CN104254340A - 通过靶向骨髓中异常血管系统上表达的EphA3来治疗血液增殖性疾病的方法 - Google Patents

通过靶向骨髓中异常血管系统上表达的EphA3来治疗血液增殖性疾病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于治疗血液增殖性疾病的诊断和治疗方法。

Description

通过靶向骨髓中异常血管系统上表达的EphA3来治疗血液增殖性疾病的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年8月12日提交的美国临时申请号61/523,104的权益，所述申请出于所有目的通过引用纳入本文。发明背景
EphA3是在某些实体瘤上以及实体瘤血管系统上表达的受体酪氨酸激酶(参见，WO2008/112192)。此外，据报道，EphA3在加速期和急变期中的慢性骨髓性白血病(CML)患者的CD34+细胞上过表达(Cilloni等,美国血液学协会(American Society of Hematology),摘要1092,2008)。EphA3还在肿瘤骨髓细胞(包括肿瘤骨髓干细胞)的表面上表达，所述细胞在获自慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、骨髓发育异常综合征(MDS)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)或特发性骨髓纤维变性(IM)患者的骨髓和外周血样品中(参见，WO2010/102244)。
AML和骨髓纤维变性患者的骨髓中血管生成增加(参见，例如，Padro等,Blood95:2637,2000;Gianelli等,Am.J.Clin.Path.128:966,2007)，而高微管密度是AML的一项不良预后因素(例如，Kukzu等,Leukemia and Lymphoma45:1185,2004)。采用内皮抑素的抗血管生成治疗在小鼠模型中抑制AML进展(Schuch等,Leukemia19:1312,2005)。此外，在其它血液恶性现象(例如多发性骨髓瘤、急性白血病和血液增殖性肿瘤)中也观察到新血管形成(参见，例如，Medinger和Mross,J.Angiogenesis Res.2:10,2010；和Frater等,Diagnostic Pathol.3:16,2008)。
发明内容
本发明部分基于血液增殖性疾病患者骨髓中的血管系统表达EphA3这一发现。可采用靶向EphA3的试剂(例如激活EphA3抗体)来治疗其中肿瘤性细胞本身不表达EphA3或低水平表达EphA3的患者中的血液增殖性疾病。在一些实施方式中，所述患者患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病、肥大细胞症、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)或特发性骨髓纤维变性(IM)。
本发明人发现，EphA3在血液增殖性疾病患者骨髓中的异常血管系统上选择性地表达。因此，一方面，本发明提供治疗血液增殖性疾病患者的方法，所述方法包括对血液增殖性疾病患者给予抗EphA3抗体，其中所述患者的血液增殖性疾病细胞表面上不表达EphA3，或其血液增殖性疾病细胞上低水平表达EphA3。在一些实施方式中，所述患者患有AML。在一些实施方式中，所述患者患有CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET或IM。在一些实施方式中，所述患者患有CLL、MM、弥散性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、MCL、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。不希望受理论限制，治疗性抗EphA3抗体杀伤表达EphA3的细胞(例如，血管内皮细胞)，但其未必是抗血管生成的，因为该抗体可能不阻止内皮细胞增殖和血管生成。
在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体使EphA3多聚体化。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体激活EphA3且造成靶细胞的形貌变化，例如，变圆。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来杀伤靶细胞。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体(i)激活EphA3且(ii)诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一个方面，本发明提供一种治疗血液增殖性疾病患者的方法，所述患者具有选择性表达EphA3的异常骨髓血管系统，但血液增殖性疾病细胞表面不表达EphA3或低水平表达EphA3，所述方法包括：给予所述患者治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3抗体激活EphA3和/或诱导ADCC。
在一些实施方式中，用于本发明方法的治疗性抗EphA3抗体是重组抗体或嵌合抗体。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体是人抗体。所述治疗性抗EphA3抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体是包含Fab、Fab'或Fv的多价抗体。在一些实施方式中，所述抗体是F(ab’)2。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3。在一些实施方式中，所述治疗性抗体与mAb IIIA4结合至相同表位。在特定实施方式中，所述治疗性抗体不妨碍肝配蛋白配体(例如，肝配蛋白A5)结合EphA3。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的VH和VL区。在一些实施方式中，所述治疗性抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的VH和VL区CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方式中，所述治疗性抗体包含mAb IIIA4的VH区CDR3和VL区CDR3。在一些实施方式中，所述治疗性抗体诱导ADCC。因此，在一些实施方式中，所述治疗性抗体具有活性同种型，例如，所述抗体具有人重链恒定区γ-1或γ-3区。在一些实施方式中，所述治疗性抗体不诱导ADCC，例如，所述抗体具有人重链恒定区γ-2或γ-4区，或多聚片段。
在本发明内容中，“激活EphA3或诱导ADCC的抗EphA3抗体”指如下抗体：(i)激活EphA3(ii)诱导ADCC，或(iii)激活并诱导ADCC。
在本发明的一些实施方式中，血液增殖性疾病患者用本文所述的抗EphA3抗体治疗并且还接受采用其它针对该疾病的治疗剂的治疗。因此，在一些实施方式中，所述方法包括给予一种或多种其它治疗剂。例如，若所述血液增殖性疾病是CML，其它治疗剂可包括甲磺酸伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼或其它化疗剂。若所述血液增殖性疾病是AML，所述其它治疗剂可以是，例如，单独的胞嘧啶阿糖胞苷或与红比霉素联用的胞嘧啶阿糖胞苷。
在其它方面，本发明提供一种鉴定患有血液增殖性疾病的血液增殖性疾病患者的方法是否为采用抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，其中，所述方法包括：检测所述血液增殖性疾病患者内异常骨髓血管系统上EphA3的表达。在一些实施方式中，所述患者患有AML。在一些实施方式中，所述患者患有CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET或IM。在一些实施方式中，所述患者患有CLL、MM、弥散性大B细胞淋巴瘤、NHL、MCL、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。
在一些实施方式中，本发明提供一种监测对血液增殖性疾病患者治疗功效的方法，所述患者的异常骨髓血管系统表达EphA3，所述方法包括：从已用针对血液增殖性疾病的治疗剂进行治疗的患者获得骨髓样品；和检测异常骨髓血管系统上EphA3的表达。
可采用公知技术来检测EphA3的表达。因此，在一些实施方式中，对EphA3表达的检测包括检测血管系统上表达的蛋白质，例如，采用免疫组化法进行所述检测。在一些实施方式中，用于检测异常血管系统上EphA3的表达的抗体结合的表位不同于治疗性抗体结合的表位。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体SL-2，其由杂交瘤产生，该杂交瘤于2011年11月8日按布达佩斯条约保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(20110)的大学大道10801号(10801University Blvd.,Manassas,VA20110,USA)的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指定专利保藏号PTA-12227。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体SL-7，其由杂交瘤产生，该杂交瘤于2011年11月8日按布达佩斯条约保藏于ATCC保藏的杂交瘤，指定专利保藏号PTA-12228。
在另一个方面，本发明提供单克隆抗体，例如，用于检测异常血管系统上的EphA3表达。在一个实施方式中，所述单克隆抗体是SL-2，其由杂交瘤产生，该杂交瘤保藏于ATCC，保藏号PTA-12227。在一个实施方式中，所述单克隆抗体是SL-7，其由杂交瘤产生，该杂交瘤保藏于ATCC，保藏号PTA-12228。本发明还提供包含单克隆抗体SL-1和/或SL-7的试剂盒。所述试剂盒还可，例如，包含其它试剂，例如用于免疫组化分析的试剂。
附图简述
图1提供ELISA的说明性数据证明抗体与EphA3结合。使来自六种杂交瘤的上清液在PBS中稀释至5μg/ml，然后施用至EphA3被覆的板上。采用山羊抗小鼠HRP偶联物来检测结合。采用Prizm5.0软件分析数据。
图2提供说明性数据显示由FACS分析的经纯化SL抗体与LK63细胞的结合。以比较的方式显示抗体的结合(空心直方图)与不相关同种型对照抗体(填充直方图)与LK63细胞的结合：(A)25nM小鼠mAb IIIA4、(B)25nM SL-2、(C)25nM SL-5，和D)25nM SL-7抗体。针对各样品的数据代表排除死亡细胞的10,000次事件。
发明详述
定义
本文所用的术语“血液增殖性疾病”指涉及血液细胞异常增殖的某些疾病，包括白血病、淋巴瘤和各种骨髓瘤和发育异常。在本发明中，血液增殖性疾病因而包括慢性血液增殖性疾病(CMPD)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性粒单核细胞白血病(CMML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病、肥大细胞症、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和特发性骨髓纤维变性(IM)。术语“JMML”涵盖称为幼年型慢性骨髓性白血病(JCML)、婴幼儿慢性粒单核细胞白血病和婴儿期单体7综合征的所有诊断。血液增殖性疾病可用已知标准诊断，例如，世界卫生组织(WHO)标准、法国-美国-英国(FAB)分类系统、国际预后评分系统(IPSS)等。在2008WHO分类中，CMPD表示血液增殖性肿瘤(MPN)。血液增殖性疾病常通过特定突变的存在来表征。例如，CML由BCR-ABL的存在来表征。PV、ET和IM是“非-BCR-ABL”(本文中也称作“负BCR-ABL”或“BCR-ABL阴性”)CMPD，因为这些疾病不具有BCR-ABL。然而，BCR-ABL阴性疾病常由JAK2突变的存在来表征，CML中罕见该突变。如本文所用，术语“CML”包括费城染色体(Philadelphia chromosome)阳性和费城染色体阴性CML。
本发明内容中所用术语“血液增殖性疾病细胞”指血液增殖性疾病的特征性的肿瘤性血液细胞。术语“肿瘤性”涵盖可能不被认为是恶性的细胞(例如，骨髓增生异常综合征的特征骨髓细胞)和恶性的细胞(例如，恶性急性白血病细胞)。“血液增殖性疾病细胞”涵盖胚细胞和干细胞，但不包括与血液增殖性疾病患者(例如，AML患者)骨髓中出现的异常血管生成相关联的异常骨髓血管系统。
如本申请内容中所用，“异常骨髓血管生成”指相对于正常骨髓中血管生成水平和正常骨髓中血管系统结构而言增加且结构异常的血管生成。本文中所用的“异常血管系统”指反常的微血管结构，包括：形状无规性与扭曲性增加、纤维增加、微血管密度增加和无规形状窦的复杂分支(参见，例如，Kvansnicka和Thlele,Histol.Pathol.19:1245-1260,2004)。
本文中提及EphA3表达时所用的术语“选择性表达”或异常血管系统上的“EphA3的选择性表达”指异常血管系统而非正常血管系统上的EphA3表达。EphA3可在异常血管系统的内皮中或在血管的其它部分(例如，中膜或外膜)中表达。
在本发明内容中，EphA3在血液增殖性疾病细胞上的“低水平”或“最小程度”表达指由流式细胞术或本领域已知的其它方法评估显示细胞群中少于50%，或在一些实施方式中，少于40%、30%、20%、10%或少于5%的血液增殖性疾病细胞表达EphA3表达EphA3。在一些实施方式中，CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML中的血液增殖性疾病细胞显示EphA3低水平表达，其中由流式细胞术评估显示EphA3以所述血液增殖性疾病细胞群的5%或更低的水平表达。
本文中提及异常血管系统上的表达时所用的术语“EphA3+”指高于背景的EphA3表达。本文中提及肿瘤血液疾病细胞上EphA3的表达时所用的术语“基本Epha3-”指无表达，即，观察到任何细胞上都没有表达或少于50%、通常少于40%、少于30%、少于20%、少于10%或少于5%的肿瘤性细胞表达EphA3。
可互换使用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”指肿瘤性细胞。该术语包括良性细胞和恶性细胞。肿瘤性转化与所述肿瘤细胞相对于其来源细胞类型的表型变化相关联。所述变化可包括形貌变化和异常生长。(参见，Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(《动物细胞培养和基础技术手册》)(第三版，1994)。
本发明内容中的"抑制血液增殖性疾病细胞的生长"指使血液增殖性疾病患者的癌细胞生长缓慢和/或减轻其癌细胞负载。"癌症生长的抑制"(所述癌症例如AML)，因而包括杀伤癌细胞。如本文所用，"EphA3"是Eph受体A3。该受体也被称作"人胚胎激酶"、"hek"、"eph样酪氨酸激酶1"、"etk1"或"tyro4"。EphA3属于蛋白质-酪氨酸激酶家族的肝配蛋白受体亚家族。已有信息表示EPH和EPH相关受体涉及介导发育事件。EPH亚家族的受体通常具有一个激酶结构域以及含有富Cys区域和2个纤连蛋白III型重复的胞外区。根据胞外结构域序列的相似性和结合肝配蛋白-A和肝配蛋白-B配体的亲和力，将肝配蛋白受体分为两类。EphA3结合肝配蛋白-A配体。EphA3核酸序列和蛋白质序列是已知的。人EphA3氨基酸序列的示例可根据收录号EAW68857获得。
在本发明内容中，“激活EphA3或诱导ADCC的抗EphA3抗体”指如下抗体：(i)激活EphA3(ii)诱导ADCC，或(iii)激活并诱导ADCC。
出于本发明目的，EphA3的“激活”造成EphA3的磷酸化。激活EphA3或的抗体或“激活性抗体”导致EphA3的磷酸化以及内皮细胞的形状变化(例如，变圆)，并因而被认为是本发明内容中的激动剂。EphA3可通过二聚化来激活，这导致内皮细胞的形状变化(例如，变圆)，并可导致凋亡。在一些实施方式中，激活EphA3的抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3。一般而言，“激活性”抗体结合表位结合结构域(EphA3的氨基酸29-202)，其中，氨基酸残基131、132和136对结合具有重要性。在一些实施方式中，所述激活性抗体结合的位点涵盖人EphA3蛋白的配体结合结构域中的残基131、132和136。
在本申请中，术语“EphA3抗体”或“抗EphA3抗体”可互换使用，指特异性结合EphA3的抗体。在一些实施方式中，所述抗体可使EphA3二聚化。所述术语涵盖在肝配蛋白配体(例如，肝配蛋白-A5)结合存在下结合EphA3的抗体，以及结合所述配体结合位点的抗体。
“在肝配蛋白配体结合存在下结合EphA3的EphA3抗体”指不显著阻止肝配蛋白配体(例如，肝配蛋白-A5)结合EphA3的抗体。在包括EphA3和肝配蛋白配体(例如，肝配蛋白-A5)的结合反应中，所述抗体的存在使肝配蛋白配体与EphA3的结合减少低于约30%，通常低于20%或10%。
术语"mAb IIIA4"指最初针对LK63人急性前B白血病细胞生成的单克隆抗体IIIA4，用以亲和分离EphA3(Boyd等.J Biol Chem267:3262-3267,1992)。mAb IIIA4结合原生EphA3球状肝配蛋白结合结构域(例如，Smith等,J.Biol.Chem279:9522-9531,2004)。其以收录号91061920保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(参见，例如，欧洲专利号EP0590030)。
如本文所用，“具有活性同种型的抗体”指具有与免疫效应物细胞上存在的Fc受体结合的人Fc区的抗体。“活性同种型”包括IgG1、IgG3、IgM、IgA和IgE。该术语涵盖所含人Fc区具有修饰的抗体，所述修饰如对糖组成和/或糖基化水平的改变或突变，其调节Fc效应物的功能。
“Fc区”指除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体的恒定区。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE与IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N末端柔性绞链区。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3，以及Cγ1和Cγ之间的铰链。本领域中应理解，虽然Fc区的边界可变，但人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基末端包含残基C226或P230，其中根据Kabat等所述的EU索引编号(1991,NIH出版物91-3242，弗吉尼亚州斯普林菲尔德的国家技术信息服务中心(NationalTechnical Information Service,Springfield,Va.))。术语“Fc区”可指分离的该区域，或抗体或抗体片段中的该区域。“Fc区”包括天然产生的Fc区的等位基因变体以及调节效应物功能的修饰。Fc区也包括不导致生物功能改变的变体。例如，可从免疫球蛋白的N末端或C末端删去一个或多个氨基酸而不造成生物学功能的显著丧失。此类变体可根据本领域已知的一般规则选择，从而对活性具有最小的影响(参见，例如Bowie等，Science247:306-1310,1990)。
如本文所用，“抗体”指功能上定义为结合性蛋白质且结构上定义为包含被技术人员认定为源自产抗体动物的免疫球蛋白编码基因框架区的氨基酸序列。抗体可由基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们分别依次定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知典型的免疫球蛋白(抗体)的结构单位包含四聚体。各四聚体由两对相同的多肽链对组成，各多肽链对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N末端确定约100～110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
本文所用的术语“抗体”包括保持结合特异性的抗体片段。例如，存在多种经充分表征的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化抗体C末端至铰链区中的二硫键连接，以产生Fab的二聚体F(ab')2，其本身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以使铰链区中的二硫键连接断裂，由此将F(ab')2二聚体转换成Fab'单体。Fab'单体实质上是具有部分铰链区的Fab(关于其它抗体片段的更详细描述参见，《基础免疫学》(Fundermental Immunology)，W.E.Paul编，纽约的雷文出版社(Raven Press)(1993))。虽然以消化完整抗体的方式定义了不同抗体片段，技术人员应理解，可通过化学方法或通过采用重组DNA方法来从头合成片段。因此，本文中所用术语抗体还包括通过全抗体修饰或用重组DNA方法合成所产生的抗体片段。
抗体包括VH-VL二聚体，包括单链抗体(以一条多肽链形式存在的抗体)，例如其中重链可变区和轻链可变区连接在一起(直接连接或通过肽接头连接)以形成连续多肽的单链Fv抗体(sFv或scFv)。所述单链Fv抗体是共价连接的VH-VL，其可由包括VH编码序列和VL编码序列(直接连接或通过肽编码接头连接)的核酸表达(例如，Huston等.Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。虽然VH和VL彼此连接成单条多肽链，但VH和VL结构域是非共价结合的。或者，所述抗体可以是其它片段。其它片段还可通过如下方式生成，例如，采用重组技术，生成为可溶性蛋白质或作为片段获自展示方法。抗体还可包括双抗体(diantibody)和微型抗体(miniantibody)。本发明的抗体还包括重链二聚体，例如来自骆驼科的抗体。出于本发明人的目的，以可激活血液增殖性细胞表面上存在的EphA3的形式，或以可通过ADCC杀伤血液增殖性细胞的形式使用抗体。因此，在一些实施方式中，抗体是二聚体。在其它实施方式中，所述抗体可以是具有活性同种型的单体形式。在一些实施方式中，所述抗体是可交联EphA3的多价形式，例如，三价或四价形式。
如本文所用，“V区”指包含框架区1、CDR1、框架区2、CDR2和框架区3，包括CDR3和框架区4的片段的抗体可变区结构域，作为B细胞分化过程中重链和轻链V区基因重排的结果，这些片段被添加至V区段。
如本文所用，“互补决定区(CDR)”指各链上的三个高变区，所述高变区断开由轻链可变区和重链可变区建立的四个“框架区”。所述CDR的主要作用在于与抗原的表位结合。各链的CDR一般从N末端开始顺序编号称为CDR1、CDR2和CDR3，并且也通常由特定CDR定位的链来鉴别。因此，VH CDR3是位于其所在抗体的重链可变区中，而VL CDR1是其所在抗体的轻链可变区中的CDR1。
不同的轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区是组成性轻链和重链的合并框架区，其作用是使所述CDR在三维空间中定位且对齐。
CDR和框架区的氨基酸序列能够采用本领域中熟知的不同定义来确定，例如Kabat，Chothia，国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见，例如Johnson等，出处同上；Chothia和Lesk,1987，Canonical structuresfor the hypervariable regions of immunoglobulins(免疫球蛋白高变区的经典结构).J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia C.等，1989，Conformationsof immunoglobulin hypervariable regions(免疫球蛋白高变区的构象).Nature342,877-883；Chothia C.等，1992，structural repertoire of thehuman VH segments(人类VH区段结构库)J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol1997,273(4))。下述文献中还描述了抗原结合位点的定义：Ruiz等,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.(IMGT，国际免疫遗传学数据库)Nucleic Acids Res.,28,219–221(2000)；和Lefranc,M.-P.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.(IMGT，国际免疫遗传学数据库)Nucleic Acids Res.1月1日;29(1):207-9(2001)；MacCallum等,Antibody-antigeninteractions:Contact analysis and binding site topography(抗体-抗原相互作用：接触分析与结合位点拓扑学),J.Mol.Biol.,262(5),732-745(1996)；和Martin等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268–9272(1989)；Martin等,Methods Enzymol.,203,121–153,(1991)；Pedersen等,Immunomethods,1,126,(1992)；和Rees等,收录于Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Prediction(《蛋白质结构预测》).牛津的牛津大学出版社，141–1721996)。“表位”或“抗原决定簇”指抗原上结合抗体的位点。表位可由连续的氨基酸形成或通过蛋白质三级折叠而并酯的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在接触变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理下丢失。表位在独特空间构象中通常包括至少三个，和更常见地，至少5个或8～10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，X-射线晶体法和二维核磁共振法。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology(分子生物学方法中的表位作图法)，第66卷，Glenn E.Morris编(1996)。
如本文所用，"嵌合抗体"指免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至类型、效应物功能和/或种类不同或变化的恒定区，或连接至赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或变化的抗原特异性的可变区或其部分改变、替代或交换；或被来自其它物种或来自其它抗体类型或亚类的相应序列改变、替代或交换。如本文所用，“人源化抗体”指其中来自供者抗体的CDR被移植到人框架区序列中的免疫球蛋白分子。人源化抗体还可在框架区序列中包含供者来源的残基。所述人源化抗体还可包含人免疫球蛋白恒定区的至少部分。人源化抗体还可包含在受者抗体中和导入的CDR或框架区序列中所未见的残基。可采用本领域已知的方法进行人源化(例如，Jones等，Nature321:522-525;1986；Riechmann等，Nature332:323-327,1988；Verhoeyen等，Science239:1534-1536,1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992；美国专利号4,816,567)，包括例如“超人源化(superhumanizing)”抗体(Tan等，J.Immunol.169:1119,2002)以及“表面再造(resurfacing)”(例如，Staelens等，Mol.Immunol.43:1243,2006；和Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci USA91:969,1994)的技术。
在本发明内容中，“HUMANEEREDTM”抗体是指具有参比抗体结合特异性的经工程改造的人类抗体。本发明所用的经工程改造的人类抗体具有包含源自供者免疫球蛋白的最低限度序列的免疫球蛋白分子。在一些实施方式中，所述经工程改造的人类抗体可仅保留来自参比抗体CDR3区的最低必需结合特异性决定簇。通常，经工程改造的人类抗体通过将编码来自参比抗体重链CDR3区的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列与人VH区段序列接合，并将来自参比抗体的轻链CDR3BSD与人VL区段序列接合来工程改造。"BSD"指CDR3-FR4区，或该区域的介导结合特异性的部分。因此，结合特异性决定簇可以是CDR3-FR4、CDR3、CDR3的最低必需结合特异性决定簇(其指比CDR3小但存在于抗体V区中时具有结合特异性的任何区域)、D区段(关于重链区)，或CDR3-FR4的具有参比抗体结合特异性的其它区域。用于工程改造人抗体的方法见于美国专利号7,981,843和美国专利申请号20060134098。
如本文所用，“人抗体”指本质上属于人类的，即，具有来自人免疫系统的FR区，以及通常还有CDR区的抗体。因此，所述术语包括人源化抗体和HUMANEEREDTM抗体，以及从采用人免疫系统重构的小鼠分离的抗体和从展示文库分离的抗体。“低岩藻糖基化”的抗体制备物指其中α1,6-岩藻糖的平均含量低于天然产生的IgG抗体制备物中所发现的50%的抗体制备物。如本领域所理解，“低岩藻糖基化”针对抗体群来使用。
“非岩藻糖基化”的抗体没有α1,6-岩藻糖连接至IgG重链的CH2结构域。
如本文所用，“治疗性”抗体指给予血液增殖性疾病患者的人抗体和/或嵌合抗体。
提及核酸部分使用时，术语“异源性”指该核酸包含天然情况下通常不存在于同一关系中的两种或更多种子序列。例如，所述核酸通常经重组产生，具有例如来自多种不相关基因的两种或更多种序列，所述序列排列形成新的功能性核酸。类似地，异源性蛋白质常指在天然情况下彼此不存在于同一关系中的两种或更多种子序列。
提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源性核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的变化形式进行修饰，或所述细胞源自经此修饰过的细胞。因此，例如，重组细胞表达细胞天然(非重组)形式中不存在的基因，或表达其它情况下异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。本文中的术语“重组核酸”指体外原始形成的核酸，一般而言，指通过核酸操作(例如使用核酸酶和内切核酸酶)，以正常情况下天然未见的形式形成的核酸。通过该方式，实现了不同序列的可操作性连接。因此，出于本发明的目的，线性形式的经分离的核酸或通过连接(正常情况下不接合的)DNA分子来体外形成的表达载体都被认为是重组的。应理解，一旦重组核酸经制备并重新引入宿主细胞或生物体，其将以非重组形式复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机制而非体外操作；然而，此类核酸一旦以重组形式生成，尽管后续经以非重组形式被复制，其出于本发明目的仍被认为是重组的。类似地，“重组蛋白”是采用重组技术，即，通过使上述重组核酸表达来制备的蛋白质。
提及蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)地结合”抗体，或“特异性(或选择性)地与……发生免疫反应”指抗体与感兴趣的蛋白质结合的结合反应。在本发明内容中，所述抗体结合EphA3的亲和性通常以对其它抗原的亲和性高出至少100倍。
术语“平衡解离常数(KD)”指解离速率常数(kd,时间-1)除以结合速率常数(ka,时间-1,M-1)。可利用本领域已知的任何方法来测定平衡解离常数。本发明的抗体是高亲和性抗体。此类抗体具有的亲和性高于500nM，且常高于50nM或10nM。因此，在一些实施方式中，本发明的抗体具有500nM～100pM，或25nM～100pM，或25nM～50pM，或25nM～1pM的亲和性。
如本文所用，“血液增殖性疾病治疗剂”指一种试剂，当以治疗有效剂量给予向血液增殖性疾病(例如，AML)患者该试剂时，会治愈，或至少部分缓解所述疾病和与所述疾病相关联的并发症的症状。在一些实施方式中，所述治疗剂可以是化疗剂。
提及两种或更多种多肽(或核酸)序列使用时，术语“相同的”或百分数“相同性”指采用BLAST或BLAST2.0序列比较算法，利用下述默认参数，或通过手动对齐和视觉检查(参见，例如，NCBI网站)检测为相同的，或具有特定百分比的相同氨基酸残基(或核苷酸)(即，当在比较窗或指定区域上以最大对应性比较和对齐时，在特定区域上具有约60%相同性，优选70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性)的两种或更多种序列或子序列。本文中还将此类序列称为“基本相同的”序列。“基本相同的”序列还包括经删除和/或添加的序列，以及经取代的序列，以及天然存在的序列，例如多态性或等位基因变体，以及人工变体。如下文所述，优选的算法可考虑缺口等。优选地，在长度至少为25个氨基酸的区域上具有蛋白质序列相同性，或更优选地，在长度为50～100个氨基酸的区域上，或在蛋白质长度上具有蛋白质序列相同性。
如本文所用，“比较窗”包括选自：通常20个～600个，一般约50个～约200个，更一般约100个～约150个的连续位置的数目之一的区段的参比，其中，在序列与参比序列以最合适的方式对齐之后，可对这两个序列的相同数目的连续位置进行比较。使序列对齐以供比较的方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性对齐算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)，通过计算机执行这些算法(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，科学路575号，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))，或通过手工对齐和目测检查(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1995增刊))进行最优序列对齐以便比较。
适用于测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选示例包括BLAST和BLAST2.0算法，其描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。采用BLAST和BLAST2.0和本文所述的参数来确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)10，M=5，N=-4，和比较两条链。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))对齐(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，和比较两条链。
两种多肽基本相同的指示是第一种多肽与针对第二种多肽产生的抗体具有免疫学交叉反应性。因此，例如，若一种多肽与第二种多肽之间仅由保守性取代区分，则一般认为这两种多肽是基本相同的。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”指物质实质上或基本上不含天然状态下通常与其相伴的组分。一般用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和均一性。蛋白质在制品中作为主要物质存在则是基本纯的。在一些实施方式中，术语“纯化的”指蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条条带。优选地，其指蛋白质至少85%纯、更优选至少95%纯，最优选至少99%纯。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及包含经修饰残基的天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的氨基酸和合成的氨基酸，以及功能上与天然产生的氨基酸相类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，例如，与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸一般化学结构不同，但功能上与天然产生的氨基酸类似的化合物。
本文中氨基酸可由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知三字母符号或单字母符号表示。同样，核苷酸可由其普遍接受的单字母代码表示。
“保守修饰变体”可应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者若所述核酸不编码氨基酸序列，则指基本相同或相关的序列，例如天然相邻的序列。由于遗传密码的简并性，大多数蛋白质由大量功能上相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的各位置上，可将该密码子改变成所述另一种相应的密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的各核酸序列也述及该核酸的沉默变异。技术人员应认识到，在某些内容中，可修饰核酸中的各密码子(除了AUG和TGG，AUG一般是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG一般是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，在所述关于表达产物的序列中隐含有编码多肽的核酸的沉默变异，但不针对实际探针序列。
就氨基酸序列而言，技术人员将意识到，对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列，在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小百分比的氨基酸的独立取代、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中，所述变化导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。典型的相互保守取代如下：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(《蛋白质》)(1984))。
除非另有指示，术语“一个”或“一种”通常意在表示“一个(种)或多个(种)”。
介绍
本发明部分基于如下发现：发生自血液增殖性疾病患者异常血管生成的骨髓血管系统选择性地表达EphA3，所述血液增殖性疾病例如AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、CLL、MM、弥散性大B细胞淋巴瘤、NHL、MCL、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。所述异常血管系统中的EphA3表达常出现在心血管系统的内皮层，但其也可在较大血管的内皮外层(extraendotheliallayer)(例如，中膜和/或外膜中)观察到。因此，其中血液增殖性疾病细胞不表达EphA3或以低水平表达EphA3的血液增殖性疾病患者可通过给予抗EphA3激活性抗体和/或诱导ADCC的抗EphA3抗体来治疗。因此，一方面，本发明提供治疗CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML患者的方法，其中，所述患者的血液增殖性疾病细胞上不表达EphA3或以5%水平或更低水平表达EphA3，所述方法包括给予所述患者激活性抗EphA3抗体。在一些实施方式中，所述患者患有AML。在一些实施方式中，所述患者患有CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET或IM。在一些实施方式中，所述患者患有CLL、MM、弥散性大B细胞淋巴瘤、NHL、MCL、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。在一些实施方式中，本发明的方法包括对血液增殖性疾病细胞上不表达EphA3的CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML患者给予诱导ADCC的抗EphA3抗体。在一些实施方式中，对血液增殖性疾病细胞上不表达EphA3的CML、PV、ET、IM、AML、MDS、CMML或JMML患者给予的抗EphA3抗体(i)是激活性抗EphA3抗体并且(ii)诱导ADCC。
在一些实施方式中，用于本发明的抗EphA3抗体不妨碍EphA3与肝配蛋白(例如，肝配蛋白-A5)结合。在一些实施方式中，所述抗体使EphA3二聚化。在一些实施方式中，所述抗体交联EphA3。在一些实施方式中，所述抗体与mAb IIIA4竞争结合EphA3，例如，所述抗体与mAbIIIA4结合至同一表位。在一些实施方式中，所述抗体具有活性同种型，其中，其重链恒定结构域可结合至免疫效应物细胞上存在的Fc受体，导致ADCC。
治疗性抗EphA3抗体
用于本发明方法的抗EphA3抗体可针对EphA3蛋白或片段产生，或重组产生。可采用任何数量的技术手段来测定抗体结合特异性。参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)(1988)来获得关于可用于测定抗体的特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述。在一些实施方式中，所述抗EphA3抗体是多克隆抗体。技术人员已知制备多克隆抗体的方法(例如，Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory manual(《抗体，实验室手册》)(1988);Methodsin Immunology(免疫学方法))。可通过一次或多次注射免疫剂和(必要时)佐剂来在哺乳动物中产生多克隆抗体。所述免疫剂包括EphA3受体蛋白或其片段。
在一些实施方式中，所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。可采用杂交瘤法来制备单克隆抗体，所述方法例如由Kohler和Milstein,Nature256:495(1975)所述的那些。在杂交瘤法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，来引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性地与所述免疫剂结合。或者，淋巴细胞也可体外免疫。
人单克隆抗体可采用本领域已知的不同技术来产生，所述技术包括噬菌体展示库技术(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581(1991))。也可采用Cole等和Boerner等的技术来制备人单克隆抗体(Cole等,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)，第77页(1985)和Boerner等,J.Immunol.147(1):86-95(1991))。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的转基因动物(如小鼠)中来制备。在免疫攻击后，观察到人抗体生成，其在所有方面都与人中所见非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。该方法的描述参见，例如，美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，以及以下科技出版物：Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild等,Nature Biotechnology14:845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology14:826(1996);Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
在一些实施方式中，所述抗EphA3抗体是嵌合的或人源化的单克隆抗体。如上述文献所述，抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，其中人抗体的CDR被具有所需特异性、亲和性和性能的非人物种(例如，小鼠、大鼠或兔)CDR替代。
本发明中可采用多种形式的抗体。在一些实施方式中，所述抗体可包含Fc区，例如人Fc区。例如，此类抗体包括与EphA3结合的IgG抗体和具有活性同种型的IgG抗体。在一些实施方式中，所述抗体可以是活性片段(例如，其可使EphA3二聚化)或可包含抗体的衍生物，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或单结构域抗体("dAb")。例如，在一些实施方式中，所述抗体可以是F(ab’)2。本发明可用抗体的其它示例性实施方式包括激活性纳米抗体或激活性骆驼抗体。此类抗体还可以是通过本领域技术人员熟知的方法重组工程改造的。如上所述，此类抗体可用已知技术产生。如本领域技术人员所理解的，在一些实施方式中，当抗体是可单价的形式(例如，Fv或Fab形式)时，所述抗体可作为多价抗体(例如三价或四价抗体)使用。产生多价抗体的方法是已知的(参见，例如，King等,Cancer Res.54:6176-6185,1994)。
在许多实施方式中，用于本发明的抗体含有具有效应物功能(例如，与免疫效应物细胞上存在的Fc受体结合)的Fc恒定区。示例性的"效应物功能"包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调等。此类效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)联合，并且能够采用已知方法(参见，例如，下文引用的参考文献)评估。
具有活性同种型且结合至效应物细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞)上的Fc受体的抗EphA3抗体可通过ADCC诱导细胞死亡。
Fc区可来自天然产生的IgG1，或其它活性同种型，包括IgG3、IgM、IgA和IgE。“活性同种型”包括其Fc区含有修饰以增强与Fc受体的结合或另行改善抗体效力的那些抗体。这种Fc恒定区可含有增强与Fc受体的结合的修饰，如突变、糖基化水平的变化等。本领域已知多种修饰Fc区的方法。例如，美国专利申请公开号20060039904描述了Fc受体的变体，其具有增强的效应物功能，包括对一种或多种Fc配体(例如，FcγR，C1q)的改进的结合亲和性。此外，此类Fc变体具有改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。其他Fc变体包括例如以下文献中所述的Fc变体：Ghetie等，Nat Biotech.15:637-40,1997；Duncan等，Nature332:563-564,1988；Lund等，J.Immunol147:2657-2662,1991；Lund等，Mol Immunol29:53-59,1992；Alegre等，Transplantation57:1537-1543,1994；Hutchins等，Proc Natl.Acad SciUSA92:11980-11984,1995；Jefferis等，Immunol Lett.44:111-117,1995；Lund等，FASEB J9:115-119,1995；Jefferis等，Immunol Lett54:101-104,1996；Lund等，J Immunol157:4963-4969,1996；Armour等，Eur J Immunol29:2613-2624,1999；Idusogie等，J Immunol164:4178-4184,200；Reddy等，J Immunol164:1925-1933,2000；Xu等，Cell Immunol200:16-26,2000；Idusogie等，J Immunol166:2571-2575,2001；Shields等，J Biol Chem276:6591-6604,2001；Jefferis等，Immunol Lett82:57-65.2002.2002；Presta等，Biochem Soc Trans30:487-490,2002；Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005-4010,2006；美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；7,335,742和7,317,091；以及PCT公开WO94/2935；WO99/58572；WO00/42072；WO02/060919和WO04/029207。
在一些实施方式中，可对Fc区的天然糖基化进行修饰。例如，修饰可以是去糖基化，例如，通过去除所述抗体序列中的一个或多个糖基化位点来进行去糖基化。此类方法详见美国专利号5,714,350和6,350,861。还可制备糖基化类型改变的Fc区，例如岩藻糖残基数量减少的低岩藻糖基化Fc变体或截开型GlcNAc结构增加的Fc变体。可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达该抗体来实现这类糖修饰。糖基化通路改变的细胞，包括哺乳动物细胞、酵母和植物，已在本领域中有描述并可作为宿主细胞使用，以在其中表达本发明的重组抗体，由此产生糖基化改变的抗体。用于修饰糖基化的技术包括如下文献中公开的那些，例如Umana等,Nat.Biotechnol17:176-180,1999；Davies等,Biotechnol.Bioeng.74:288-294,2001；Shields等,J Biol Chem277:26733-26740,2002；Shinkawa等,J Biol Chem278:3466-3473,2003;Niwa等.Clinc.CancerRes.1-:6248-6255,2004;Presta等,Biochem Soc Trans30:487-490,2002;Kanda等,Glycobiology17:104-118,2006;美国专利号6,602,684；6,946,292和7,214,775；美国专利申请公开号20070248600；20070178551；20080060092；20060253928；PCT公开WO00/61739；WO01/292246；WO02/311140和WO02/30954；以及PotelligentTM技术(新泽西州普林斯顿的波娃公司(Biowa，Inc.))；和GlycoMAbTM糖基化工程技术(瑞士苏黎世的GLYCART生物技术公司AG(GLYCARTbiotechnology AG))。非糖基化的抗体可采用ProBioGen技术生成(vonHorsten等,Glycobiology20(12):1607-1618,2010)。在低岩藻糖基化的抗体制备中，通常有至少50～70%的抗体分子，常常有至少80%的所述分子或至少90%的所述分子缺乏岩藻糖。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体被额外工程改造以降低免疫原性，例如，从而所述抗体合适于重复给予。用于产生免疫原性降低的抗体的方法包括人源化和人造工程(humaneering)方法，以及修饰技术(例如去免疫化)，其中，抗体被进一步工程改造，例如，在一个或多个框架区内工程改造，以去除T细胞表位。
在一些实施方式中，所述抗体是HUMANEEREDTM抗体。HUMANEEREDTM抗体是经工程改造的人抗体，其具有参比抗体的结合特异性，该结合特异性通过将编码针对人VH区段序列的CDR(通常是所述参比抗体重链的CDR3)上的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列与针对人VL区段序列的CDR(通常是所述参比抗体轻链的CDR3)上的BSD接合来获得。用于产生此类抗体的方法见于美国专利号7,981,843和美国专利申请公开号20060134098。
抗体还可以是去免疫化的，以从抗体的V区去除一种或多种预计的T细胞表位。此类方法的描述见于，例如WO00/34317。
在一些实施方式中，所述可变区由人V基因序列组成。例如，可变区序列可与人胚系V基因序列具有至少80%的相同性，或至少85%或至少90%或更高的相同性。本发明所用的抗体可包括人恒定区。轻链的恒定区可以是人κ或λ恒定区。重链恒定区通常是γ链恒定区，例如γ-1或γ-3恒定区。
在一些实施方式中，例如，其中所述抗体是片段时，所述抗体可与另一种分子(例如，聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白)偶联，例如，以获得延长的体内半衰期。抗体片段的PEG化的例子在Knight等，Platelets15:409,2004(阿昔单抗(abciximab))；Pedley等，Br.J.Cancer70:1126,1994(抗-CEA抗体)；Chapman等，Nature Biotech.17:780,1999中提供。
抗体特异性
用于本发明方法的抗体激活EphA3和/或通过ADCC杀伤EphA3+。适用于本发明的抗体的示例是具有mAb IIIA4的结合特异性的抗体。单克隆抗体mAb IIIA4结合至天然EphA3球状肝配蛋白结合结构域(Smith等,J.Biol.Chem.279:9522-9531,2004；和Vearing等,CancerRes.65:6745-6754,2005)。高亲和性mAb IIIA4结合至EphA3表面对肝配蛋白-A5与EphA3相互作用的总亲和性几乎没有影响。
在一些实施方式中，采用与mAb IIIA4竞争接合EphA3的单克隆抗体，或与mAb IIIA4结合相同表位的单克隆抗体。可进行任何数量的竞争性结合试验以检测两种抗体结合至相同抗原的竞争性。例如，可采用夹心ELISA试验来达到该目的。在一个示例性试验中，通过用捕获抗体被覆孔的表面来进行ELISA。然后，向所述捕获表面添加亚饱和(subsaturating)浓度的带标签抗原。该蛋白质会通过特异性抗体:抗原相互作用与所述抗体结合。洗涤之后，向该ELISA试验添加连接有可检测部分的二抗。若该抗体结合至所述抗原上捕获抗体结合的相同位点，或妨碍对该位点的结合，则其将无法结合至该靶蛋白，因为该位点不再可供结合。然而，如果该二抗识别所述抗原上的不同位点，则其将能够结合。可通过对结合的可检测标记物的量进行定量来检测结合。通过采用即是捕获抗体又是检测抗体的单一抗体来确定背景，而最大信号可通过采用抗原特异性抗体捕获并用针对该抗原上标签的抗体来检测而建立。通过采用上述背景和最大信号为参比，可以成对方式评估抗体以确定特异性。特定抗体与另一种抗体识别相同表位的能力通常通过这种竞争试验来测定。
在采用任何上述试验时，若在一抗存在下，二抗与抗原的结合减少至少30%，通常至少约40%、50%、60%或75%，常减少至少约90%，则认为一抗竞争性抑制二抗结合。
在一些实施方式中，所述抗体与mAb IIIA4结合至相同表位。供mAbIIIA4和人类工程改造衍生物的表位位于EphA3的N末端球形配体结合结构域(如下人EphA3部分序列中的氨基酸29～202)：
1MDCQLSILLL LSCSVLDSFG ELIPQPSNEV NLLDSKTIQG ELGWISYPSHGWEEISGVDE
61HYTPIRTYQV CNVMDHSQNN WLRTNWVPRN SAQKIYVELKFTLRDCNSIP LVLGTCKETF
121NLYYMESDDD HGVKFREHQF TKIDTIAADE SFTQMDLGDRILKLNTEIRE VGPVNKKGFY
181LAFQDVGACV ALVSVRVYFK KC
mAb IIIA4抗体结合在肝配蛋白A5与受体结合的邻近处，但对肝配蛋白A5与受体的结合基本无干扰。供mAb IIIA4的表位已被Smith等采用定点诱变进一步表征，Smith等,J.Biol.Chem.279:9522,2004。在该分析中，第132位上的甘氨酸突变成谷氨酸(G132E)阻止了与mAb IIIA4的结合。缬氨酸133突变成谷氨酸(V133E)使EphA3与mAb IIIA4抗体的结合减少了约100倍。本发明人后续观察到精氨酸136也是该表位的部分。在大鼠中的高度保守EphA3序列中，该残基变成了亮氨酸(R136L)。大鼠EphA3不与mAb IIIA4或人类工程改造的mAb IIIA4衍生物结合。因此，G132、V133和R136(上述序列中粗体并带下划线部分)是mAb IIIA4表位中的重要氨基酸。结合亲和性
在一些实施方式中，适用于本发明的抗体对人EphA3具有高结合亲和性。出于本发明目的，若抗体的解离常数(KD)<约10nM，例如，约5nM或约2nM或约1nM或更低，则认为所述抗体与抗原之间具有高结合亲和性。可采用不同方法来测定抗体与其靶抗原之间的结合亲和性，所述方法例如表面等离子共振试验、饱和试验，或免疫测定如ELISA或RIA，这些都是本领域技术人员熟知的。用于测定结合亲和性的示例性方法是：在BIAcoreTM2000仪器(德国弗莱堡的比阿可公司(Biacore AB))上采用CM5传感器芯片进行表面等离子共振分析，如Krinner等所述,(2007)Mol.Immunol.2月;44(5):916-25.(2006年5月11日电子公开))。
所述治疗性抗EphA3抗体可结合至EphA3的任何胞外区域。在一些实施方式中，所述抗EphA3抗体激活EphA3。通常，所述抗体使EphA3多聚化(例如，二聚化)。在一些实施方式中，所述抗体使EphA3成簇。在一些实施方式中，还可使用具有活性同种型的抗EphA3抗体，例如IgG1、IgG3、IgM、IgA或IgE，并且通过ADCC对血液增殖性疾病细胞具有细胞毒性。用于本发明的抗体还可以是包括单体形式的多价抗体，所述单体形式交联或多聚化形成多价抗体。
在一些实施方式中，用于本发明的抗体不与EphA3配体竞争结合EphA3，而在其它实施方式中，用于本发明的EphA3抗体可与EphA3配体(例如肝配蛋白，如肝配蛋白-A5)竞争结合EphA3。与配体竞争结合EphA3的抗体可采用上述技术鉴定，其中，在竞争性分析中，采用肝配蛋白配体(例如肝配蛋白-A5)替代另一种抗体。
在示例性实施方式中，所述抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的VL和VH区。在其它实施方式中，所述抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方式中，所述抗EphA3抗体包含mAb IIIA4的CDR3。表1提供与mAb IIIA4结合相同表位的抗体的CDR序列(根据Kabat编号法确定)。通过ELISA测定对EphA3抗原的亲和性。因此，本发明抗体还可具有表1所示的重链和/或轻链CDR组。
表1
用于本发明的治疗性抗体的示例在例如WO2011/053465中有描述，该文献通过引用纳入本文。
本文所述的用于本发明的抗体可针对感兴趣特点采用已知方法来鉴定。因此，可通过筛选激活EphA3的能力(例如，采用磷酸化试验和/或对细胞形貌变化的筛选(例如变圆))、诱导ADCC的能力、筛选结合特异性和亲和性来鉴定抗体。此类试验为本领域熟知。
诊断性抗体
治疗性抗体还可用于诊断。因此，可采用上述任何抗体来鉴定异常血管系统上的EphA3表达。
也可采用与胞外结构域以外区域结合的抗EphA3抗体来检测EphA3表达。例如，5E11F2(可购自英杰公司(Invitrogen))结合至C末端肽氨基酸955-983并可用于诊断。出于检测EphA3表达的目的，以能够与血管系统上存在的EphA3结合的形式使用抗体。
在典型实施方式中，所述抗体用于骨髓血管系统上EphA3表达的免疫组化分析。适用于免疫组化的抗体与经甲醛固定、石蜡包埋和二甲苯与乙醇提取的EphA3结合。用于IHC的抗体是EphA3选择性的，并可结合至EphA3蛋白的任何区域，包括胞外结构域或胞内结构域。多克隆抗体和或单克隆抗体适用于本发明的该方面。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，例如小鼠单克隆抗EphA3抗体。优选地，所选用于免疫组化的所述抗体结合的表位与治疗性抗体识别的表位不同。在一些实施方式中，用于检测EphA3表达的抗体结合的表位与单克隆抗体IIIA4识别的表位不同，并且不与mAb IIIA4竞争结合EphA3。
在一些实施方式中，用于检测EphA3表达的抗体是SL-2，其由保藏于ATCC的杂交瘤(保藏号PTA-12227)产生；或SL-7，其由保藏于ATCC的杂交瘤(保藏号PTA-12228)产生。
本发明还提供单克隆抗体，例如，SL-2或SL-7，其可用于检测异常血管系统上的EphA3表达；和包含所述抗体的试剂盒。本发明试剂盒包含SL-2或SL-7抗体，或两者都包含，并且可包含用于分析表达的其它试剂，例如，二抗、缓冲液和其它试剂。
用于治疗的非抗体EphA3结合性试剂
还可向血液增殖性疾病患者给予结合至EphA3且使EphA3受体二聚化或激活EphA3受体的其它蛋白质，其中，所述血液增殖性疾病细胞不表达或最小程度地表达EphA3。此类蛋白质包括可溶性肝配蛋白A5-Fc蛋白。
其它EphA3结合性试剂包括结合EphA3的支架蛋白。因此，EphA3结合性试剂可以是以类似于抗体的方式靶向并结合至抗原的“抗体模拟物”。采用抗体模拟物时，所述模拟物的形式是能使EphA3多聚化的。例如，所述抗体模拟物可以二聚体或多价形式使用。
某些抗体模拟物采用非免疫球蛋白支架蛋白作为替代性的蛋白质框架供于抗体的可变区。例如，Ku等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:6552-6556,1995)公开了基于细胞色素b562的抗体替代物，其中使细胞色素b562的两个圈随机化并针对牛血清白蛋白的结合进行选择。发现个体突变体以类似于抗BSA抗体的方式选择性结合BSA。
美国专利号6,818,418和7,115,396公开了一种抗体模拟物，其特征是纤连蛋白或纤连蛋白样的支架蛋白以及至少一个可变环。这些称为腺连蛋白(Adnectin)的基于纤连蛋白的抗体模拟物显示出天然抗体和经工程改造抗体的许多相同特点，包括对任何靶标配体的高亲和性和特异性。这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构与IgG重链可变区的结构相似。因此，这些模拟物显示类似于天然的抗原结合性质和对天然抗体的亲和性。此外，这些基于纤连蛋白的抗体模拟物显示某些优于抗体和抗体片段的优点。例如，这些抗体模拟物不依赖于二硫键提供天然折叠稳定性，因而在正常情况下使抗体分解的条件下稳定。此外，由于这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构类似于IgG重链的结构，可采用类似于体内抗体亲和性成熟法的体外环随机化与改组(shuffling)方法。
Beste等.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1898-1903,1999)公开了基于脂质运载蛋白支架()的抗体模拟物。脂质运载蛋白在蛋白质末端处具有含四个高变环的β桶。使所述环随机发生突变，并根据结合进行选择，例如与荧光素的结合。三种变体显示对荧光素的特异性结合，而一种变体显示与抗荧光素抗体相类似的结合。进一步分析显示，所有随机化的位置都是可变的，指示将适于作为抗体替代物使用。因此，是通常具有160～180个残基的小型单链肽，其具有优于抗体的若干优势，包括生产成本降低、储存稳定性提高和免疫反应减弱。美国专利号5,770,380公开了合成的抗体模拟物，其采用刚性、非肽的杯芳烃(calixarene)有机支架附着以用作结合位点多个可变肽环。所述肽环彼此皆从该杯芳烃的几何同侧伸出。由于该几何学证实，所有环都可供结合，提高了对配体的结合亲和性。然而，与其它抗体模拟物相比，所述基于杯芳烃的抗体模拟物并非仅由肽组成，其因而不易受到蛋白酶攻击。该支架不完全由肽、DNA或RNA组成，意味着所述抗体模拟物在极端环境条件下相对稳定，并且寿命长。此外，由于所述基于杯芳烃的抗体模拟物相对较小，其较不易引发免疫应答。
Murali等(Cell Mol Biol49:209-216,2003)描述了将抗体缩减成较小模拟肽的方法，他们称为"抗体样结合性模拟肽"(ABiP)，其也可作为抗体替代物使用。WO00/60070公开了具有CTL4A样β-夹层构造的多肽链。所述肽支架具有6～9个β-链，其中，两个或更多个多肽β-环构成其它分子(例如抗原结合片段)的结合结构域。该支架的基础设计是人源性的，因此降低了诱发免疫应答的风险。相较于标准抗体，所述β-夹层支架可具有提高的体内稳定性和药代动力学性质，因为所述分子包含第二个非免疫球蛋白二硫桥。由于抗原结合结构域可位于单肽链的相对端，β-夹层还有利于设计双特异性单体分子。
除了非免疫球蛋白框架之外，还在包含RNA分子和非天然寡聚物(例如，蛋白酶抑制剂、苯二氮平、嘌呤衍生物和β-转角模拟物)的化合物中模拟出抗体性质。因此，非抗体EphA3结合性试剂还可包括此类化合物。
在一些实施方式中，本发明中采用所述EphA3结合性试剂与mAbIIIA4竞争结合至EphA3。此类试剂可采用已知试验来鉴定，所述试验例如本文所述的示例性竞争性试验。
鉴定采用抗EphA3治疗的候选患者
本发明还提供确定血液增殖性疾病患者是否是采用抗EphA3抗体治疗的候选者的方法。所述方法包括检测该患者中异常骨髓血管系统上EphA3的表达。
EphA3表达可采用本领域熟知的方法来检测。通常，采用利用免疫组化的免疫学试验来检测异常骨髓血管系统上的EphA3表达。或者，可通过检测异常骨髓血管系统中编码EphA3的mRNA来检测EphA3的表达。例如，可使用包括RT-PCR的核酸扩增方法。
在对治疗的候选患者的评价中，从所述患者获得包含血液增殖性疾病细胞的骨髓样品以供评价EphA3的表达。若所述异常血管系统表达EphA3，则认为患者是采用抗EphA3抗体治疗的候选者。因此，本文所用的“EphA3+患者”是显示异常骨髓血管系统EphA3表达的血液增殖性疾病患者。
血液增殖性疾病的治疗
一方面，本发明方法包括向血液增殖性疾病患者给予抗EphA3试剂(通常是抗EphA3抗体)，所述患者的异常骨髓血管系统表达EphA3，但血液增殖性疾病细胞为EphA3-表达。在一些实施方式中，向所述患者给予抗EphA3试剂，例如抗体。在一些实施方式中，所述患者患有AML。在一些实施方式中，所述患者患有CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET或IM。在一些实施方式中，所述患者患有CLL、MM、弥散性大B细胞淋巴瘤、NHL、MCL、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。
可采用不同的方法，包括免疫学方法，例如流式细胞术和PCR方法，来鉴定血液增殖性疾病细胞是否表达EphA3。可通过常用技术(例如采用流式细胞术的免疫表型分型)或通过体外细胞培养技术或体内移植试验来鉴定白血病细胞和其它血液增殖性疾病细胞。
干细胞是多能祖细胞，功能上还被确定为具有自我更新能力的细胞(参见，例如，Reya等，Nature414:105-111,2001，和其中所引文献)。例如，可在长期培养启动细胞(LTC-IC)试验中证明这点，该试验中，将细胞培养在经辐射的骨髓基质饲养层细胞上。在该试验中，由连续转移集落较长时间(例如，至少5周)的能力揭示干细胞的存在(例如，Guan和Hogge(2000)Leukemia14:2135)。连续性转移试验还可通过在生长因子的存在下于甲基纤维素中培养干细胞衍生的集落来进行，所述生长因子例如干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL3)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和红细胞生成素(EPO)的组合。
通过在具有缺陷型免疫系统的小鼠(SCID/NOD小鼠)内的连续性转移传代来进行体内移植以鉴定干细胞(van Rhenen等,Clin.Cancer.Res.11:6520-6527,2005)。
在流式细胞术分析中，白血病和慢性骨髓性增生疾病(CMPD)干细胞通常存在于CD34-阳性、CD38-阴性细胞域格中(尽管有约10%的AML病例呈CD34-阴性)。白血病或CMPD干细胞可在CD38-阴性细胞域格中鉴定为CD123-阳性细胞(Jordan等,Leukemia14:1777-1784,2000)，尽管也可采用其它标志物(包括CD117、CD45RA或CD133的存在)来鉴定干细胞。
胚细胞是能够参与粒细胞生成的单能性(unipotent)细胞。胚细胞是比正常人单核细胞和多形核血细胞大的细胞，并且可通过显微镜从血液涂片鉴定或通过流式细胞术分析根据相较于单核细胞和粒细胞而言的高正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)来鉴定。
可将给予所述患者的抗EphA3组合物配制成用于多种药物递送系统。也可在用于合适制剂的组合物中包括一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体。用于本发明的合适配方参见Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第21版，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA.)Lippincott Williams&Wilkins，2005。关于药物递送方法的简单概述参见Langer,Sciences249:1527-1533(1990)。
用于本发明方法的抗EphA3抗体以适于对患者注射的溶液形式提供，例如用于注射的无菌等渗水性溶液。使所述抗EphA3抗体以合适的浓度溶解或悬浮在可接受的运载体中。在一些实施方式中，所述运载体是水性的，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水等。所述组合物可视需要含有辅助药学物质以接近生理条件，所述辅助药学物质如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等。
将本发明的药物组合物以足以至少部分缓解疾病或所述疾病及其并发症症状的量给予异常骨髓血液系统表达EphA3但血液增殖性疾病细胞不表达EphA3的血液增殖性疾病患者。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。通过监测患者对治疗的反应来确定治疗有效剂量。指示治疗有效剂量的典型基准是本领域已知的，其取决于疾病。例如，可通过血液或骨髓中特定骨髓性增生疾病特征性的异常骨髓细胞的减少来指示治疗有效性。
选择抗EphA3抗体的剂量来为所述患者提供有效治疗，并且所述剂量为约0.1mg/kg体重～约10mg/kg体重，或约1mg～约1g/患者。所述剂量通常是约0.5mg/kg或约1mg/kg至约10mg/kg，或大约50mg～约1000mg/患者。在一些实施方式中，所述抗体以低于约0.1mg/kg体重的量，例如，以约20mg/患者或更少的量给予。可以合适的频率重复所述剂量，该频率可以是每天一次到每三个月一次的范围内，取决于所述抗体的药代动力学(例如，所述抗体在循环中的半衰期)以及药效反应(例如，所述抗体治疗效应的持续时间)。在一些实施方式中，所述抗体或经修饰抗体片段的体内半衰期在约7～约25天，并且每周一次到每三个月一次重复抗体给药。在其它实施方式中，所述抗体约每个月给药一次。
给予的有效的量将取决于疾病的严重性以及患者健康状况的一般状态，包括其他因素如年龄、体重、性别、给药途径等。可根据患者所需并耐受的剂量和频率单次或多次给予所述抗EphA3抗体。在任何情况下，所述方法提供足够量的抗EphA3抗体来有效地治疗所述血液增殖性疾病。
抗EphA3抗体或抗EphA3激动剂结合性试剂(例如，诱导EphA3多聚化或激活EphA3的试剂)可与一种或多种其它治疗剂联用来治疗所述血液增殖性疾病。可与抗EphA3结合性试剂联合给予的治疗剂包括如下化合物，例如，(注射用吉姆单抗奥佐米星)；酪氨酸激酶抑制剂，例如，甲磺酸伊马替尼()、尼洛替尼(和达沙替尼(；干扰素-α，以及多种化疗剂。
在一些实施方式中，抗EphA3激活性抗体可与一种或多种其它治疗剂联用以治疗慢性骨髓性白血病患者，其中来自所述患者的白血病干细胞表达EphA3。此类治疗剂包括不同化疗剂和甲磺酸伊马替尼
在一些实施方式中，抗EphA3抗体，例如，激活性抗体，可与一种或多种其它试剂联用以治疗急性骨髓性白血病。此类试剂包括单独使用的胞嘧啶阿糖胞苷和与红比霉素联用的胞嘧啶阿糖胞苷。
在一些实施方式中，抗EphA3激活性抗体可与一种或多种其它治疗剂联用来治疗BCR-ABL阴性CMPD患者。此类抑制剂包括JAK2抑制剂，这些抑制剂为本领域已知并正在进行临床评价。
患者可接受这些其它治疗剂中的一种或多种作为伴随治疗。或者，患者可用其它治疗剂进行后续治疗。
在一些实施方式中，对已进行骨髓移植的患者给予抗EphA3激活性抗体，其中，所述患者具有EphA3表达呈阴性的血液增殖性疾病细胞。
在一些实施方式中，通过任何合适的途径(通常为静脉内途径)注射或输注给予抗EphA3抗体或其它激活性EphA3结合性抗体。在一些实施方式中，在向所述患者给予之前使所述抗EphA3抗体稀释在注射用生理盐水溶液中。例如，通过静脉内输注15分钟～2小时的时间来给予所述抗体。
仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相似的结果。
实施例
实施例1-鉴定用于免疫组化的抗EphA3单克隆抗体
通过用人EphA3-Fc融合蛋白对小鼠进行免疫来产生与EphA3胞外结构域结合的一组单克隆抗体。将来自经免疫小鼠的脾细胞与SP2/0杂交瘤融合。通过ELISA对各分泌鼠IgG1同种型单克隆抗体的7种杂交瘤(称作SL-1～SL-7)的上清液分析EphA3结合(图1)。ELISA板(克斯塔(Costar)，目录号#3590)用50ng/孔的EphA3-Fc在37℃被覆1小时。孔用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)冲洗一次，并用内含5%脱脂奶(Marvel)的PBST在37℃封闭1小时。用PBST冲洗一次后，向板添加内含抗体上清液两倍稀释系列的PBS(50μl/孔)(10次稀释)。所述板在室温下孵育1小时。板用PBST冲洗3次，然后向各孔添加100μl的1:2000稀释的山羊抗小鼠HRP(DAKO，目录号#P0447)。板在室温下孵育45分钟。板在PBST中冲洗3次，在PBS中冲洗一次，并用100μl/孔的TMB试剂(西格玛(Sigma)，T0440-1L)显色。试剂用100μl的2M H2SO4终止，并在450nm处测吸光值(分子设备公司(Molecular Devices)的Spectramax Plus)。通过生物层干涉使用ForteBio Octet生物传感器来对上清液中的抗体浓度定量。
各抗体结合至重组EphA3。SL-2抗体具有最高亲和性(EC50=0.24nM)。
对具有最高亲和性的四种抗体SL-2、SL-5、SL-6和SL-7测试与其它Eph的交叉反应性。ELISA板用6种不同的Eph(EphA1、EphA2、EphA3、EphA5、EphB4和EphB6)被覆，并用SL-2、SL-5、SL-6和SL-7探测。全部四种抗体都特异性地结合EphA3，并未检出显示对其它Eph蛋白或Fc融合蛋白的结合。
采用A蛋白(Protein A)亲和色谱从杂交瘤上清液纯化抗体。将0.7–4.2升的细胞上清液在4℃以3.7mL/分钟用泵P-50(GE医疗保健公司(GEHealthcare))加载至25mL rProtein A FF柱(GE医疗保健公司(GEHealthcare))上。在加载细胞上清液之后，将该柱转移至主纯化系统(GE医疗保健公司)，用10个柱体积的缓冲液A(PBS pH7.0)以4mL/分钟的流速冲洗。用缓冲液B(0.3M Arg,0.15M NaCl pH2.8)从柱中洗脱抗体(以9mL流份)。各流份用1mL2M Tris pH8.0中和。包含抗体的流份通过SDS-PAGE(4-20%Tris-甘氨酸凝胶；英杰公司(Invitrogen)；目录号#EC60252)鉴定。合并所选流份并缓冲液交换入1xPBS pH7.0，在4℃过夜，采用Slide-A-Lyze透析盒(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)；目录号#17-5080-01)。在缓冲液交换之后，从透析盒移出样品并通过0.22um滤器过滤。
通过流式细胞术，采用EphA3阳性细胞系LK63来确定经纯化的单克隆抗体对细胞表面上表达的天然EphA3的结合。就流式细胞术而言，LK63细胞通过以200g离心5分钟收集，在dPBS(英杰公司(Invitrogen)，目录号#14190)中冲洗一次并用内含2%牛血清白蛋白(BSA)+10μg/ml大鼠IgG的dPBS在冰上封闭25分钟。细胞用25nM纯化的抗EphA3抗体在冰上孵育30分钟，在冷dPBS+0.5%BSA中冲洗一次，并在1:100稀释的连接有FITC的抗小鼠二抗(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch)115-096-062)在冰上孵育20分钟。细胞在冷dPBS+0.5%BSA中冲洗一次，然后在0.5ml冷dPBS重悬以供FACS分析。采用碘化丙啶(1μl/样品，西格玛目录号#P4864)来从FITC通道读数中排除无活性细胞，并使用FACSCaliber仪器(Beckton Dickinson)进行流式细胞术。
如图2所示，经纯化的SL-2、SL-5和SL-7抗体以等同于小鼠IIIA4抗EphA3阳性对照抗体的水平结合至LK63细胞。
实施例2-AML肿瘤血管系统上EphA3的表达。
采用经甲醛固定石蜡包埋(FFPE)切片的标准骨髓活检物，通过免疫组化来分析抗EphA3抗体对AML患者骨髓中的细胞的结合。切片用二甲苯处理替换两次(各5分钟)以去除石蜡，通过乙醇系列使其复水，并用蒸馏水漂洗。采用蛋白酶K(IHC世界公司，目录号#IW-1101)在37℃于湿盒中进行抗体修复10分钟，然后在含有0.1%吐温20的Tris-缓冲盐水pH7.4(TBST)中漂洗4分钟。载玻片用通用封闭溶液(维克多实验室公司(Vector Laboratories Inc.)，目录号#SP-2001)封闭10分钟，然后用亲和素(Avidin)溶液处理15分钟，并用生物素溶液处理15分钟。向载玻片添加新鲜抗体封闭溶液(0.07g脱脂牛奶+210ul山羊血清+14ml抗体稀释液)，室温20分钟，然后载玻片用TBST漂洗。一抗(SL-2、SL-5或SL-7)或同种型对照抗体在抗体稀释液(IHC世界公司，目录号#IW-1000)稀释至25μg/ml，然后添加至载玻片(0.5ml/片)，室温下1小时。然后，载玻片在TBST中漂洗两次。连接有生物素-SP的山羊抗小鼠IgG：(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，目录号#115-065-166)二抗在抗体稀释液中以1:500稀释，并添加至载玻片。载玻片在室温孵育30分钟，并在TBST中漂洗两次。再添加两至三滴磷酸酶标记的抗生蛋白链霉亲和素(KPL，目录号#:71-00-45)，然后载玻片在室温孵育30分钟。漂洗两次后，根据生产商说明书使用新型品红底物系统(New Fuchsin Substrate System)(Dako，目录号#K0698)使载玻片显色。
SL-2抗体检测出免疫组化中人AML患者骨髓内的EphA3-阳性细胞。AML骨髓中(表2)，在肿瘤新血管系统中的内皮上检测到EphA3。在较大血管(例如小动脉)中，EphA3在邻近内皮层的血管组织中表达。相反，未在正常骨髓中检测到EphA3。
表2：使用SL-2单克隆抗体通过免疫组化检测正常骨髓或AML患者骨髓的活检组织切片中的EphA3。采用法国-美国-英国(FAB)分类方案对患者疾病亚型评分。n/a表示未鉴定。
样品 FAB亚型，病期 造血细胞 血管
I-6414 正常 - -
I-1360 正常 - -
7709 M6 + +
7703 M5a - -
7706 M1 - -
I-8930 M1(CD34-ve) + +
I-8931 M5a + +
7704 n/a,复发 - +
7710 M1 - -
7707 n/a,复发 + +
7708 M3 - +
7712 M2 - +
本说明书引用的所有发表物、专利申请、收录号和其它参考文献通过引用纳入本文，正如各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。

Claims (32)

1.一种治疗血液增殖性疾病患者的方法，其中所述血液增殖性疾病细胞基本是EphA3-并且骨髓中的异常血管系统是EphA3+，所述方法包括：对所述患者给予治疗有效量的抗EphA3抗体，其中所述抗EphA3抗体(i)激活EphA3，和/或(ii)诱导ADCC。
2.如权利要求所述的方法，其特征在于，所述血液增殖性疾病细胞以5%或更低水平表达EphA3，并且所述血液增殖性疾病是急性骨髓性白血病(AML)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液增殖性疾病细胞以5%或更低水平表达EphA3，并且所述血液增殖性疾病是慢性骨髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、骨髓发育异常综合征(MDS)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)或特发性骨髓纤维变性(IM)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液增殖性疾病是慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体包含人重链γ-1或γ-3恒定区。
6.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体在低岩藻糖基化或去岩藻糖基化的抗体制备物中提供。
7.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体结合至EphA3上mAb IIIA4所结合的表位。
8.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是重组抗体或嵌合抗体。
9.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是人抗体。
10.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是单克隆抗体。
11.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是多克隆抗体。
12.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是包含Fab、Fab'或Fv的多价抗体。
13.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体诱导ADCC。
14.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体阻止肝配蛋白A5配体结合至EphA3。
15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予至少一种其它治疗剂，其中所述至少一种其它治疗剂是化疗剂。
16.一种确定血液增殖性疾病患者是采用抗EphA3抗体治疗的候选者的方法，所述方法包括：
提供来自所述患者的骨髓样品；和
检测所述骨髓中存在的异常血管系统上的EphA3表达。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述患者患有AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。
18.如权利要求16或权利要求17所述的方法，其特征在于，检测所述异常血管系统的内皮层血管中的EphA3表达。
19.如权利要求16或权利要求17所述的方法，其特征在于，检测所述异常血管系统血管的中膜或外膜中的EphA3表达。
20.如权利要求16或权利要求17所述的方法，其特征在于，所述检测EphA3表达的步骤包括使抗EphA3抗体接触所述样品。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是SL-2，其由保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的专利保藏编号为PTA-12227的杂交瘤产生；或SL-7，其由保藏于ATCC的专利保藏编号为PTA-12228的杂交瘤产生。
22.一种监测对具有EphA3+异常骨髓血管系统的血液增殖性疾病患者的治疗功效的方法，所述方法包括：
在对所述血液增殖性疾病进行治疗性处理之后从所述患者获得骨髓样品；和
检测异常血管系统上的EphA3表达。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述患者患有AML、CML、CMML、JMML、MDS、PV、ET、IM、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜伊红性白血病或肥大细胞症。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，检测所述异常血管系统的内皮层血管中的表达。
25.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，检测所述异常血管系统血管的中膜或外膜中的表达。
26.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述检测EphA3表达的步骤包括使抗EphA3抗体接触所述样品。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述抗EphA3抗体是SL-2，其由保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的专利保藏编号为PTA-12227的杂交瘤产生；或SL-7，其由保藏于ATCC的专利保藏编号为PTA-12228的杂交瘤产生。
28.一种试剂盒，其包含用于检测EphA3表达的至少一种试剂，其特征在于，所述至少一种试剂是单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体是SL-2，其由保藏于美国典型培养物保藏中心ATCC的专利保藏编号为PTA-12227的杂交瘤产生；SL-7，其由保藏于ATCC的专利保藏编号为PTA-12228的杂交瘤产生；或者所述单克隆抗体结合至EphA3的C末端区域的氨基酸995～983处。
29.一种杂交瘤，其保藏于美国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤的专利保藏编号为PTA-12227。
30.由权利要求29的杂交瘤产生的单克隆抗体。
31.一种杂交瘤，其保藏于美国典型培养物保藏中心，所述杂交瘤的专利保藏编号为PTA-12228。
32.由权利要求31的杂交瘤产生的单克隆抗体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008112192A2 (en) * 2007-03-08 2008-09-18 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of solid tumors
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2488554T (pt) * 2009-10-14 2019-09-13 Humanigen Inc Anticorpos para epha3

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008112192A2 (en) * 2007-03-08 2008-09-18 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of solid tumors
CN101641115A (zh) * 2007-03-08 2010-02-03 卡罗拜奥斯制药公司 用于实体瘤治疗的EphA3抗体
WO2010102244A1 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Treatment of leukemias and chronic myeloproliferative diseases with antibodies to epha3

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPHER V ET AL: "concurrent binding of anti-epha3 antibody and ephrin-a5 amplifies epha3 signaling and downstream responses: potential as epha3-specific tumor-targeting reagents", 《CANCER RESEARCH》 *

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