)，其包括诸如“超级人源化”抗体(Tan等,J.Immunol.169:1119,2002)及“置换”(例如Staelens等,Mol.Immunol.43:1243,2006;和Roguska等,Proc.Natl.Acad.Sci USA91:969,1994)的技术。

本发明背景下“Humaneered^TM”抗体指的是具有参照抗体的结合特异性的基因工程的人抗体。本发明中所使用的“Humaneered^TM”抗体具有免疫球蛋白分子，该分子包含衍生于供体免疫球蛋白的最小序列。通常，通过将DNA序列与人V_H区段序列连接，将来自于参照抗体的BSD CDR3轻链与人V_L区段序列连接，抗体就是“Humaneered^TM”，所述的DNA序列编码来自于参照抗体重链的CDR3区的结合特异性决定簇(BSD)。美国专利申请公开第20050255552号和美国专利申请公开第20060134098号中提供了人基因工程的(humaneering)方法。

本发明背景下所用的术语“结合特异性决定簇”或“BSD”指的是CDR区中决定抗体结合特异性所必需的最小的连续的或非连续的氨基酸序列。在本发明中，最小的结合特异性决定簇存在于抗体的重链和轻链的CDR3序列的部分或全长中。

本文所用的“人的”抗体包括人源化的和Humaneered^TM抗体，以及利用已知的技术获得的人单克隆抗体。

“低岩藻糖基化的”抗体制剂指的是其中小于50%的寡聚糖链包含α1,6-岩藻糖的抗体制剂。在“低岩藻糖基化的”抗体制剂中，通常小于约40%，小于约30%，小于约20%，小于约10%或小于5%或小于1%的寡聚糖糖链包含α1,6-岩藻糖。

“去岩藻糖基化的”抗体在碳水化合物中缺乏α1,6-岩藻糖，所述碳水化合物附着在IgG重链的CH2功能区。

当关于核酸的部分使用它时，术语“异源的”指的是核酸包含两个或多个子序列，所述子序列通常找不到彼此在本质上有相同的关系。例如，核酸通常是重组产生的，具有两个或多个序列，例如来自于不相关的基因经排列而成为新的功能性核酸。同样地，异源性蛋白经常指的是两个或多个找不到彼此在本质上有相同关系的子序列。

当关于例如细胞、核酸、蛋白或载体使用它时，术语“重组的”指的是通过异源性核酸或蛋白的引入，或天然核酸或蛋白的改变，或衍生于如此修饰的细胞的细胞，将细胞、核酸、蛋白或载体修饰。因此，例如重组细胞表达不能在细胞的天然形式(非重组的)中找到的基因或表达除非是异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。本文的“重组核酸”意指最初形成于体外的核酸，一般来说通过对核酸的操作，例如使用聚合酶或内切酶，以自然界中正常找不到的形式存在。如此可获得不同序列的可操作地连接。因此，分离的核酸，线性形式或通过连接非正常连接的DNA分子而在体外形成的表达载体，出于本发明目的，都被认为是重组。应理解的是一旦将重组核酸制造并再引入到宿主细胞或生物体中，它将非重组地复制，即利用体内宿主细胞的细胞器而不是体外的操作；然而此类核酸，一旦重组地产生，尽管随后非重组地复制，出于本发明的目的，仍然认为是重组。同样地，“重组蛋白”是一种利用重组技术制造的蛋白，即通过如上文所述的重组核酸的表达。

本文所用的EphA3依赖性疾病指的是其中表达EphA3的细胞是待治疗疾病的治疗靶标的疾病。

术语“血管生成源性骨髓前体细胞”指的是骨髓来源的内皮前体细胞和/或循环的内皮细胞前体细胞。

术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”指的是瘤细胞。该术语包括良性以及恶性的癌细胞。相对于其所来源的细胞类型，致瘤性转化与肿瘤细胞的表型改变有关。改变可包括接触抑制的丧失、形态学的改变和异常生长(见Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(3rd edition,1994)。

本发明背景下“癌症的抑制生长”指的是减慢生长或减少患有癌症的患者的癌细胞负荷量。因此“癌症的抑制生长”包括杀死癌细胞以及减慢或阻止癌细胞的生长。

本文所用的“治疗制剂”指的是一种制剂，当将其以治疗上有效的剂量给予患有疾病的患者时，将治愈或至少部分地阻止疾病的症状及疾病相关的并发症。

两种或多种多肽(或核酸)序列背景下，术语“同一的”或“同一性”百分比指的是两种或多种序列或子序列，其是相同的或具有特定百分比的氨基酸残基(或核苷酸)，所述的氨基酸残基(或核苷酸)是相同的(即约60%同一性，优选70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或在特定区域内更高的同一性，当在比较窗或指定区内比较和比对最大相似性时)，如利用带有下文所述的缺省参数的BLAST或BLAST2.0序列比较算法，或通过手工算法和直观检查(参见例如NCBI网站)所测量的。然后据说此类序列是“实质上同一的”。“实质上同一的”序列也包括具有缺失和/或添加的序列以及那些具有取代及天然形成的，例如多态的或等位基因的变体和人工变体。如下文所述，优选的算法可说明缺口等的原因。优选地，蛋白序列同一性存在于至少约25个氨基酸长度的区域，或更优选50-100个氨基酸长度的区域，或蛋白长度的区域。

本文所用的“比较窗”包括参照连续位置的数目其中之一的区段，该连续位置通常20个-600个，经常约50个-约200个，更经常约100个-约150个，其中在将两条序列进行最佳比对后，可将序列可与相同数量连续位置的参照序列进行比较。本领域中熟知用于比较的序列比对方法。可进行最佳的用于比较的序列比对，例如通过Smith and Waterman(1981)Add.APL Math2:482的局部同一性算法、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法搜索、计算机执行这些算法(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)或通过手工算法和直观检查(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等,eds.1995supplement)。

适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例包括BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。BLAST和BLAST2.0可与本文所述的参数一起使用，以测定本发明核酸和蛋白的百分比序列同一性。BLASTN程序(对于核酸序列而言)使用的缺省值为字长(W)11，期望值(E)10，M=5，N=-4和两链比较。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的缺省值为字长3，期望值(E)10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))，比对(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4和两链比较。

两个多肽为实质上相同的指征是第一个多肽与抗第二个多肽所产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，通常多肽与另一个多肽为实质上相同的，例如，其中两个肽仅通过保守取代而不同。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上提纯”指的是实质上或基本上游离于如在其天然状态中所发现的正常伴随它的组分的物质。通常利用分析化学技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定纯度和均一性。制剂中存在的占优势的种类的蛋白就是实质上纯化的。在一些实施方案中术语“纯化的”表示蛋白在凝胶电泳中基本上产生一条带。优选地它意味着蛋白为至少85%纯化的，更优选至少95%纯化的，以及最优选至少99%纯化的。

术语“多肽”、“肽”及“蛋白”可在本文中互换使用，指的是氨基酸残基的聚合体。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然形成的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体以及包含修饰的残基的那些天然形成的氨基酸聚合体和非天然形成的氨基酸聚合体。

术语“氨基酸”指的是天然形成的和合成的氨基酸以及与天然形成的氨基酸功能相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然形成的氨基酸是由基因密码编码的那些氨基酸以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然形成的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢原子连接的碳原子、羧基、氨基以及R基，例如同型丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物可具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然形成的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指的是具有不同于氨基酸的一般化学结构但是功能与天然形成的氨基酸相似的结构的化合物。

本文的氨基酸可通过俗称的三个字母的符号或IUPAC-IUB生化命名委员会所推荐的1个字母的符号来提及。同样地，核苷酸可通过他们公认的单个字母的密码来提及。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守修饰变体指的是编码相同的或基本相同的氨基酸序列或核酸在其中并不编码氨基酸序列的那些核酸，基本相同或相关的，例如天然连续序列的那些核酸。由于基因密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码大多数的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸的每个位置上都是指定的密码子，密码子可变成另一个所述的相应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变体为“沉默的变体”，其是一类保守修饰变体。本文的编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的沉默变体。技术人员应理解在某些背景下核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG以外，对蛋氨酸而言AUG通常是唯一的密码子而对色氨酸而言TGG通常是唯一的密码子)都可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，就表达产物而言，但不就实际的探针序列而言编码多肽的核酸的沉默变体经常隐含在所述的序列中。

至于氨基酸序列，技术人员应理解，单独的核酸、肽、多肽或蛋白序列的取代、缺失或添加为“保守修饰的变体”，其可改变、增加或删除所编码序列中单一的氨基酸或一小部分的氨基酸，其中改变是用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。本领域中熟知提供功能相似氨基酸的保守取代表。除此之外而且并不排除，此类保守的修饰变体为本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。典型地相互之间的保守取代：1)丙氨酸(A),甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R),赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),蛋氨酸(M),缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)；7)丝氨酸(S),苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C),蛋氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。

如本说明书和附加的权利要求中所使用的，单数形式的“一(a)”,“一个(an)”和“所述(the)”包括了复数参照物，除非上下文另有明确指示。

I.简介

本发明涉及以高亲和力结合EphA3而且通常活化EphA3的抗体。所述的抗体包含可变区，所述可变区与人生殖细胞系V_H和V_L序列有高度氨基酸序列同一性。在优选的实施方案中，本发明抗体的CDRH3包含氨基酸序列X₁GX₂YE(X₃)FDX₄，其中X₁为S或G，X₂为Y或V，X₃为E或D以及X₄为S、V或I，附加条件是氨基酸序列不是SGYYEDFDS。在一些实施方案中，本发明抗体的CDRL3包含氨基酸序列X₁X₂YX₃X₄YPYT，其中X₁为V或A，X₂为Q、R或G，X₃为A、S或L以及X₄为N或K。

通常，CDR3除BSD之外的部分和完整的FR4是由人生殖细胞系序列组成。在一些实施方案中，除BSD之外的CDR3-FR4序列与人生殖细胞系序列在每条链上有不超过两个氨基酸的不同。在一些实施方案中，J区段包含人生殖细胞系J区段。例如人生殖细胞系序列可通过公开可获得的国际免疫遗传学数据库(international ImMunoGeneTics database)(IMGT)或V-base(互联网网址vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)确定。

人生殖细胞系V区段库由51个重链V区、40κ轻链V区段以及31λ轻链V区段组成，形成了总数为3621个的生殖细胞系V区对。此外，这些V区段的大多数存在着稳定的等位基因变体，但是这些变体对于生殖细胞系库的结构多样性的贡献是有限的。所有人生殖细胞系V区段基因的序列是已知的而且可以在由MRC蛋白质工程中心，剑桥，英国(MRCCentre for Protein Engineering,Cambridge,United Kingdom)所提供的V-base数据库中获取(也见于Chothia等,1992,J Mol Biol227:776-798;Tomlinson等,1995,EMBO J14:4628-4638;以及Williams等,1996,J MolBiol264:220-232)。

本文所述的抗体或抗体片段可表达于原核或真核的微生物系统中或更高级的真核细胞诸如哺乳动物细胞中。

本发明中应用的抗体可为任何形式的。例如，在一些实施方案中，抗体可为包括恒定区，例如人恒定区，例如完整的Ig，Fab，Fab’,F(ab’)₂，或完整的免疫球蛋白的片段，例如scFv或Fv。

II.重链

本发明的抗EphA3抗体的重链包含重链V区，所述重链V区包含下列的成分：

1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人重链V区段序列；

2)包含氨基酸序列X₁GX₂YE(X₃)FDX₄的CDRH3区，其中X₁为S或G，X₂为Y或V，X₃为E或D以及X₄为S、V或I，附加条件是氨基酸序列不是SGYYEDFDS；和

3)来源于人生殖细胞系J基因区段的FR4。

在一些实施方案中，CDR3包含GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV或SGYYEDFDI。

V区段通常具有与人生殖细胞系V区段，例如人VH1亚类，的至少80%同一性，或85%、90%、95%或更高的同一性。因此，在一些实施方案中，V区段为人V_H11-02区段，其与生殖细胞系区段VH11-02至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的同一性。在一些实施方案中，V区段与VH11-02有不超过15个残基而且优选不超过10个残基不同。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含V区段，其具有与生殖细胞系区段VH1-02或图1中所示的V_H区的V区段的其中之一至少90%同一性或至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。

本发明的抗体的FR4序列由人JH1、JH3、JH4、JH5或JH6生殖细胞系基因区段或与人生殖细胞系JH区段相比具有高度的氨基酸序列同一性，例如至少90%或95%同一性，或不超过3个，通常不超过2个氨基酸残基不同的序列所提供。在一些实施方案中，J区段来自于人生殖细胞系JH6序列而FR4具有序列WGQGTTVTSS。

在一些实施方案中，V_H区的V区段具有如图1中所示的CDR1和/或CDR2。例如，本发明的抗体具有CDR1，所述CDR1具有序列GYWMN、TYWIS或SYWIN。本发明的抗体可具有CDR2，所述CDR2具有序列DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG或DIYPGSGNTNYDEKFKR。因此，在一些实施方案中，本发明的抗EphA3抗体可具有V_H区CDR3，CDR1序列GYWMN、TYWIS或SYWIN以及CDR2序列DIYPGSGNTNYDEKFQG、DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG、DIYPGSGNTNYAQKFLG或DIYPGSGNTNYDEKFKR，所述CDR3具有序列GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV、SGYYEDFDI。

在一些实施方案中，本发明的抗EphA3抗体可以具有V_H区CDR3、图1中所列出的V_H区的CDR1和/或CDR2，所述CDR3具有序列SGYYEDFDS。

在一些实施方案中，本发明的抗体的V_H区V区段具有如图1中所示的V区段序列。

在典型的实施方案中，本发明的抗体具有图1中所列出的V_H区序列。

III.轻链

本发明的抗EphA3抗体的轻链包含轻链V区，所述轻链V区包含以下成分：

1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人轻链V区段序列；

2)具有序列CDR3的CDRL3区，所述CDR3包含序列X₁X₂YX₃X₄PYT，其中X₁为V或A，X₂为Q、R或G，X₃为A、S或L以及X₄为N或K；和

3)来源于人生殖细胞系J基因区段的FR4。

在一些实施方案中，CDR3具有序列X₁X₂YX₃X₄YPYT，其中X₁为V，X₂为Q，X₃为A以及X₄为N。在一些实施方案中，V_L CDR3为GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT或VQYLNYPYT。

V_L区包含Vλ或VκV区段。图1中提供了支持与互补的V_H区一起结合的Vκ序列的实例。

Vκ区段可为任何亚类，例如经常为VκI亚类。在一些实施方案中，区段具有与人生殖细胞系VκI的至少80%序列同一性，例如与人生殖细胞系VκI L15序列的至少80%同一性。在一些实施方案中，Vκ区段与V在VκI L15序列在不超过5个残基处不同。在其他实施方案中，本发明的抗体的V_L区V区段具有与图1中所示的人V_L区的κV区段序列的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。

本发明的抗体的V_L区的FR4序列由人生殖细胞系J区段所提供，例如或由与人生殖细胞系J区段氨基酸序列具有高度同一性的序列提供。在一些实施方案中，J区段为人生殖细胞系Jκ2序列而抗体的FR4具有序列FGQGTKLEIK。

在一些实施方案中，V_L区的V区段具有如图1所示的CDR1和/或CDR2。因此，本发明的抗体可以具有CDR1序列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG或RASQSISSYLA和/或CDR2序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR或AASTLDS。

在具体的实施方案中，本发明的抗EphA3抗体可具有V_L区CDR3序列以及如图1中所列出的V_L区的V区段其中之一所示的V_L区CDR1和CDR2的组合，所述V_L区CDR3序列包含GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT或VQYLNYPYT。在一些实施方案中，此类抗EphA3抗体可包含为FGQGTKLEIK的V_L区FR4区。因此，本发明的抗EphA3抗体的V_L区可以包括，例如CDR3GQYANYPYT、VQYAKYPYT、AQYANYPYT、VQYSNYPYT、VQYANYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT、VQYLNYPYT；CDR1序列RASQGIISYLA、QASQDISTYLN、RASQEISGYLG或RASQSISSYLA；以及CDR2序列AASSLQS、GASSLQS、AASSLQR或AASTLDS。

在一些实施方案中，本发明的抗体的V_L区V区段具有图1中所示的V区段序列。

在典型的实施方案中，本发明的抗体具有图1中所列出的V_L区序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含SEQ ID NO:11-23中任一项所列出的V_L区与SEQ ID NO:1-10中任一项所列出的V_H区。

IV.EphA3抗体的制备

可利用熟知的测定法评估抗体的亲和力以确定结合活性和亲和力。此类技术包括ELISA测定以及应用质子表面共振或干涉测量法的结合检测。例如利用ForteBio(Mountain View,CA)澳克太特(Octet)生物传感器通过生物层干涉测量法测定亲和力。

本发明的抗体通常与mIIIA4竞争性结合EphA3。本文所述的抗体阻断或与mIIIA4竞争性结合EphA3的能力表明抗体与用于结合EphA3的受mIIIA4约束的表位结合相同的表位或接近的，例如重叠的表位。在其他的实施方案中，本文所述的抗体，例如包含如图1中所提供的图表所示的V_H与V_L组合的抗体，可以用作评估其他的抗体是否竞争性结合EphA3的参照抗体。如果在检测抗体存在的情况下，参照抗体与抗原结合减少了至少30%，通常至少约40%、50%、60%或75%，甚至经常减少了约90%，那么所述检测抗体被认为是竞争性抑制参照抗体的结合。许多测定法可用于评估结合，其包括ELISA以及诸如免疫印迹的其他的测定法。

在典型的实施方案中，抗体为活化抗体。可检测抗体以确定抗体保留了活化EphA3的活性。可以利用包括磷酸化测定的任何数量的终端，或诸如凋亡的间接终端检测活性。

早先已描述了具有接近于人生殖细胞系序列的V区序列的抗体的分离方法(美国专利申请公开第20050255552号和第20060134098号)。抗体库可表达于适当的宿主细胞中，包括哺乳动物细胞、酵母细胞或原核细胞。对一些细胞系统中的表达而言，将信号肽引入到N末端以引导分泌到细胞外基质。抗体可从带有或不带有信号肽的细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)分泌。美国专利申请第20070020685号描述了抗体片段从大肠杆菌无信号分泌的方法。

为生成EphA3结合抗体，例如如图1中所示的本发明的V_H区的其中之一与例如图1中所示的本发明的V_L区组合，并以任一数量形式表达于适当的表达系统中。因此抗体可表达为scFv,Fab,Fab’(包含免疫球蛋白铰链序列),F(ab’)₂(通过两个Fab’分子的铰链序列间形成的二硫键而形成)，整个的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，宿主细胞内部或通过分泌的原核或真核宿主细胞中的融合蛋白。蛋氨酸残基可任选地存在于N末端，例如在无信号表达系统内所产生的多肽中。本文所述的每个V_H区可与每个V_L区配对以生成抗EphA3抗体。

利用任何数量的表达系统可用于产生抗体，其包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统为哺乳动物细胞表达，诸如CHO细胞表达系统。许多此类的系统普遍地购自商业供应方。在其中抗体包含V_H与V_L区的实施方案中，V_H与V_L区可利用单一的载体表达，例如在双顺反子表达单元或在不同的启动子的控制下。在其他的实施方案中，V_H与V_L区可利用分开的载体表达。如本文所述的V_H与V_L区可任选地包含N末端的蛋氨酸。

本发明的抗体可以任一数量形式产生，其包括如Fab,Fab’,F(ab’)₂,scFv或dAB。本发明的抗体也可包括人恒定区。轻链的恒定区可为人κ或λ恒定区。重链恒定区经常为γ链恒定区，例如γ-1,γ-2,γ-3或γ-4恒定区。在其他的实施方案中，抗体可为IgA或IgM。

在本发明的一些实施方案中，抗体的V_L区，例如图1中所列出的V_L区与人κ恒定区(例如SEQ ID NO:25)组合以形成完整的轻链。

在本发明的一些实施方案中，V_H区与人γ-1恒定区组合。任一合适的γ-1同种异型都可以选择。因此，在一些实施方案中，抗体为具有恒定区，例如SEQ ID NO:24的IgG，其具有选自图1中所列出的V_H区序列的V_H。在一些实施方案中，抗体具有选自图1中所列出的V_L区序列的V_L。在具体的实施方案中，抗体具有如SEQ ID NO:25所列出的κ恒定区和如SEQ ID NO:24所列出的重链恒定区，其中重链和轻链的可变区包含来自于图1中所列出的序列的下列组合的其中一个。

在一些实施方案中，例如其中抗体为片段，所述抗体可与另一个分子结合，例如聚乙烯乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白以提供在体内延长的半衰期。抗体片段的聚乙二醇化的实例提供于：Knight等，Platelets15:409,2004(for abciximab);Pedley等,Br.J.Cancer70:1126,1994(for ananti-CEA antibody);Chapman等,Nature Biotech.17:780,1999;以及Humphreys等,Protein Eng.Des.20:227,2007)。

在一些实施方案中，本发明的抗体呈现Fab’或F(ab’)₂的形式。

全长的轻链由V_L区与人κ或λ恒定区的融合所产生。任何一个恒定区都可以用于任一轻链；然而，在典型的实施方案中，κ恒定区与Vκ可变区组合使用而λ恒定区与Vλ可变区一起使用。

Fab’的重链为由本发明的V_H区与人重链恒定区序列、第一恒定功能区(CH1)及铰链区融合所产生的Fd’片段。重链恒定区序列可来自于任一免疫球蛋白类别，但是经常来自于IgG，而且可来自于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。本发明的Fab’抗体也可为杂合的序列，例如铰链序列可来自于一种免疫球蛋白亚类而CH1功能区可来自于不同的亚类。

本发明中应用的抗体可以呈现许多的形式。在一些实施方案中，抗体可以包括Fc区，例如人Fc区。例如此类抗体包括结合EphA3的IgG抗体和具有活性同种型的IgG抗体。在一些实施方案中，抗体可以为活性片段(例如它可以使EphA3成为二聚体)或诸如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv或单域抗体(“dAb”)的抗体衍生物。例如，在一些实施方案中，抗体可以为F(ab’)₂。本发明中应用的抗体的其他的示例性实施方案包括活化的纳米抗体或活化的骆驼抗体。可通过本领域中技术人员熟知的方法额外地重组基因改造此类抗体。如上所述，可以利用已知的技术生产此类抗体。本领域中技术人员应理解，在一些实施方案中，当抗体以例如Fv或Fab格式的单价的形式存在时，所述抗体可用作多价的抗体，诸如三价的或四价的抗体。形成多价的抗体的方法是已知的(参见例如King等,Cancer Res.54:6176-6185,1994)。

在许多的实施方案中，本发明中使用的抗体具有Fc恒定区，所述Fc恒定区具有效应功能，例如结合免疫效应细胞上存在的Fc受体。示例性“效应功能”包括C1q结合，补体依赖的细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，吞噬作用，细胞表面受体的下调(例如B细胞受体)等。此类效应功能通常需要Fc区与结合功能区(例如抗体的可变功能区)组合而且可以利用已知的测定法进行评估(参见例如下文所引用的参考文献)。

具有活性同种型而且与诸如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞及NK细胞的效应细胞上的Fc受体结合的抗EphA3抗体可以通过ADCC诱导细胞死亡。

Fc区可来自于天然形成的IgG1或其他的活性同种型，包括IgG3、IgM、IgA和IgE。“活性同种型”包括其中Fc区包含修饰以增加与Fc受体结合或相反改进抗体效价的抗体。此类Fc恒定区可包含增加与Fc受体结合的修饰，诸如突变、糖基化水平的改变等。存在着许多本领域中已知的修饰Fc区的方法。例如美国专利申请公开第20060039904号描述了增强效应功能的Fc受体的变体，其包括修饰与一个或多个Fc配体(例如FcγR、C1q)的结合亲和力。额外地，此类Fc变体改变了抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。其他的Fc变体包括以下所公开的那些：Ghetie等,Nat Biotech.15:637-40,1997;Duncan等,Nature332:563-564,1988;Lund等,J.Immunol147:2657-2662,1991;Lund等,Mo I Immunol29:53-59,1992;Alegre等,Transplantation57:1537-1543,1994;Hutchins等,Proc Natl.Acad Sci USA92:11980-11984,1995;Jefferis等,Immunol Lett.44:111-117,1995;Lund等,FASEB J9:115-119,1995;Jefferis等,Immunol Lett54:101-104,1996;Lund等,JImmunol157:4963-4969,1996;Armour等,Eur J Immunol29:2613-2624,1999;Idusogie等,J Immunol164:4178-4184,200;Reddy等,J Immunol164:1925-1933,2000;Xu等,Cell Immunol200:16-26,2000;Idusogie等,JImmunol166:2571-2575,2001;Shields等,J Biol Chem276:6591-6604,2001;Jefferis等,Immunol Lett82:57-65.2002;Presta等,Biochem SocTrans30:487-490,2002;Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005-4010,2006;美国专利申请第5,624,821;5,885,573;5,677,425;6,165,745;6,277,375;5,869,046;6,121,022;5,624,821;5,648,260;6,194,551;6,737,056;6,821,505;6,277,375;7,335,742;和7,317,091号;以及PCT公开WO94/2935;WO99/58572;WO00/42072;WO02/060919和WO04/029207。

糖基化是翻译后修饰的一种形式，借助其碳水化合物(糖类)与大分子酶解地连接以产生聚糖。在本发明的背景下，碳水化合物通常经由一个或多个N-连接键(通过天冬酰胺或精氨酸侧链的氮)连接到抗体Fc区。然而，O-连接键(经由羟基氧或丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸侧链)也是可能的。通常IgG抗体具有位于CH2功能区Asn297残基上的保守的N-连接的糖基化位点，而一些类别和亚类也具有O-连接的糖类，经常位于铰链区，例如一些物种的IgD和IgA。糖类通常为复合的、高甘露糖的支链糖；在N-连接键的情况下，直接连接到氨基酸侧链氮的糖通常为N-乙酰基葡萄糖胺。

在一些实施方案中，Fc区的糖基化可以是修饰的。例如，修饰可以是去糖基化，例如通过改变抗体序列内一个或多个糖基化的位点。此类方法在美国专利申请第5,714,350和第6,350,861号中进行了进一步详细地描述。也可制造具有改变类型的糖基化的Fc区，诸如具有数量减少的岩藻糖残基的低岩藻糖基化的Fc变体，或缺少岩藻糖残基的去岩藻糖基化的Fc变体，或具有增加的二等分的GlcNAc结构的Fc变体。例如可通过在带有改变的糖基化细胞器的宿主细胞内表达抗体实现此类碳水化合物修饰。带有改变的糖基化细胞器的细胞，其包括鼠骨髓瘤细胞以及酵母和植物，已在本领域中进行了描述并可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体并因此产生带有改变的糖基化的抗体。

Umana等,Nat.Biotechnol17:176-180,1999描述了导致10倍ADCC的二等分的GlcNac。Umana记录了此类二等分的分子导致较少的岩藻糖基化。Davies等,Biotechnol.Bioeng.74:288-294,2001描述了导致增加的抗CD20抗体的ADCC的带有插入酶β1-4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(其引起了二等分的GlcNac结构)的CHO细胞。美国专利申请第6,602,684号(Umana)描述了基因工程的细胞以产生二等分的GlcNac糖蛋白。

Shields等,J Biol Chem277:26733-26740,2002提供了减少抗体制剂的岩藻糖的方法的实例，其描述了岩藻糖基化缺陷的CHO细胞(Led3)以产生IgG1并进一步描述了岩藻糖缺陷的IgG1与人FcγRIIIA的结合被改进达到50倍且增加了ADCC。另外，Shinkawa等,J Biol Chem278:3466-3473,2003比较了YB2/0和CHO细胞所产生的IgG。YB2/0细胞具有减少的岩藻糖基化和增加的二等分的GlcNac含量。Niwa等,Clinc.Cancer Res.l-:6248-6255,2004比较了抗CD20抗体与YB2/0细胞中制造的抗体(低岩藻糖基化)并且在后者中观察到增强的ADCC。例如在Kanda等,Glycobiology17:104-118,2006中提供了产生去岩藻糖基化的抗体的技术的实例。美国专利申请第6,946,292号(Kanda)描述了岩藻糖转移酶敲除的细胞以产生去岩藻糖基化的抗体。美国专利申请第7,214,775号和WO00/61739描述了其中100%抗体为去岩藻糖基化的抗体制剂。

其他的修饰糖基化的技术也是已知的，参见例如美国专利申请公开第20070248600号;第20070178551号(应用基因工程的较低级的真核细胞(酵母)以产生“人的”糖基化结构的GlycoFi技术方法);第20080060092号(应用基因工程的植物以产生“人的”糖基化结构的Biolex技术方法);第20060253928号(其也描述了植物的基因改造以产生“人的”抗体)。

用于减少岩藻糖的额外的技术包括ProBioGen技术(von Horsten等,Glycobiology,(advance access publication July23,2010)；Potelligent^TM技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.);以及GlycoMAb^TM糖基化基因改造技术(GLYCART biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。

抗体的N-连接的寡糖含量可通过本领域中已知的方法进行分析。以下是此类方法的一个实例：抗体受到酶N-糖苷酶F(Roche;TaKaRa)的消化。通过带有阳离子模式的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)分析释放的碳水化合物(Papac等,Glycobiol.8:445-454,1998)。然后通过改性高效阴离子交换色谱法(HPAEC)表征单糖组合物(Shinkawa等,J.Biol.Chem.278:3466-3473,2003)。

在本发明的一些实施方案中，额外地基因改造抗体以降低免疫原性，例如从而使得抗体适用于重复给药。生成具有降低的免疫原性的抗体的方法包括人源化、人源基因改造程序以及修饰技术，诸如去免疫原性，其中抗体被进一步地基因改造，例如，在一个或多个骨架区内，以去除T细胞表位。

在一些实施方案中，抗体以可以活化存在于例如血管生成源性骨髓前体细胞的EphA3表达细胞表面上的EphA3或可以通过ADCC杀死此类细胞的形式呈现。因此，在一些实施方案中，抗体是二聚化的。在其他的实施方案中，抗体可以具有活性同种型的单体形式呈现。在一些实施方案中，抗体以多价的形式，例如三价的或四价的形式呈现，其可以交联EphA3。

V.用于治疗其中EphA3为靶标的疾病的抗EphA3抗体的给予

本发明也提供了治疗患有期望杀死EphA3表达细胞疾病的患者的方法。在一些实施方案中，此类疾病可能是肿瘤疾病。因此，在一方面，本发明提供了利用本发明的抗体治疗肿瘤疾病的方法，其中该方法包括给予患者(其有肿瘤)本发明的抗EphA3抗体以抑制肿瘤生长。可以治疗的肿瘤包括乳腺、肺、结肠、胃、肝脏、肾脏、卵巢、食管、前列腺以及其他的肿瘤。因此用本发明的抗体治疗的实体肿瘤可以使乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑色素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤的肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌以及肾母细胞瘤(Wilm's tumor)。与瘢痣病和水肿(诸如其与脑肿瘤有关)有关的异常的血管增生也可用本发明的抗体治疗。

在一些实施方案中，给予肿瘤细胞表面上表达EphA3的患者抗EphA3抗体。在一些实施方案中，给予肿瘤中血管内皮上表达EphA3的患者抗EphA3。在一些实施方案中，患者可在肿瘤细胞表面和内皮上表达EphA3。在一些实施方案中，例如抗体以WO/2008/112192中所述的格式呈现。

在一些实施方案中，利用本发明的抗体治疗非肿瘤性状态。非肿瘤性状态选自以下组成：不期望的或异常的肥大，关节炎，类风湿性关节炎(RA)，牛皮癣，牛皮癣斑块，肉状瘤病，动脉粥样硬化，动脉粥样硬化斑块，来源于心肌梗塞的水肿，糖尿病和其他的增生性视网膜病变，晶状体后纤维增生，新生血管性青光眼，年龄相关的黄斑变性，糖尿病引起的黄斑部水肿，角膜新生血管，角膜移植新生血管形成，角膜移植排斥，视网膜的/脉络膜的新生血管形成，虹膜的新生血管形成，眼部新生血管性疾病，血管再狭窄，动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，血管纤维瘤，甲状腺增生(包括Grave's病)，角膜和其他组织的移植，慢性炎症，肺炎，急性肺损伤/ARDS，败血症，原发性肺动脉高压，恶性肺积液，脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部外伤/创伤)，滑膜炎症，RA中形成的血管翳，骨化性肌炎，肥大骨形成，骨关节炎(OA)，顽固性腹水，多囊卵巢疾病，子宫内膜异位症，流体疾病的第三间隔(胰腺炎，筋膜室综合征，烧伤，肠道疾病)，子宫肌瘤，早产，诸如IBD(克隆氏疾病Crohn'sdisease和溃疡性结肠炎)的慢性炎症，肾脏同种异体移植排斥，炎性肠道疾病，肾病综合征，不期望的或异常的组织块生长(非癌症)，肥胖，脂肪组织块生长，血友病性关节，化脓性肉芽肿晶状体后纤维增生，硬皮病，沙眼，血管粘连，滑膜炎，皮炎，子痫前期，腹水，心包积液以及胸腔积液。

在一些实施方案中，给予患有骨髓增生性疾病的患者本发明的抗体。在一些实施方案中，骨髓增生性疾病为急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，骨髓增生异常综合征，真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)或特发性骨髓纤维变性(IM)。在一些实施方案中，本发明的抗EphA3抗体与一个或多个额外的治疗剂联合使用以治疗患有慢性骨髓性白血病的患者，其中白血病的干细胞来自患者表达EphA3。此类治疗剂包括各种化学治疗剂和甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)()。

抗体可单独地或与其他的治疗联合给药以治疗感兴趣的疾病。在一些实施方案中，抗EphA3抗体与Bv8拮抗剂，例如Bv8抗体拮抗剂联合给药。Bv8拮抗剂是已知的(参见例如WO2009039337和本文所引用的涉及Bv8拮抗剂的参考文献)。例如，Bv8拮抗剂包括特异性结合天然序列Bv8多肽或天然序列Bv8受体(PKR-I/EG-VEGFRl或PKR-2/EG-VEGFR2)多肽的抗体和抗体片段。在一些实施方案中，也可用额外的治疗剂治疗患者，包括血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，例如抗-VEGF抗体拮抗剂，以及其他的治疗剂，其实例额外地描述于下文中。

在一些实施方案中，给予早先已用VEGF拮抗剂，例如抗-VEGF抗体拮抗剂治疗的患者抗EphA3抗体。在一些实施方案中，用VEGF拮抗剂治疗肿瘤是难治的。在一些实施方案中，给予患有早期肿瘤，例如I期，II期或III期肿瘤的患者抗EphA3抗体。

本文所用的用VEGF拮抗剂，例如VEGF抗体拮抗剂治疗被认为是难治的或者患有用VEGF拮抗剂治疗难治的肿瘤的患者指的是患者响应治疗但有副作用，产生耐药性，对治疗不响应，不能令人满意地响应治疗等。因此，在此类患者或来自于此类患者的肿瘤中，肿瘤细胞的数量不能显著地减少，或有所增加，或肿瘤的大小不能显著地减小，或有所增大，或在尺寸大小或癌细胞数量方面没有进一步的减少。在体内或体外通过本领域中任何已知的用于测定癌细胞治疗有效性的方法进行对治疗难治的的患者的检测。同样地，患有非肿瘤性状态的患者，其对用VEGF拮抗剂，例如VEGF抗体治疗难治的，在本发明的背景下指的是不能令人满意地响应用VEGF拮抗剂的治疗，例如患者有副作用，产生耐药性，或不能显示出状态治疗指标的降低。

本发明的方法包含利用适用于疾病治疗的剂量方案，以治疗上有效的量给予患者作为药物组合物的抗EphA3抗体。所述组合物可配制用于各种各样的药物递送系统中使用。一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体也包括在适当制剂的组合物中。合适的用于在本发明中使用的制剂可在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Philadelphia,PA.Lippincott Williams & Wilkins,2005(雷明顿的药物科学与实践，21版，费城，宾夕法尼亚州。利平科特.威廉斯&威尔金斯，2005)中找到。

抗EphA3抗体可以适用于注射的溶液形式提供给患者，诸如用于注射的无菌的等渗的水溶液。抗体以适当的浓度溶解于或悬浮于可接受的载体中。在一些实施方案中，载体是水性的，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。按接近于生理学状态的要求，组合物可包含附加的药物物质，诸如pH调整剂、缓冲剂以及张力调整剂等。

以足够治愈或至少部分地阻止疾病或疾病的症状及其并发症的量给予患者，例如给予患有肿瘤或非肿瘤性状态的患者本发明的药物组合物。把足以实现这些目标的量定义为“治疗上有效的剂量”。通过监测患者对治疗的反应来确定治疗上有效的剂量。表明治疗上有效的剂量的典型基准包括患者疾病症状的改善。在该使用中有效的量将取决于疾病的严重程度和患者健康的一般状态，其包括诸如年龄、体重、性别、给药途径等其他的因素。单一的或多重的抗体给药可取决于剂量和频率，这两者需按照要求以及患者的耐受。无论如何，所述的方法提供了足够数量的抗EphA3抗体以有效地治疗患者。

通过注射或输液，凭借任一合适的途径给予抗体，该途径其包括但不限于静脉内的、皮下的、肌肉内的或腹膜内的途径。在一些实施方案中，抗体可通过吹入法给药。在一示例性实施方案中，抗体以10mg/ml储存在无菌的等渗的盐水溶液中以用于在4℃下注射并在给予患者之前于100ml或200ml的0.9%氯化钠中稀释以用于注射。通过静脉内输液，在整个1小时的过程中，以0.2-10mg/kg的剂量给予抗体。在其他的实施方案中，通过静脉内输液，在整个15分钟至2个小时的过程中，给予抗体。仍然在其他的实施方案中，给药程序为经由皮下弹丸注射。

为选择抗体的剂量以便提供对患者有效的治疗并且在小于0.1mg/kg体重-约25mg/kg体重的范围内或在1mg-2g/患者的范围内。优选地剂量为在1-10mg/kg或大约50mg-1000mg/患者的范围内。剂量可以适当的频率重复，其可在每天一次至每三个月一次的范围内，这取决于抗体的药代动力学(例如抗体在循环中的半衰期)和药效反应(例如抗体治疗效果的持续时间)。在一些实施方案中，体内半衰期为约7天-约25天，以每周1次-每3个月一次的频率重复抗体剂量。在其他的实施方案中，大约每月1次给予抗体。

本发明的V_H区和/或V_L区也可用于诊断目的。例如，V_H区和/或V_L区可用于临床分析，诸如检测患者来源的细胞上EphA3水平。例如本发明的V_H区和/或V_L区也可用于产生抗Id抗体。

实施例

方法学

鼠V区的亚克隆

来源于鼠单克隆的mIIIA4的V区DNA由马丁.拉克曼博士(Dr.Martin Lackmann)(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Monash University,Victoria,Australia)(生物化学与分子生物学系，莫纳什大学，维多利亚州，澳大利亚)所提供。PCR用于扩增V重链区和Vκ区的V基因以及并入适用于克隆到期望的载体中的限制性内切酶位点。V区被克隆为Fab片段并表达于大肠杆菌中。这一Fab用于探测EphA3-Fc抗原的结合，因此在这些实施例中被称为参照序列FA4。

抗体纯化

Fab片段通过来自大肠杆菌的分泌而表达。细胞生长于2xYT介质中直至OD₆₀₀为0.6。利用IPTG在33℃下诱导表达3小时。从细胞周质部分获得组装的Fabs并利用链球菌G蛋白(Streptococcal Protein G)，根据标准的方法，通过亲和色谱法纯化(HiTrap Protein G HP柱；通用电气医疗集团(GE Healthcare))。在pH2.0缓冲液中洗脱Fabs后，就将pH调至7.0并用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)透析(PBS没有钙和镁)。

ELISA

通常将50ng抗原结合到96孔微量滴定平板并在4℃下过夜孵育。33℃下用含5%乳的PBS溶液封闭平板1小时。将来自大肠杆菌的诱导培养基(50μl)表达的每个人基因工程的Fab或最佳化的参照Fab FA106添加至每个孔。33℃下孵育1小时后，用PBS+0.1%吐温20(Tween20)(PBST)洗涤平板3次，将50μl HRP标记的抗人κ链(Sigma;在PBST中稀释至0.1ng/ml)添加至每个孔，而且在33℃下孵育平板40分钟。用PBST洗涤平板3次，用PBS洗涤平板1次。将100μl底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)添加至每个孔并在室温下孵育平板约5分钟。将100μl0.2N硫酸添加至每个孔以停止反应。通过分光光度测定法在450nm处读取反应。

为检测与Eph家族成员的结合，从研发系统有限公司(R&D SystemsInc)获取重组的人Eph细胞外的(ec)结构域：EphAl-Fc融合蛋白，EphA2ec结构域，EphA5ec结构域，EphB4ec结构域以及EphB6Fc融合蛋白。在37℃下用100ng Eph蛋白包被ELISA孔1小时。用PBST洗涤1次后，在37℃下用含5%乳的PBST封闭孔1小时。洗涤孔1次并将两倍梯度稀释的候选人基因工程的抗体添加至每组包被的Eph蛋白。1小时后，在PBST中洗涤孔3次并将50μl HRP标记的抗人κ链(Sigma;在PBST中稀释至0.1ng/ml)添加至每个孔。孵育平板45分钟，用PBST洗涤3次，用PBS洗涤1次，并将100μl TMB添加至每个孔。通过添加0.2N硫酸停止反应并通过450nm处吸光度测量结合。

集落转移结合测定(CLBA)

利用硝酸纤维素滤膜包被的抗原如(美国专利申请公开第20050255552号和第20060134098号)所述的进行Fab片段的人源改造库的筛选。

亲和力测量

利用质子表面共振分析(spr;Biacore T100)在生物传感器工具有限公司(Biosensor Tools Inc)分析Fab片段的亲和力动力学。以三个不同Fab浓度测定的结合常数和离散常数计算亲和力。

IgGs的构建

构建嵌合的IIIA4IgG以包含人IgG1恒定区和来自最初的鼠IIIA4抗体的可变区。利用PCR扩增来源于由Martin Lackmann提供的鼠IIIA4DNA的重链和轻链并引入用于克隆的限制性位点。将重链可变区克隆至到位于UCOE序列下游的CMV启动子所表达的表达完整的IgG1重链的载体中。质粒包含在哺乳动物细胞中用于选择的Neo基因和在大肠杆菌中用于质粒产生的Amp基因。同样地，将轻链可变区克隆至UCOE序列下游的CMV启动子所表达的表达人κ轻链恒定区的载体中。质粒包含在哺乳动物细胞中用于潮霉素选择的基因和在大肠杆菌中用于产生的Amp基因。类似地构建基因工程的抗体IgG重链和轻链的载体，除了用于可变区的DNA获自上文所述的大肠杆菌表达载体并且重链表达载体包含嘌呤霉素抗性基因而不是新霉素。通过利用Fugene6试剂(Promega)共转染重链和轻链构建体，将人基因工程的抗体IgG和嵌合的IIIA4IgG表达于修饰的CHO细胞系中，。

流式细胞术

通常通过以3000每分钟转数(rpm)离心3分钟采集3×10⁶个SKmel28、LnCAP和B16-F10细胞。去除介质并在4℃下用含2%BSA的PBS封闭细胞30分钟，随后用10μg/ml鼠IgG在4℃下再封闭30分钟。细胞团成丸状，再悬浮于1.5ml PBS中，将其分成500μl等分试样。在4℃下，每个等分试样单独地用5μg/ml对照的IgG、人基因工程的IgG或嵌合的IIIA4IgG做探针探测45分钟。样品用PBS洗涤1次，并添加藻红蛋白标记的抗人IgG。45分钟后，洗涤细胞1次，再悬浮于PBS中，利用FACSCaliber流式细胞仪，通过流式细胞术进行分析。就在分析前添加碘化丙啶以除外死细胞。

实施例1.基因工程的人抗EphA3抗体的鉴定

鼠的和参照的V区氨基酸序列

鼠的(mIIIA4)和参照(FA4)V区序列显示如下。CDR序列是下划线的。

mIIIA4和FA4Vh:

EVKLEESGAELVKPGSSVKLSCKASGYNFTSYWINWVRLRPGQGLEWIGDIYPGSGNTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDSALYYCTRSGYYEDFDSWGQGTTLIVSS

mIIIA4和FA4Vk:

DIVLTQTPSSLSASLEERVSLTCRASQEISGYLGWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKKFSGNRSGSEYSLTISSLESEDFADYYCVOYANYP YTFGGGTKLEIK

FabA4具有来自于与人恒定区融合的mIIIA4的完整鼠V区并从大肠杆菌中纯化。与抗原结合的Fab片段的稀释ELISA产生取决于抗体浓度结合曲线。

除了参照Fab(FA4)以外，构建佳化的参照Fab(FA106)。将FA4中几个骨架氨基酸残基变成佳化的参照Fab FA106中的人生殖细胞系。以下提供了佳化的参照Fab的V区序列。改变成人生殖细胞系的残基显示为粗体字。CDR序列是下划线的。

FA106Vh:

EVKLEESGAELVKPGSSVKLSCKASGYNFTSYWINWVRLRPGQGLEWIGDIYPGSGNTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDTAVYYCARSGYYEDFDSWGQGTTVTVSS

FA106Vk:

DIVLTQTPSSLSASLEERVSLTCRASQEISGYLGWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKKFSGNRSGSEYSLTISSLESEDFATYYCVQYANYP YTFGQGTKLEI

文库构建和V区盒式结构

从连接到含有BSD和人生殖细胞系J区段序列的独特的CDR3-FR4区的人V区段库序列构建抗原表位集中的文库。将“全长的”Vh(Vh1和Vh5)和Vκ(Vκ1)文库用作构建“盒式结构的”文库的基础，其中只有部分的鼠V区段首先被人序列文库取代。构建针对Vh和Vκ链的几种类型的盒式结构的“文库”。通过与骨架区2内重叠共同的序列的桥式PCR制备针对V重链和Vκ链的盒式结构。用这种方法构建针对人Vh1和Vh5亚类的“前端的”人盒式结构文库以及针对人Vh1的“中间的”人盒式文库。构建针对Vκ1亚类的“前端的”和“中间的”盒式结构文库。

额外地，构建由Vh CDR2-FR3组成的盒式结构文库。示意图显示于图2中。参照的CDR2的前4个残基(方框的)由5’PCR引物所编码。而且mIIIA4CDR2和人生殖细胞系Vh1-58CDR2中下划线的氨基酸残基在正向引物的配对组合中是不同的(通过划线以上和以下的氨基酸残基所显示)。3’PCR引物与人生殖细胞系Vh1FR3是互补的。引物用于扩增及添加Hu Vhl FR3文库(来源于脾脏mRNA)至基因工程的CDR2文库。连续的桥式PCR反应用于附加“前端”及CDR3-FR4盒式结构以构建功能性V区。

通过集落转移结合测定鉴定支持结合抗原的人Vh或Vκ盒式结构并根据ELISA所测定的亲和力确定等级次序。Vh筛选鉴定支持EphA3-Fc重组融合蛋白抗原结合的“前端”、“中间”和CDR2/FR3盒式结构。Vκ筛选鉴定支持抗原结合的“前端”和“中间”盒式结构。每条链的功能性盒式结构重新结合以构建完整地基因工程的、高亲和力的结合抗原的Fab。

鉴定高亲和力，基因工程的Fab库后，建立CDR3亲和力成熟文库。利用简并PCR引物使一组基因工程的Fab克隆的通用CDR3BSD序列突变以生成文库。利用集落转移和ELISA测定筛选这些突变的文库。用ELISA针对亲和力对选择的Fabs排序。鉴定支持相似的抗原亲和力或当与FA106Fab比较时改进的抗原亲和力的突变。支持或改进抗原结合的重链和轻链CDR3突变辅助明确每个CDR的BSD区。

参照的Fab序列与人基因工程的Fab序列比对

将比对的鼠参照V区段和两个基因工程的Fabs氨基酸序列与最靠近的单一的人生殖细胞系V基因、Vhl-02或Vκ1L15比较。针对人基因工程的Fab Vh区的FR4来自于人生殖细胞系JH6并且具有序列WGQGTTVTVSS。针对人基因工程的Fab Vκ区的FR4来自于人生殖细胞系Jκ2并且具有序列FGQGTKLEIK。

基因工程的Fabs的Vh区和Vκ区都与人生殖细胞系氨基酸序列具有高度的同源性。示例性同源性显示于表1中。

表1.针对两个基因工程的V区的人生殖细胞系序列的同一性的百分比：所有的百分比代表与贯穿V区的单一的人生殖细胞系序列(除CDR3BSD序列之外)的同一性。

人基因工程的Fab	Vh对Vh-02	Vκ对Vκ1L15
			1	93%	95%
2	91%	95%

实施例2.基因工程的抗体的结合动力学

基因工程的Fabs分离于集落转移结合测定并通过结合抗原的ELISA确认亲和力。纯化结合抗原的ELISA中带有强阳性信号的基因工程的Fab克隆并通过动力学与最佳化的参照Fab FA106比较而进一步地表征。

利用Biacore分析两个基因工程的Fabs和参照的FabFA106的结合动力学。将这三个Fabs从初始的浓度500nM稀释至100nM并进一步地利用0.005%Tween-20的PBS(pH7.4)和0.1mg/ml BSA3倍梯度稀释进行检测。五种浓度的每一个在三个不同的密度表面上检测三次。在25℃下进行测定。来自每一表面的反应数据适于1:1相互作用模式。计算的结合常数和离散常数显示于表2中。基因工程的Fab克隆1和2以及参照的克隆FA106都显示出对抗原的低纳米分子的亲和力。

表2.25℃下检测的人基因工程的Fab结合常数

括弧中的数字代表基于来自三种不同的密度表面的数据的最后报告的数字的标准误差。左侧列中的术语“低”、“中”和“高”指的是芯片密度。

人基因工程的Fab1表达为哺乳动物细胞中的IgG并从培养上清液中纯化。通过木瓜蛋白酶消化而产生的Fab片段用于单价的结合亲和力的分析。利用抗生物素蛋白链菌素(Streptavidin)芯片所捕获的生物素化的EphA3变体在Biacore3000上测量Fab与人和鼠EphA3-Fc的结合。在HBSP流动的缓冲液中，用3×稀释液将Fab从50nM稀释至0.62nM。结果用空的参照细胞和多倍的HBSP缓冲注射液双重空白对照。假定1:1相互作用进行Biacore数据的Global fit分析。结合动力学参数显示于表3中。数据表明哺乳动物细胞所产生的人基因工程的Fab1以高亲和力结合人和鼠EphA3。

表3.基因工程的Fab1以可比较的亲和力结合人和鼠EphA3

分析物	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	K_D(pM)
				人EphA3-Fc	2.2×10⁶	2.0×10^-3	930
鼠EphA3-Fc	2.3×10⁶	1.8×10^-3	800

利用Biacore3000装置和整体拟合(global fit)分析通过表面质子共振分析来分析Fab1与固定化的鼠和人EphA3-Fc融合蛋白的结合。

K_a=结合常数；K_d=离散常数；K_D=总的亲和力

结合和特异性

构建全长的抗体(IgG1K)，由CHO细胞表达并通过蛋白A亲和色谱法纯化。用EphA3-Fc包被ELISA平板并比较与cIIIA4IgG、示例性基因工程的IgG以及对照的IgG1的结合(图3)。这一测定中基因工程的IgG的EC₅₀大约为原始嵌合抗体的EC₅₀的三分之一。

EphA3为结合Ephrin配体的Eph受体家族的成员。该家族中最有同源性的成员为EphA受体，它的细胞外结构域在39%-62%的EphA3同一性内改变。

为确认示例性基因工程的IgG的特异性，评估与三个EphA蛋白和两个远族相关EphB蛋白的结合(见图4)。EphA5与EphA3的同源性为61%而且代表与EphA3最有同源性的家族成员的其中一个。基因工程的抗体特异地结合EphA3；没有观察到与EphAl、EphA2或EphA5结合。也没有检测到与检测的两个EphB受体(EphB4和EphB6)中任何一个的结合。

也检测示例性基因工程的抗体与活细胞的表面上所表达EphA3的结合。使用三种已知的表达EphA3的肿瘤细胞系：鼠黑色素瘤(B16)、人黑色素瘤(SKmel28)和前列腺癌细胞系(LnCAP)。用基因工程的IgG、嵌合的IIIA4或对照的抗体作探针探测活细胞。利用流式细胞术通过藻红蛋白结合的抗人IgG检测结合抗体(图5)。观察到基因工程的IgG和嵌合的IIIA4与B16和SKmel28细胞的强的结合。IgGs也结合LnCAP。

实施例3.评估Fab和F(ab’)₂片段诱导凋亡的能力

通过木瓜蛋白酶对本发明的基因工程的IgG1抗体(Ab1)或对照的人IgG1抗体的消化而产生Fab片段。37℃下将1mg抗体与0.01mg木瓜蛋白酶(Roche#10108014001)在100mM pH5.0醋酸钠中孵育18小时。通过木瓜蛋白酶消化而产生F(ab’)2。37℃下将5mg IgG与250μl固定化的木瓜蛋白酶琼脂糖浆(Pierce#20343)在100mM pH4.0醋酸钠中孵育18小时。一旦裂解，将这两种消化液与蛋白A树脂孵育30分钟以去除Fc片段并收集上清液。将Fab和F(ab’)₂片段透析至50mM pH6.0琥珀酸钠、145mM Nacl和0.05%Tween80。

为评估Ab1的Fab和F(ab’)₂片段诱导分离自白血病患者的原代细胞凋亡的能力，将细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于96孔“U”底平板的0.1ml培养介质中(带有10%胎牛血清的RPMI1640)。添加抗体或抗体片段至最终浓度10μg/ml并在37℃、5%CO₂下将平板于组织-培养孵育箱孵育24小时。作为凋亡诱导的阳性对照，将单独的细胞样品与喜树碱(10μΜ;Calbiochem)一起孵育。在孵育的最后，收获细胞并通过以1000rpm离心5分钟洗涤随后在包含10μl FITC-结合的膜联蛋白V(Annexin V)(BDPharmingen)的0.1ml缓冲液中在冰上孵育30分钟。通过离心洗涤细胞1次并重新悬浮在包含1:1000稀释的碘化丙啶的流式细胞术缓冲液。通过流式细胞术鉴定经历凋亡的Annexin V染色的细胞。

表4.由Ab1抗体和抗体片段诱导的凋亡

处理	凋亡(%)实验1	凋亡(%)实验2
			基因工程的Ab1 IgG	82.0	85
hIgG1对照	1.8	-
			F(ab’)₂	16.3	23
F(ab’)₂对照	1.3	0.8
			基因工程的Ab1Fab	1.1	1.1
Fab对照	0	0
			喜树碱	91.0	97.0

表4中的结果表明示例性抗体(Ab1)F(ab’)₂片段诱导表达EphA3的原代白血病细胞凋亡的直接诱导。利用10μl/ml(Ab1)F(ab’)₂在24小时内杀死大约20%靶细胞。相比之下，单价的Fab片段不能诱导可检测的凋亡水平，这表明EphA3的二聚化对于在这些细胞中诱导显著的凋亡水平是必需而且充分的，而对于凋亡诱导并不要求Fc效应功能。

实施例4.去岩藻糖基化的抗体的评估

通过在不同的CHO细胞系表达生成两种糖基化形式的抗体1。一种形式(岩藻糖基化的抗体1)具有糖基化模式，典型的包含α-1,6岩藻糖的IgG1κ(f-同种异型)治疗抗体。另一种形式(特指的去岩藻糖的抗体1)产生于包含α-1,6岩藻糖基转移酶基因FUT8的纯合缺失以阻止α-1,6岩藻糖的添加的CHO细胞系，并因此是去岩藻糖基化的。在NK细胞介导的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)测定中比较这些抗体制剂。

将不同浓度的抗EphA3抗体制剂与白血病原代靶细胞和正常的人PBMC效应细胞(血沉棕黄层来自于斯坦福大学(Stanford University)血库)一起孵育。用来自于急性骨髓性白血病(AML)患者的1×10⁴个靶细胞和1×10⁶个正常的PBMC效应细胞(效应细胞：靶细胞的比率为100:1)检测0.0001μg/mL-10.0μg/mL的岩藻糖基化的抗体1和去岩藻糖基化的抗体1。37℃、5%CO₂下孵育16小时后，测量LDH的释放，与洗涤溶解的细胞的LDH比较以确定细胞毒性的百分比(利用Promega Cytotox96试剂盒)。

与岩藻糖基化的抗体1比较，去岩藻糖基化的抗体1显示提高的抗EphA3阳性靶细胞的ADCC活性(图6)。

尽管为了理解清晰，已借助例证和实例相当详细地描述了上述发明，但显然，根据本发明的教导，对本领域普通技术人员而言，在没有背离所附加的权利要求的精神和范围的情况下，可对本发明做某些改变和修饰。

本说明书中所提到的所有出版物、登录号、专利以及专利申请都通过引用的方式并入本文，如同每篇被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。

本发明的抗EphA3抗体的示例性V_H区序列：

SEQ ID NO:l

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SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:3

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SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

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SEQ ID NO:6

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SEQ ID NO:7

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SEQ ID NO:8

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SEQ ID NO:9

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SEQ ID NO:10

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本发明的抗EphA3抗体的示例性V_L区序列：

SEQ ID NO:11

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SEQ ID NO:12

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SEQ ID NO:13

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SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:15

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SEQ ID NO:16

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SEQ ID NO:17

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SEQ ID NO:18

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SEQ ID NO:19

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SEQ ID NO:20

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SEQ ID NO:21

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SEQ ID NO:22

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SEQ ID NO:23

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SEQ ID NO:24:示例性的重链恒定区

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:25:示例性的轻链恒定区

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

示例性的本发明的抗体(重链和轻链序列):

SEQ ID NO:26(重链，包含SEQ ID NO:26/27的抗体)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMNWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGNTNYDEKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSGYYEEFDSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:27(轻链，包含SEQ ID NO:26/27的抗体)

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SEQ ID NO:28(重链，包含SEQ ID NO:28/29的抗体)

QVQLVQSGAEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTGYWMNWVRQASGQGLEWMGDIYPGSGNTNYDEKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSGVYEDFDSWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:29(轻链，包含SEQ ID NO:28/29的抗体)

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SEQ ID NO:30(重链，包含SEQ ID NO:30/31的抗体)

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SEQ ID NO:31(轻链，包含SEQ ID NO:30/31的抗体)

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SEQ ID NO:32(重链，包含SEQ ID NO:32/33的抗体)

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SEQ ID NO:33(轻链，包含SEQ ID NO:32/33的抗体)

SEQ ID NO:34(重链，包含SEQ ID NO:34/35的抗体)

SEQ ID NO:35(轻链，包含SEQ ID NO:34/35的抗体)

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SEQ ID NO:36(重链，包含SEQ ID NO:36/37的抗体)

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SEQ ID NO:37(轻链，包含SEQ ID NO:36/37的抗体)

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Claims

1.抗EphA3抗体，其包含V_H区和V_L区：

所述V_H区具有氨基酸序列为X₁GX₂YEX₃FDX₄的CDR3，其中X₁为S或G，X₂为Y或V，X₃为E或D以及X₄为S、V或I，其中，

(i)所述CDR3序列为SGYYEDFDS、GGYYEDFDS、SGYYEEFDS、SGVYEDFDS、SGYYEDFDV或SGYYEDFDI，CDR1序列为GYWMN以及CDR2序列为DIYPGSGNTNYDEKFQG；或

(ii)所述CDR3序列为SGYYEDFDS，CDR1序列为TYWIS以及CDR2序列为DIYPGSGNTNYAQKFQG、DIYPGSGNTNYAQEFRG或DIYPGSGNTNYAQKFLG；或

(iii)所述CDR3序列为SGYYEDFDI或SGYYEDFDV，CDR1序列为SYWIN以及CDR2序列为DIYPGSGNTNYDEKFKR；以及

所述V_L区具有氨基酸序列为X₁X₂YX₃X₄YPYT的CDR3，其中X₁为G、V或A，X₂为Q、R或G，X₃为A、S或L以及X₄为N或K，其中

(i)所述CDR3序列为GQYANYPYT、VQYANYPT、VQYSNYPYT、AQYANYPYT、VQYAKYPYT、VGYANYPYT、VRYANYPYT或VQYLNYPYT，CDR1序列为RASQGIISYLA或QASQDISTYLN以及CDR2序列为AASSLQS或GASSLQS；或

(ii)所述CDR3序列为VQYANYPYT，CDR1序列为QASQDISTYLN或RASQSISSYLA以及CDR2序列为AASSLQR。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_H CDR3序列为GGYYEDFDS，CDR1序列为GYWMN以及CDR2序列为DIYPGSGNTNYDEKFQG。

3.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_L区CDR3序列为GQYANYPYT，CDR1序列为RASQGIISYLA以及CDR2序列为AASSLQS。

4.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_H CDR3序列为GGYYEDFDS，V_H CDR1序列为GYWMN以及V_H CDR2序列为DIYPGSGNTNYDEKFQG；并且V_L CDR3序列为GQYANYPYT，V_LCDR1序列为RASQGIISYLA以及V_L CDR2序列为AASSLQS。

5.如权利要求4所述的抗体，其中所述V_H区的FR4序列为WGQGTTVTVSS。

6.如权利要求4所述的抗体，其中所述V_L区的FR4序列为FGQGTKLEIK。

7.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_H区的V区段序列是SEQID NOs:1-10中任一项所示的V_H V区段。

8.如权利要求7所述的抗体，其中所述序列为SEQ ID NOs:1-10中任一项所示的V_H区序列。

9.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_L区的V区段为SEQ IDNOs:11-23之一的V_L V区段序列。

10.如权利要求9所述的抗体，其中所述V_L区序列为SEQ ID NOs:11-23之一的V_L区的序列。

11.如权利要求1所述的抗体，其中所述V_H区与V_L区的序列为：

a)SEQ ID NO:l与SEQ ID NO:20,

b)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:l1,

c)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:12,

d)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:19,

e)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:21,

f)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:22,

g)SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:23,

h)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:11,

i)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:12,

j)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:21,

k)SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:22,

1)SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:11,

m)SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:13,

n)SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:11,

o)SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:13,

p)SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:21,

q)SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:14,

r)SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:15,

s)SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:14,

t)SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:15,

u)SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:14,

v)SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:15,

w)SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:16,

x)SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:17,

y)SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:19,

z)SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:17,

aa)SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:18或

bb)SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:20。

12.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体为IgG。

13.如权利要求12所述的抗体，其中所述抗体为IgG1或IgG3。

14.如权利要求12所述的抗体，其中所述抗体为IgG2或IgG4。

15.如权利要求12所述的抗体，其中所述抗体的重链恒定区为SEQ ID NO:24列出的氨基酸序列。

16.如权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:25列出的氨基酸序列的κ轻链恒定区。

17.如权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有SEQ ID NO:24列出的氨基酸序列的重链恒定区和SEQ ID NO:25列出的氨基酸序列的κ轻链恒定区。

18.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35、或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。

19.如权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有优于10nM的单价亲和力。

20.包含权利要求12所述的抗体的抗体制剂，其中所述重链恒定区为低岩藻糖基化的或去岩藻糖基化的。

21.包含权利要求17所述的抗体的抗体制剂，其中所述重链恒定区为低岩藻糖基化的或去岩藻糖基化的。

22.药物组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的抗体。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述抗体是IgG，以及所述抗体的制剂为去岩藻糖基化的或低岩藻糖基化的。

24.包含权利要求18所述的抗体的药物组合物，其中所述抗体的制剂为去岩藻糖基化的或低岩藻糖基化的。

25.治疗有效量的权利要求1至11中任一项所述的抗体在制备用于治疗患有EphA3依赖性疾病的患者的药物中的用途。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述疾病为癌症。

27.如权利要求26所述的用途，其中所述患者已经接受或正在接受用血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂的治疗。

28.如权利要求27所述的用途，其中所述VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。

29.如权利要求26所述的用途，其中所述药物还包含抗Bv8抗体拮抗剂。

30.如权利要求26所述的用途，其中所述患者患有实体肿瘤。

31.如权利要求26所述的用途，其中所述患者患有为急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。

32.如权利要求31所述的用途，其中所述EphA3依赖性疾病为脊髓发育不良综合征、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症或特发性骨髓纤维化。