CN102666568A

CN102666568A - 纯化多肽的方法

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Publication number: CN102666568A
Application number: CN201080057393XA
Authority: CN
Inventors: A·查尔顿; M·纳波利; P·斯姆尔戴尔吉; A·斯托尔斯; V·皮尔扎斯; M·施罗德
Original assignee: CSL Ltd
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2030-12-15
Also published as: US20190330267A1; CN104193798A; EP3715356A1; AU2010332959A1; WO2011073235A1; SG181496A1; EP4328305A2; SG10201407983VA; PL3715356T3; CN102666568B; US20140080200A1; JP2013514310A; DK2513135T3; EP2513135B1; EP3715356B1; EP3715356C0; JP5984676B2; AU2010332959B2; CA2783207A1; KR20120108989A

Abstract

本发明涉及改善的通过相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量来纯化目的多肽的方法。此效应通过在通过由于相反于离子交换基质的电荷的电荷而也结合于离子交换基质的方法中添加化合物来达到，减少杂质的结合多于目的多肽的结合。

Description

纯化多肽的方法

【技术领域】

本发明涉及改善的通过相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量来纯化目的多肽的方法。此效应通过在方法中添加化合物来达到，其通过也结合于离子交换基质减少杂质的结合多于目的多肽的结合。

【背景技术】

多肽的大规模，经济纯化是对于生物技术工业越来越重要问题。多肽通过使用加工成通过插入含有该多肽的基因的重组质粒来产生目的多肽的哺乳动物或细菌细胞系进行细胞培养来产生。由于使用的细胞系是活体，常常给它们供应含有糖，氨基酸和生长因子的复合生长培养基，在一些情况中，也供给自动物血清的制备物。自饲喂给细胞的化合物的混合物及自细胞本身的副产物分离期望的目的多肽到对于用作人治疗剂足够的纯度是棘手的挑战。

重组体治疗性多肽通常在几种哺乳动物宿主细胞系（包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，幼仓鼠肾（BHK）细胞，人胚胎肾（HEK）细胞，鼠骨髓瘤NSO细胞），酵母细胞和细菌细胞（诸如E.coli）和昆虫细胞中产生。各细胞系在由细胞产生的多肽的产率和特征上具有优势和缺点。商业产生细胞系的选择常常平衡对具有递送给定产物需要的产物质量属性的能力的高产率的需求。发酵和细胞培养技术的发展大大增加了培养液中靶多肽的浓度。此上游效率的增加导致了细胞-收获阶段下游处理的瓶颈。细胞收获，或收获的细胞培养液的澄清，是几乎全部基于生物技术的产物的下游纯化中的重要过程。

一旦多肽以期望的水平表达，从宿主细胞移出多肽及收获。悬浮的粒子，诸如细胞，细胞碎片，脂质和其他不溶性物质一般通过过滤或离心自含有多肽的流体移出，产生在溶液中含有目的多肽以及其他可溶性杂质的澄清的流体。自细胞碎片纯化多肽的方法起初依赖于多肽表达的位点。导致一些多肽直接从细胞分泌到周围生长培养基；其他在细胞内制造。对于后者多肽，纯化过程的第1步骤涉及细胞的裂解，其可通过各种方法，包括机械剪切力，渗透休克或酶促处理进行。该分裂将细胞的整个内容物释放为匀浆物，且此外产生由于它们的小尺寸而难以去除的亚细胞碎片。这些通常通过离心或通过过滤去除。尽管更小规模，但伴随由于多肽产生过程中细胞的天然的死亡和细胞内宿主细胞多肽的释放的直接分泌的多肽，出现相同的问题。

包括宿主细胞多肽，产物变体，宿主细胞DNA，小分子，方法相关的混杂物，内毒素，朊病毒和病毒粒子的杂质必需去除。使用的纯化技术必需是可缩放，有效，成本-有效，可靠及符合最终产物的严格纯度需求。当前纯化技术一般涉及多层析分离。典型过程可包括全部或至少一些以下步骤：沉淀，透析，电泳，超滤，亲和层析，阳离子交换层析，阴离子交换层析和疏水相互作用层析。常规柱层析步骤是有效和可靠的，但通常具有低产物通量。

一旦获得含有目的多肽的溶液，通常使用不同层析技术的组合尝试其从由细胞产生的其他多肽的分离。在一些情况中，从杂质分离期望的多肽，其中杂质特别粘附于柱，而目的多肽不，即，目的多肽存在于"流通”中（”阴性-模式”层析）。

层析技术开发多肽的化学和物理性质以达到高程度的纯化。这些化学和物理性质一般包括尺寸，等电点，电荷分布，疏水位点和对配体的亲和性（Janson,J.C.and L.Ryden(eds.).(1989)PolypeptidePurification:Principles,High Resolution Methods and Applications.VCH Publishers,Inc.,New York）。层析的各种分离模式包括：离子交换，层析聚焦，凝胶过滤（大小排阻），疏水相互作用，反相和亲和层析。离子-交换层析（IEX），包括阴离子-交换层析（AEX）和阳离子-交换层析（CEX），通过它们的净表面电荷的差异的分离分析物（例如多肽）。IEX是从细胞碎片和其他杂质分离表达的多肽的主要工具。今天，IEX是纯化多肽，肽，核酸和其他带电的生物分子最常使用的技术之一，提供高分辨率和具有高装载容量的组分离。技术能分离它们的电性具有仅少数差异的分子物质，例如一个带电的氨基酸不同的2种多肽。这些特征使得IEX良好适合于自微量纯化和分析使用纯化流程和技术中的捕获，中间纯化或抛光步骤，至几kg产物的纯化。

IEX，根据可交换的对离子命名，是可应用于可离子化的分子的纯化的过程。离子化的分子基于它们的带电基团与附接于固相支持基质的带反电荷的分子的非特异性静电相互作用来分离，由此延缓与固相更强烈相互作用的那些离子化的分子。各类型的离子化的分子的净电荷，及其对基质的亲和性，根据带电基团数，各基团的电荷，及与带电的固相基质相互作用的分子竞争的性质而改变。这些差异导致通过IEX的各种分子类型的分辨率。在使用IEX的典型多肽纯化中，将源于宿主细胞的许多多肽的混合物，诸如在哺乳动物细胞培养中，应用于离子交换柱。在洗涤出非-结合分子之后，诸如通过以逐步或梯度-模式改变pH，对离子浓度等来调整条件，以从固相释放非-特别保留的或延缓的离子化的目的多肽及从具有不同电荷特征的多肽将其分离。AEX涉及在特定分离过程的pH及条件下阴离子目的分子与用于与附接于固相基质的带正电的分子相互作用的阴离子的竞争。相反，CEX涉及在特定分离过程的pH及条件下，阳离子目的分子与用于附接于固相基质的带负电的分子的阳离子的竞争。混合的模式离子交换层析涉及在相同的步骤中离子交换层析和疏水相互作用层析介质的组合的使用。尤其是，"混合的-模式"指称共价附接有疏水相互作用的混合物及阳离子交换或阴离子交换部分的固相支持基质。

维生素K-依赖性多肽通过共享分子的氨基末端部分的共同结构特征区别于其他多肽。这些多肽的N-端部分，也称之为Gla-结构域，富含罕见的氨基酸，γ-羧基谷氨酸，其在由酶γ-谷氨酰羧基化酶催化的维生素K-依赖性反应中由谷氨酸合成。因为存在约2～12个Gla残基，Gla-结构域特征在于能结合二价阳离子诸如Ca²⁺。结合金属离子之后，这些多肽经历通过几种技术诸如圆二色性和荧光发射可测量的构象变化。在1980年代，使用含有Gla的多肽的独特性质经历金属诱导的构象变化，开发了构象特定假亲和性层析。假亲和性层析不同于常规亲和层析在于，无固定的亲和性配体涉及，且其在常规层析基质上进行（Yan S.B.,J.Mol.Recog.1996;9,211-218）。Gla多肽可通过消除二价金属离子吸附于阴离子交换物质。随后，通过添加Ca²⁺到洗脱缓冲剂来进行洗脱。

在1986年，Bjoern和Thim报道了在利用因子VII的Gla-结构域的Ca²⁺-结合性质的阴离子交换材料上的重组因子VII的纯化（Bjoern S.及Thim L.,Research Dislosure,1986,26960-26962.）。吸附在无Ca²⁺的缓冲剂中实现，及因子VII的洗脱在使用具有低离子强度的含有Ca²⁺的缓冲剂及在弱条件下是可能的。Yan等人使用了纯化重组人多肽C的相同的原理（Yan S.B.等人,Bio/technology.1990;8,655-661）。

有GLA-结构域的多肽包括，但不限于，以下多肽：GAS-6，多肽S，因子II（凝血酶原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽1，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽2，跨膜γ羧基谷氨酸多肽3，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽4，基质Gla多肽，及骨钙素。

在本领域中，已描述了从目的多肽减少杂质的几个尝试。

WO 2009/082443涉及聚合物，诸如在含有未澄清的生物物质的流体和使用该物质而无需之前澄清而从该流纯化一种或更多期望的生物分子的方法中能不可逆地结合于不溶性粒子和可溶性杂质的子集，且也能可逆地结合于一种或更多期望的生物分子的可溶性聚合物。

仅当沉淀出溶液时，聚合物能在未澄清的细胞肉汤中的流内可逆地结合于一种或更多期望的生物分子（多肽,多肽,等）。可然后从流除去沉淀物，诸如通过从流的残留物过滤出，及回收期望的生物分子，诸如通过从沉淀物选择性洗脱。然后去除流的混合物的大多数杂质，诸如细胞培养基，抗泡沫物质，添加剂和可溶性组分。

WO 2008/122089公开了混杂多肽的优先沉淀，包括宿主多肽及切割的融合偶体，使重组多肽留在溶液中用于随后回收。由此使包含目的肽和可溶性混杂多肽的溶液经历导致混杂多肽（例如宿主细胞多肽,切割的多肽融合偶体和肽性切割剂诸如蛋白酶）的优先沉淀的条件。然后可从含有目的肽的溶液分离沉淀物，其然后可从该溶液通过适合的技术诸如冷冻干燥等回收。

WO 2008/091740提供与通过用聚电解质，诸如多聚阴离子聚电解质或用聚阳离子聚电解质沉淀多肽来分离和纯化源于细胞培养液多肽的相关的方法。沉淀步骤可之后是阳离子交换层析，阴离子交换层析，及其他沉淀步骤。

WO 2008/031020涉及通过使装载液通过结合产物的培养基，之后是使用洗脱溶液使含有精氨酸或精氨酸衍生的至少一种洗涤溶液通过培养基从含有产物，诸如抗体，及一种或更多杂质的装载液分离产物，及收集产物的方法。

WO 2007/117490涉及自包含抗体和至少一种HCP的混合物产生宿主细胞多肽-(HCP)减少的抗体制备物的方法，包括离子交换分离步骤，其中通过应用多于30g的抗体/l的基质使混合物经历第1离子交换材料。

WO 2007/108955涉及通过使用不包括亲和层析步骤或过程中缓冲剂交换步骤（例如,TFF或HPTFF）的2-步骤纯化过程，从含有混杂物诸如宿主细胞多肽和介质组分的混杂的混合物纯化多肽和多肽，尤其是重组多肽诸如单克隆抗体。而且，自第1步骤到第2步骤必需仅pH操作和/或稀释。

WO 2007/071768涉及自组合物纯化多肽的方法，方法包括将所述组合物的溶液装载到逆相液相层析柱，及用含有缓冲剂和盐的溶剂从柱洗脱所述多肽，其中所述盐在使用的缓冲剂的pH不具有缓冲能力。方法还提供以工业规模纯化多肽的轻度方式，即方法，其中装载的多肽的实质量维持操作条件，及保留其生物活性。

WO 2006/110277涉及通过使用不包括亲和层析步骤或过程中缓冲剂交换步骤（例如,TFF或HPTFF）的2-步骤纯化过程，自至少一种混杂物诸如宿主细胞多肽和其他物质诸如介质组分纯化目的分子。而且，是自第1步骤～第2步骤必需仅pH操作。HCP CHOP水平减少到小于20ppm。

WO 2006/067230涉及减少或甚至消除在包含维生素K-依赖性目的多肽的组合物中的多肽混杂物的含量的各种方法。在优选的实施方式中，去除来源于宿主细胞的蛋白S。

WO 2003/102132涉及非-亲和性层析纯化过程与高-性能切向流过滤（HPTFF）的组合能从含有宿主细胞多肽的混合物纯化靶多肽，诸如抗体或抗体-样分子，使得宿主细胞多肽杂质以小于百万分之（ppm）100的量存在于最终纯化的靶多肽中。

根据发明人的知识，现有技术中尚未描述在IEX中使用具有与选择的离子交换基质相反的多个电荷的化合物减少杂质如宿主细胞蛋白，宿主细胞核酸，内毒素，病毒而纯化目的多肽。

AEX已描述自重组体治疗性蛋白减少内毒素的方法（Chen等人,2009,Protein Expression and Purification,pp 76-81），但未提及使用带正电的化合物来增强内毒素的减小。

已显示当以2mM的浓度应用EGTA时，其结合于阴离子交换树脂（Yingst et al,1994,Biochimica et Biophysica Acta 1189,pp113-118）。

EDTA已以1mM和10mM之间的浓度使用而作为抑制蛋白酶的手段（Charlton A,Methods in Molecular Biology,vol.241AffinityChromatography:Methods and Protocols,Second Edition,HumanaPress,pp 211-227），而以10mM的浓度用于溶解细菌包含体（Ledunget al.,2009,J.Biotechnology,141,pp 64-72），并减少目的多肽的聚集。

在IEX中在阴离子交换Mono-Q柱中纯化血小板反应蛋白中以1mM的浓度使用EDTA，发现无层析谱的变化，或在Zhu中未给理由以5mM浓度使用EDTA（Zhu et al.,2009,Process Biochemistry 44pp 875-879），Chen（Chen et al.2009,J.Chromatorgr.1216,pp4877-4886）推荐使用1mM EDTA用于阴离子交换材料上细菌性表达的目的多肽的再折叠。Haganika（Haganika et al.,2001,J.Chromatography B,751,pp 161-167）自阴离子交换基质在洗脱缓冲剂中使用1mM的EDTA，也未合理解释这么做的原因。Pittalis等人（Pittalis et al.,1992,J.Chromatography,573pp 29-34）使用1.25mMEDTA浓度来平衡阴离子交换基质。

1991,J.Chromatography,587,pp 109-115）使用阴离子交换基质Mono-Q的硫氧还蛋白纯化中使用2mM的EDTA。Basta（Basta et al.,1991,J.Immunological Methods,142,pp39-44）使用含有6.5mM EDTA的缓冲剂用于自Mono-Q柱洗脱补体蛋白。

无以上使用提及对基于离子交换的目的多肽纯化性能的正面效应。

自Nielsen et al的文章（Nielsen et al.,1985,VeterinaryImmunology and Immunopathology,9,pp 349-359）提及添加1mMEDTA在一些基质（但并非所有）上改善IgG1，IgG2，IgM和白蛋白之间的分离的有益效应。作者推荐EDTA防止蛋白结合的作用，由此改善柱配体结合。

由此总结本发明的发明人的最佳知识，至今在IEX中使用的除了目的多肽之外最高水平的多电荷化合物是AEX中6.5mM EDTA。

【发明概述】

本发明涉及改善的通过相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量的自复杂混合物纯化目的多肽的方法。此效应通过在方法中添加化合物来达到，其通过也结合于离子交换基质减少杂质的结合多于目的多肽的结合。以上复杂混合物可来自重组产生方案或是例如人或动物体液，优选血或血浆溶液。

本发明的一实施方式是使用化合物减少IEX中目的多肽中的杂质，其中在选择的纯化条件，化合物由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质，由此通过减少结合于离子交换基质的杂质量多于结合于离子交换基质的目的多肽的量来增加目的多肽的结合特异性。

在一实施方式中，化合物带负电，而在选择的纯化条件，离子交换基质是阴离子交换基质。在另一实施方式中，化合物带正电，而离子交换基质是阳离子交换基质。

在再一实施方式中，本发明涉及纯化方法，其中化合物减少IEX中目的多肽中的杂质，其中在选择的纯化条件化合物由于相反于离子交换基质的电荷的电荷而结合于离子交换基质，由此通过减少结合于离子交换基质的杂质量多于结合于离子交换基质的目的多肽的量来增加目的多肽的结合特异性，且其中化合物以至少7mM的浓度使用。在一实施方式中，在所述方法中使用的化合物带负电，而在选择的纯化条件，离子交换基质是阴离子交换基质。在优选的实施方式中，化合物是EDTA或EGTA。

【发明详述】

现在会参照本发明的特定实施方式的细节。而会关联于编号的实施方式描述本发明，会明白，它们不旨在限制本发明到那些实施方式。相反，本发明旨在覆盖可包括在由权利要求定义的本发明的范围之内的全部替代体，修饰和相当体。本领域技术人员会认识类似或相当于本文所述的那些的可在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明不以任何方式限于描述的方法和材料。

除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本领域（例如在细胞生物学,化学和分子生物学）普通技术人员通常明白的相同的含义。

贯穿此说明书词汇"包含（comprise）"，或变异诸如"包含（comprises）"或"包含（comprising）"，会理解为暗示包括陈述的元件，整体或步骤，或元件，整体或步骤的组，但不排除任何其他元件、整体或步骤，或元件，整体或步骤的组。

贯穿此说明书，参照数值，除非另外陈述，需考虑"约"的数值。术语"约"用于指示，值包括用于测定值的装置和方法的误差的固有变异，或研究客体之中存在的变异。

温度值是在标准压力条件（1atm）下给出的。

本发明基于惊人发现，在IEX期间，可将化合物加入平衡液和/或样品液和/或洗涤液，其和目的多肽与离子交换基质的结合及杂质与离子交换基质的结合竞争。意外地发现，由此在IEX期间，更少杂质结合于离子交换基质，且与基质结合的目的多肽和一种或更多杂质的比增加，由此也在洗脱液中，目的多肽与一种或更多杂质的比增加。

在一实施方式中，本发明涉及通过离子-交换层析纯化目的多肽的方法，其中将化合物以至少7mM的浓度加入：

（a）离子交换基质的平衡液，其中调整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质；

和/或

（b）应用于离子交换基质、且包含目的多肽的装载液，其中调整装载液，使得装载液中的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质；

和/或

（c）一旦目的多肽由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而已结合于离子交换基质时，用于洗涤离子交换基质的洗涤液，其中调整洗涤液，使得洗涤液中的至少部分化合物由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质，且使得至少部分目的多肽和至少部分已结合的化合物，如果是在步骤（a）或（b）添加的，由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而继续结合于离子交换基质，

由此在洗脱离子交换基质之前，相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量，且由此导致相比以7mM以下的浓度添加化合物的同一方法，洗出液中增加的目的多肽与一种或更多杂质的比。

优选的化合物浓度是至少7mM或至少10mM，或至少15mM，或至少20mM或至少25mM或至少30mM或至少32mM或至少40mM或至少50mM。

在一实施方式中，离子交换基质是阴离子交换基质。

在一实施方式中，离子交换基质是阳离子交换基质。

在优选的实施方式中，化合物上的负电荷或正电荷聚集。

在本发明的更多优选的实施方式中，带负电荷的化合物具有结合金属阳离子的能力，且甚至更优选是包含五-乙酸基和它们的各种盐的化合物或包含四-乙酸基和它们的各种盐的化合物或包含三-乙酸基和它们的各种盐的化合物或包含二-乙酸基和它们的各种盐的化合物或包含多个胺基和它们的各种盐的化合物或包含多个氢硫基和它们的各种盐的化合物或膦酸和其衍生物及它们的各种盐。

本发明的方法减少杂质，其中杂质包含宿主细胞蛋白和/或宿主细胞核酸和/或产物-相关的混杂物和/或病毒和/或朊病毒和/或内毒素和/或方法-相关的混杂物。

在本发明的另一实施方式中，目的多肽在IEX期间具有聚集的电荷。在优选的实施方式中，目的多肽能结合金属离子。在本发明的甚至更优选的实施方式中，目的多肽是维生素K-依赖性多肽。

本发明也涉及化合物用于减少通过离子-交换层析的目的多肽纯化中的杂质的用途，其中将化合物添加于：

和/或

（c）一旦目的多肽由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而已结合于离子交换基质时，用于洗涤离子交换基质的洗涤液，其中调整洗涤液，使得洗涤液中的至少部分化合物由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质，且使得至少部分目的多肽和至少部分已结合的化合物，如果是在步骤（a）或（b）添加的，继续结合于离子交换基质，

由此在洗脱离子交换基质之前，相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质的量，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量，由此相比不添加化合物而进行目的多肽的纯化，导致洗出液中增加的目的多肽与一种或更多杂质的比。

本文所用的术语"多肽"是指由通过肽键连接在一起的5个或更多氨基酸组成的聚合物。

本文所述的术语"重组多肽"指称通过重组方法产生的多肽。

本文所用的术语"氨基酸"包括天然的和非-天然存在的氨基酸，后者通常能在重组多肽合成期间掺入或由翻译后修饰得到。

术语"纯化的"或"分离物"是指，目的多肽已从其天然的环境或宿主除去，及关联的杂质减少或去除，使得目标分子是存在的主要物质（例如,基于摩尔，在组合物/溶液中其相比任何其他个体物质更丰富）。一般而言，包含纯化的重组目的多肽的组合物是这样的组合物，其中目的肽代表存在的全部大分子物质的至少30%w/w，优选至少50，60，70或75%w/w。基本上纯的组合物会包含多于80～90%w/w的目的重组肽。

"目的多肽"在本发明的意义中指称期望根据本发明的方法从混合物纯化的多肽。通常，该目的多肽可为商业上售的及需要特定程度的纯度。优选的类型的目的多肽是治疗性多肽，其可为，例如，分泌的多肽。治疗性多肽包括抗体，抗体的抗原-结合片段，可溶性受体，受体融合体，细胞因子，生长因子，酶或凝血因子，其中一些更详细描述于下文。优选的目的多肽是维生素K-依赖性多肽。以上多肽列表仅旨在例示，及未旨在限制性描述。本领域普通技术人员会明白，可根据本发明使用任何多肽，且能选择待根据需要产生的特定多肽。

术语"层析"指称在混合物中的目的多肽通过经过吸附剂的混合物渗滤从在混合物中的其他溶质分离的过程，所述吸附剂在过程的特定缓冲条件下，由于溶质性质更或欠强烈吸附或保留溶质，诸如pI，疏水性，尺寸和结构。术语"层析"的使用包括柱和膜类型。

术语"离子交换"和"离子-交换层析(IEX)"指称层析过程，其中可离子化的目的溶质（例如,混合物中的目的多肽）与连接（例如,通过共价连接）到固相离子交换材料的带反电荷的配体，在适当的pH和导电率条件下相互作用，使得目的溶质与大或小于混合物中的溶质杂质或混杂物的带电的化合物非特异性相互作用。在混合物中的混杂溶质可相比目的溶质更快或更慢自离子交换材料柱洗涤或结合到基质或自基质排除。"离子-交换层析"特别包括阴离子-交换层析（AEX），阳离子交换层析（CEX），及混合的模式层析，其中混合的模式的部分是AEX或CEX。

短语"离子交换材料"或“离子交换基质”指称带负电的（即阳离子交换基质）或带正电的（即阴离子交换基质）的固相。在一实施方式中，电荷可通过将一种或更多带电的配体（或吸附剂），例如通过共价连接附接到固相来提供。或者，或此外，电荷可为固相的固有性质（例如作为氧化硅的情况,其具有总体负电荷）。许多离子交换基质的电荷是pH依赖性的，而本领域技术人员可调整纯化过程，使得相应离子交换基质负荷。

在本发明中使用的"缓冲剂"是通过通过其酸-碱缀合组分的作用添加酸或碱来抵抗pH变化的溶液。在本发明的方法中采用的各种缓冲剂可依赖于期望的缓冲剂pH和纯化方法中的特定步骤［见Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,ed.Calbiochem Corporation(1975)］。可用于控制本发明的方法期望的pH范围的缓冲剂组分的非限制性例包括乙酸盐，柠檬酸盐，组氨酸，磷酸盐，铵缓冲剂诸如乙酸铵，琥珀酸盐，MES，CHAPS，MOPS，MOPSO，HEPES，Tris，等，以及这些的组合。TRIS-苹果酸-NaOH，马来酸盐，氯代乙酸盐，甲酸盐，苯甲酸盐，丙酸盐，吡啶，哌嗪，ADA，PIPES，ACES，BES，TES，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，N-二(羟乙基)甘氨酸，TAPS，乙醇胺，CHES，CAPS，甲胺，哌啶，O-硼酸，碳酸，乳酸，丁二酸，二乙基丙二酸，甘氨酰甘氨酸，HEPPS，HEPPSO，咪唑，苯酚，POPSO，琥珀酸盐，TAPS，基于胺的，苄胺，三甲基或二甲基或乙基或苯基胺，乙二胺或吗啉。额外的组分（添加剂）可根据需要存在于缓冲剂中，例如，盐可用于调整缓冲剂离子强度，诸如氯化钠，硫酸钠和氯化钾；及其他添加剂诸如氨基酸（诸如甘氨酸和组氨酸），离液剂（诸如脲），醇（诸如乙醇,甘露糖醇,甘油和苄基醇），去污剂（见上），及糖（诸如蔗糖,甘露糖醇,麦芽糖,海藻糖,葡萄糖和果糖）。使用的缓冲剂组分和添加剂，及浓度，可根据在本发明中实施的层析类型而改变。

在本发明中使用的缓冲剂，包括卫生，平衡，装载，装载后洗涤，洗脱或脱离缓冲剂。在特定实施方式中，将去污剂加入洗涤缓冲剂。可在本发明中使用的去污剂的例包括，但不限于聚山梨酯（例如聚山梨酯20或80）；泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188）；Triton^TM；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-，椰油酰胺丙基-，亚油酰胺丙基-，肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱（例如月桂酰胺丙基）；肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺；钠甲基椰油酰-，或二钠甲基油基牛磺酸盐；MONAQUAT^TM系列（Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.）；Igepal CA-630^TM，Pluronic^TM，Triton^TM，BRIJ，Atlas G2127^TM，Genapol^TM，HECAMEG^TM，LUBROL PX^TM，MEGA^TM，NP^TM，THESIT^TM，TOPPS^TM，CHAPS，CHAPSO，DDMAU，EMPIGEN BB^TM，ZWITTERGENT^TM和C12E8^TM。可将去污剂加入任何工作缓冲剂，和也可包括在含有目的分子的补料中。去污剂可以适合于在多肽纯化方法中使用的任何量存在，例如，约0.001%～约20%和一般约0.01%～约1%。缓冲剂的pH和导电率可依赖于在纯化方法中的哪个步骤使用缓冲剂而改变。可使用在与选择的配体和基质/膜相容的pH下的任何适合的缓冲剂用于纯化目的多肽，诸如上述缓冲剂。在CEX中，缓冲剂的pH可为约3和10之间，更优选约pH4.0～9.0；导电率可为约0.1～40mS/cm，更优选约导电率0.5～15mS/cm，依赖于采用的纯化步骤和缓冲剂。在AEX中，缓冲剂pH可为约4～10，更优选约pH6.0～9.0；导电率可为约0.1～10.0mS/cm，更优选约0.5～5mS/cm，依赖于采用的纯化步骤和缓冲剂。

术语“平衡液”指称在应用含有目的多肽的液体之前应用于离子交换基质的液体。"平衡液"用于在用含有要纯化的目的多肽的混合物装载基质之前调整离子交换基质的pH和导电率。可用于此目的的适合的缓冲剂是本领域熟知的，例如，诸如上述缓冲剂，及包括与用于纯化目的多肽的层析步骤中使用的选择的基质相容的pH的任何缓冲剂。在特定实施方式中，用于AEX或CEX的平衡缓冲剂物质是基于MES或TRIS的磷酸盐，碳酸盐。用于AEX的一种优选的缓冲剂是MES。

平衡缓冲剂具有导电率和/或pH，使得目的多肽结合到基质或，使得目的多肽流经柱而一种或更多杂质结合于柱，依赖于是否使用AEX或CEX。在特定实施方式中，当层析培养基的pH和导电率分别在平衡缓冲剂的±0.2和±0.4mS/cm之内，更优选分别在平衡缓冲剂的±0.1和±0.2mS/cm之内时达到平衡。在CEX中，平衡缓冲剂的pH为约3～约9，更优选pH约4.0～约8.0，导电率约0.1～约40mS/cm，更优选约0.5～约10.0mS/cm。在AEX中，平衡缓冲剂的pH为约4～约10，更优选pH约6～9，导电率约0.1（WFI）～约10mS/cm，更优选导电率约0.5～约5mS/cm。当使用

HQ 50阴离子交换基质时，在分别约10～20mS/cm或更优选约15～18mS/cm的导电率下，优选的pH范围为约pH 4.5～5.5。

术语"装载液"指称含有待分离的目的多肽及一种或更多杂质的液体。装载液在本发明的操作条件下经过离子交换基质。"装载液"用于将含有目的多肽的混合物装载到柱。需知，如果将膜用作层析介质，则根据本领域中使用的常规方法使装载液与膜简单接触。可将任何适当的缓冲溶液用作装载液。在特定实施方式中，用于装载液的缓冲剂是碳酸盐，磷酸盐，MES或TRIS缓冲剂。对于AEX的装载液优选的缓冲剂基于碳酸盐或TRIS。对于AEX或CEX，选择装载液的导电率和pH，使得目的多肽结合到层析介质而多数混杂物能流过。用作装载液的适合的缓冲剂是本领域熟知的，例如，诸如上述那些。本领域普通技术人员应同意，AEX或CEX的装载液可使用与上述AEX或CEX的平衡缓冲剂相当的（如果不相同的）pH和导电率。当使用（R）HQ 50阴离子交换基质时，分别在10～20mS/cm或更优选15～19mS/cm和更优选17～19mS/cm的导电率下，优选的pH范围是pH7.0～8.0。

本文所用的术语"洗涤液"，指称用来在洗脱目的多肽之前自层析基质去除杂质的液体（例如,当使用柱时）。术语"洗涤"，及其语法变异，用于描述适当的洗涤液通过层析基质或在层析基质上经过。如果期望，洗涤，平衡和装载液可为相同的。AEX或CEX中使用的洗涤液的pH和导电率是，使得一种或更多杂质从基质洗脱而基质保留目的多肽。如果期望，洗涤液可含有以上描述的去污剂，诸如聚山梨酯。选择洗涤液的pH和导电率对于去除HCP和其他混杂物而不显著洗脱目的多肽是重要的。选择洗涤液的pH和导电率，使得目的多肽保留在方法中使用的AEX或CEX基质中。以上描述了适合于用于洗涤液的缓冲剂的例。在特定实施方式中，洗涤缓冲剂基于磷酸盐，碳酸盐，MES或TRIS。AEX中优选的洗涤缓冲剂是MES。

AEX或CEX中使用的洗涤液pH可为约3～约10，更优选pH约4～约9；及导电率约0.1～约40mS/cm，更优选约3～约30mS/cm。使用

HQ 50阴离子交换基质，pH优选是4.5～5.5之间和导电率是优先约15～25mS/cm和更优选的21～23mS/cm和甚至更优选约22mS/cm。

术语"洗脱液"，如本文所用，指称用来自AEX或CEX基质洗脱目的多肽的缓冲剂。术语"洗脱"和其语法变异，指称分子，例如，目的多肽，自层析物质通过使用适当的条件移出，所述条件例如，改变周围层析材料的缓冲剂的离子强度或pH，通过添加配体的竞争性分子，通过改变分子疏水性或通过变化配体的化学性质（例如电荷），使得目的多肽不能结合基质，且因此自层析柱洗脱。选择洗脱缓冲剂的pH和导电率，使得目的多肽从方法中使用的AEX或CEX基质洗脱。以上描述了适合于用作洗脱缓冲剂的缓冲剂例。在特定实施方式中，洗脱缓冲剂基于磷酸盐或TRIS。

术语"洗出液"指称包含目的多肽的液体，其在目的多肽结合于层析材料和添加洗脱液之后洗脱目的多肽而获得。

AEX或CEX中使用的洗脱缓冲剂的pH可为约3～约10，更优选pH约4～约9；及导电率约0.1～约40mS/cm，更优选导电率约5～约30mS/cm。使用

（R）HQ 50阴离子交换基质，优选的pH在8.0和9.0之间及优选的导电率是约17～27mS/cm和更优选的约22～24mS/cm和甚至更优选约22.5～23mS/cm之间。

常常是，在洗涤及洗脱之间或之后必需变化pH，洗涤缓冲剂或洗脱缓冲剂可导入不与在前洗涤缓冲剂或平衡缓冲剂相容的化合物。在该环境中，可有利地导入“再平衡步骤”，其目的是变化移动相的pH而维持目的蛋白的结合的状态，或在导入其不相容的对应物之前洗涤出一种化合物。

如果需要，额外的溶液可用于制备用于再使用的柱。例如，"再生溶液"可用于自纯化方法中使用的柱"脱离"或去除紧密结合的混杂物。一般而言，再生溶液具有足以基本上自基质去除任何余下杂质和目的多肽的导电率和pH。

在本发明的意义中“调整”是指设置在IEX的特定步骤的操作参数。此包括调整特定pH，特定导电率，特定温度，特定流速和调节本领域技术人员知道的IEX的其他参数。设置参数，使得平衡液和/或装载液和/或洗涤液中的至少部分化合物结合于离子交换基质。

在本发明的意义中，术语"杂质"指称存在于溶液诸如装载液中的任何外源或不期望的分子。杂质可为生物学大分子，诸如核酸如DNA或RNA，或除了要纯化的目的多肽之外的多肽，其也存在于要纯化的目的多肽样品中。杂质包括，例如，不期望的多肽变体，诸如聚集的多肽，错折叠的多肽，错二硫键键合的多肽，高分子量物质，低分子量物质和片段，及脱酰氨基化的物质；自分泌要纯化的多肽的宿主细胞的其他多肽，宿主细胞DNA，自细胞培养基的组分，病毒，朊病毒，内毒素，方法相关的混杂物，其可为是在当前纯化步骤期间浸出到样品的用于亲和层析的部分吸收剂的分子，例如，多肽A；核酸；或前述之任何片段。

“相对于结合于离子交换基质的一种或更多杂质，增加结合于离子交换基质的目的多肽的量”是指，结合于离子交换基质的目的多肽的分子数与结合于离子交换基质的一种或更多杂质的分子数的比对比装载液中目的多肽的分子数与一种或更多杂质的分子数的比增加。

“洗出液中增加的目的多肽与一种或更多杂质的比”是指，洗出液中目的多肽的分子数与一种或更多杂质的分子数的比对比装载液中目的多肽的分子数与一种或更多杂质的分子数的比增加。

“CHOP减缩因数”是指一方面在洗脱液中目的蛋白的质量与CHOP（中国仓鼠卵巢细胞蛋白）的质量的比除以另一方面在装载液中目的蛋白的质量与CHOP的质量的比。换言之CHOP减缩因数是：

（洗脱液中质量_目的蛋白/质量_CHOP）/(装载液中质量_目的蛋白/质量_CHOP）。

“CHOP减缩因数的升高”是指相比当在相同的纯化方法中，在与使用化合物的相同的条件下，不加入化合物时的CHOP减缩因数，根据本发明使用化合物时CHOP减缩因数的百分率的增加。例如，当用不同离子交换基质或用不同目的蛋白根据本发明使用不同化合物时，CHOP减缩因数的升高可为11%或16%或38%或52%或60%或89%或150%或165%或223%或265%或563%或1200%或1325%或1663%。

“CHOP清除因数”是装载液中CHOP的质量与洗脱液中CHOP的质量的比。

本文使用的“至少部分”指称存在于相应液体或流体或结合到离子交换基质的化合物或目的多肽的总量的特定百分率。此特定百分率是至少5%，或至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少96%，或至少97%或至少98%，或至少99%。其指称例如，当添加到平衡液中时，结合于离子交换基质的化合物量，或当添加到装载液中的离子交换基质时，结合于离子交换基质的化合物量或目的多肽量。

在本发明的意义中"阴离子交换基质"指称在蛋白结合时带正电，由此具有附着于其的一种或更多带正电的配体的固相。可使用适合形成阴离子交换基质的附着于固相的任何带正电的配体，诸如季氨基。例如，在AEC中使用的配体可为季铵，诸如季烷胺和季烷醇胺，或胺，二乙胺，二乙基氨基丙基，氨基，三甲基铵乙基，三甲基苄基铵，二甲基乙醇苄基铵，及聚胺。或者，对于AEC而言，可使用具有带正电的配体，诸如上述配体的膜来代替阴离子交换基质。

可商购的阴离子交换基质包括，但不限于，自Applied Biosystems的DEAE纤维素，自GE HEALTHCARE的

PI 20，PI 50，HQ 10，HQ 20，HQ 50，D 50；

MiniQ，Source^TM 15Q和3OQ，Q，DEAE和ANX琼脂糖

Fast Flow，Q琼脂糖

高性能，QAESEPHADEX^TM和FAST Q琼脂糖自J.T.Baker的WP PEI，WPDEAM，WP QUAT；自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA；自Biorad的UNOsphere^TM Q，

DEAE和

Q；自Pall Technologies的Ceramic

Q，陶瓷

DEAE，Q

M和LS DEAE，

LS DEAE，QMALS，QMAM；自Dow Liquid Separations的

细网孔强碱I型和II型阴离子基质和

MONOSPHER E 77，弱碱阴离子；自Millipore的Matrex Cellufine A200，A500，Q500和Q800；自EMD的

EMD TMAE₃

EMD DEAE和

EMD DMAE；自Sigma-Aldrich的Amberlite^TM弱和强阴离子交换物I和II型，

弱和强阴离子交换物I和II型，Diaion弱和强阴离子交换物I和II型，

自Tosoh的TSK凝胶Q和DEAE 5PW和5PW-HR，

SuperQ-650S，650M和650C₃QAE-55OC和650S，DEAE-65OM和650C；及自Whatman的QA52，DE23，DE32，DE51，DE52，DE53，Express-Ion^TM D和Express-Ion^TM Q。

如果期望，可使用阴离子交换膜来代替阴离子交换基质。可商购的阴离子交换膜包括，但不限于，自Sartorius的

Q；自Pall Technologies的

Q和自Millipore的Intercept^TM Q膜。

术语“化合物”指称这样的化合物，其通常是具有1000Da以下的分子量的小分子，其当在IEX中于特定pH使用时是带电的，且在特定pH与目的多肽和与杂质竞争结合于离子交换基质。具有结合金属离子的能力的优选的化合物如下文所列。

在本发明的意义中，术语“聚集的”是指负电荷的非平均分布，意指在化合物中有负电荷的局部浓度。

"阳离子交换基质"指称是在蛋白结合时带负电，且具有用于与经过或通过固相的水溶液中的阳离子交换的游离的阳离子的固相。可使用适合于形成阳离子交换基质的附接于固相的任何带负电的配体，例如，羧酸酯，磺酸酯和下文描述的其他。可商购的阳离子交换基质包括，但不限于，例如，具有基于磺酸酯的基团的那些（例如，自GEHEALTHCARE的

MiniS，Source^TM 15S和30S，SP琼脂糖

Fast Flow^TM，SP琼脂糖

高性能；自Tosoh的

SP-650S和SP-650M；自BioRad的High S；自Pall Technologies的Ceramic

S，

M和LS SP和

LSSP）；基于磺乙基的基团（例如，自EMD的

SE；自AppliedBiosystems的

和S-20）；基于磺丙基的基团（例如,自Tosoh的TSK

SP 5PW和SP-5PW-HR；自Applied Biosystems的

HS-20和HS 50）；基于磺基异丁基的基团（例如,自EMD的

EMD SO3）；基于磺氧基乙基的基团（例如,自Whatman的SE52,SE53和Express-离子^TM S），基于羧甲基的基团（例如,自GE HEALTHCARE的CM琼脂糖Fast Flow；自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM；自BioRad的CM；自PallTechnologies的Ceramic

CM,Trisacryl M CM,TrisacrylLS CM；自Millipore的Matrex Cellufine C500和C200；自Whatman的CM52,CM32，CM23和Express-离子^TM C；自Tosoh的

CM-650S，CM-650M和CM-650C）；基于磺酸和羧酸的基团（例如自J.T.Baker的

羧基-Sulfon）；基于羧酸的基团（例如,自J.T Baker的WP CBX；自Dow Liquid Separations的

MAC-3；自Sigma-Aldrich的Amberlite^TM弱阳离子交换物,

弱阳离子交换物,及Diaion弱阳离子交换物和自EMD的

EMD COO-）；基于磺酸的基团（例如,自Dow Liquid Separations的Hydrocell SP自Biochrom Labs Inc.,

细网孔强酸阳离子基质；自J.T.Baker的

S,WP Sulfonic；自Sartorius的S膜；自Sigma-Aldrich的Amberlite^TM强阳离子交换物,

强阳离子和Diaion强阳离子交换物）；及基于正磷酸的基团（例如,自Whatman的Pl 1）。如果期望，可使用阳离子交换膜来代替阳离子交换基质，例如，

S（Sartorius;Edgewood,NY）。

在本发明的意义中，术语“络合金属离子的能力”是指在化合物或目的多肽和金属离子之间形成络合物的能力。络合物形成包括多齿配体，即化合物或目的多肽和单中心原子之间2或更多分离的结合的形成。通常该化合物是有机化合物，及称之为螯合剂（chelant），螯合剂（chelator），螯合剂（chelating agent），或螯合剂（sequesteringagent）。化合物与单中心原子（可为金属离子）形成螯合络合物。螯合络合物与具有单齿配体的配位络合物成对比，其与中心原子形式仅一个键。说到非限制性例，以下剂是根据本发明具有络合金属离子的能力的化合物：

（a）包含五-乙酸基和它们的各种盐的化合物，如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA或喷替酸），Pentetide，Ino-1和Fura-2；

（b）包含四-乙酸基和它们的各种盐的化合物，如1,2-双(o-乙烷-N,N,N',N'-四-乙酸(BAPTA)，乙二胺四-乙酸(EDTA)及其各种盐（如EDTA二铵,EDTA二钾二水合物;EDTA二钠;EDTA三钠;EDTA四钠和四铵EDTA）和乙二醇四-乙酸（EGTA）；

（c）包含三-乙酸基和它们的各种盐的化合物，如N-(羟乙基)乙二胺三-乙酸（HEDTA）及次氮基三乙酸（NTA）；

（c）包含三-乙酸基和它们的各种盐的化合物，如N-(羟乙基)乙二胺三-乙酸（HEDTA）和（NTA）；

（d）包含二-乙酸基和它们的各种盐的化合物如亚氨基二乙酸（IDA），亚氨基二琥珀酸四钠，柠檬酸三钠及

（e）包含多个胺基的化合物，如氨基乙基-乙醇胺（AEEA），2,3-二苯基乙二胺，亚乙基-二胺，乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯基乙酸)亚乙基-二胺-N，N'-二琥珀酸，四羟丙基乙二胺，三乙四胺及聚氨基羧酸

（f）包含多个氢硫基的化合物，如二巯丙醇，二巯基琥珀酸（DMSA），二巯基-1-丙磺酸（DMPS），二乙基二硫代氨基甲酸钠

（g）膦酸和其衍生物及它们的各种盐，如氨基三(亚甲基膦酸)（ATMP），二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，乙二胺四(亚甲基膦酸（EDTMP），依替膦酸或1-羟基乙烷1,1-二膦酸（HEDP）。

需知，将特定化合物列为离子或特定盐也包括不同盐中的离子。

在本发明的意义中，以下络合剂也是具有络合金属离子的能力的化合物。乙酰丙酮酸，乙酰丙酮，苯并三唑，2,2'-二吡啶，4,4'-二吡啶，1,2-双(二甲基-胂基)苯1,2双(二甲基-膦基)乙烷，1,2-双(二苯基膦基)-乙烷，苯并三唑，笼形螯合物，2.2.2-穴状配体，儿茶酚，Corrole，冠醚，18-冠-6，穴状配体，环楞胺，环糊精，地拉罗司，去铁酮，去铁胺，右雷佐生，二乙醇二甲醚，二甲基乙二肟，二硫杂环戊烯，乙烷二醇，依替膦酸，铁络环肽，葡萄糖酸，金属冠醚，水解的酪蛋白，六氟乙酰丙酮，青霉胺，邻菲罗啉，膦酸，植物螯合素，卟吩，卟啉，焦磷酸，蝎合物配体，钠聚(天冬氨酸)，三联吡啶，四苯基-卟啉，1,4,7-三氮杂环壬烷，三偏磷酸三磷，及1,4,7-三硫杂环壬烷。

在本发明的意义中，本发明的尤其优选的实施方式是使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为化合物的方法。EDTA是具有式[CH2N(CH2CO2H)2]2的聚氨基羧酸。因为其作为螯合剂的作用，即其"隔绝"金属离子诸如Ca²⁺和Fe³⁺的能力，其变得有用。在被EDTA结合之后，金属离子保持在溶液中，但呈现减小的反应性。EDTA作为几种盐产生，显著地，EDTA二钠和EDTA钙二钠。分子量是292.24Da。在配位化学中，EDTA^4-是聚氨基羧酸配体家族的成员。EDTA^4-通常通过其2个胺和4个羧酸结合于金属阳离子。得到的配位化合物之许多采用八面体几何形状。EDTA也能结合于AEX基质的阳离子电荷。

本发明的方法以7mM和化合物导入平衡液或样品液或洗涤液的导电率高得目的多肽的结合不再发生的浓度之间的浓度使用化合物如EDTA。对于给定化合物及给定目的多肽的各个体组合，本领域技术人员可容易确定此化合物量的最大浓度。对于EDTA而言，本发明的方法的优选的浓度是至少7mM或至少10mM，或至少15mM，或至少20mM或至少25mM或至少30mM或至少32mM或至少40mM或至少50mM。对于EDTA而言，平衡液或样品液或洗涤液的导电率对于有效目的多肽的结合变得太高的范围起始于约200mM。因此，优选的本发明的方法使用达200mM EDTA，或达190mM，或达180mM或达170mM或达160mM或达150mM或达140mM或达130mM。需知，公开的EDTA的浓度的下限范围可与公开的上限浓度组合而形成优选的浓度范围，如7mM～200mM，7mM～190mM，7mM～180mM...或10mM～200mM，或10mM～190mM，或10mM～180mM.....，或15mM～200mM或15mM～190mM或15mM～180mM。

本发明的也尤其优选的实施方式是使用乙二醇四-乙酸（EGTA）作为化合物的方法。

可根据本发明在通过CEX纯化目的多肽中使用的阴离子化合物的例是伯胺和阳离子氨基酸聚合物，诸如四亚乙基五胺（TEPA），二甲基吡啶胺（DPA），聚-赖氨酸，聚-精氨酸和聚-组氨酸。

待通过本发明的方法纯化的优选的多肽带电，且具有优先聚集的电荷或包含以上所列的化合物的官能团，如胺或氢硫基，其能贡献于强结合于离子交换基质。优先这些官能团也聚集。

术语"宿主细胞多肽"，或"HCP"，指称源于表达靶多肽（包括任何自宿主细胞的基因组表达的多肽或重组表达的多肽，且不被认为是靶多肽）的宿主细胞的代谢（细胞内和细胞外）的任何多肽。宿主细胞可为能表达靶多肽的任何细胞，特别是哺乳动物（例如,CHO和鼠骨髓瘤细胞系诸如NSO），昆虫细菌，植物和酵母细胞系。在本发明的特定实施方式中，HCP是"中国仓鼠卵巢细胞多肽"，或"CHOP"，其指称源于中国仓鼠卵巢（"CHO"）细胞培养的任何宿主细胞多肽（"HCP"）。HCP通常在含有目的多肽的细胞培养基或裂解产物［(例如，收获的细胞培养液("HCCF")］中作为杂质存在。在包含目的多肽的混合物中存在的HCP的量提供目的多肽的纯度的程度的量度。一般而言，在多肽混合物中HCP的量以相对于在混合物中目的多肽量的百万分之几表达。因此，在一些实施方式中，含有产物的洗出液具有小于100ppm，或小于90ppm，或小于80ppm，或小于70ppm，或小于60ppm，或以小于50ppm，或小于40ppm，或小于30ppm，或小于20ppm，或小于10ppm或小于5ppm的HCP。

HCP组成极其异源和依赖于使用的多肽产物和纯化方法。在任何治疗性用途的生物学产品的销售批准之前，产品中混杂多肽（诸如HCP）的水平必需根据ICH和FDA指南定量测量。

以上讨论的宿主细胞多肽，如果使用人细胞系来产生目的多肽，则可为人多肽，或如果使用非-人细胞系来产生目的多肽，则可为非-人多肽。在本发明中的一方面，多肽混杂物是宿主细胞多肽，诸如维生素K-依赖性多肽。宿主细胞多肽的特别关联类别是含有Gla-结构域的多肽，诸如GAS-6，多肽S，因子II（凝血酶原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽1，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽2，跨膜γ羧基谷氨酸多肽3，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽4，基质Gla多肽，及骨钙素。

如上所述，维生素K-依赖性目的多肽是选自因子VII多肽，因子IX多肽，因子X多肽及活化的多肽C的一般维生素K-依赖性凝血因子。在一个更特定实施方式中，维生素K-依赖性目的多肽是因子IX多肽。在另一更特定实施方式中，维生素K-依赖性目的多肽是因子VII多肽。在另一特定实施方式中，维生素K-依赖性目的多肽是因子X多肽。

在另一实施方式中，本发明提供由人维生素K-依赖性多肽分离非-人多肽混杂物的方法。在本发明中的一方面，非-人多肽混杂物也是维生素K-依赖性多肽。在再一方面，非-人多肽混杂物是仓鼠多肽。

术语"百万分之"或"ppm"互换使用，以指称通过本发明的方法纯化的目的多肽纯度的量度。单位ppm指称以ng/ml的HCP/以mg/ml的目的多肽的量，其中多肽在溶液中（即,上例中描述的,HCPppm=(CHOP ng/ml)/(目的多肽mg/ml)）。当多肽经干燥时，诸如通过冷冻干燥，ppm指称(HCP ng)/(目的多肽mg)。

有测定宿主细胞蛋白（HCP）水平的不同方法。自目的多肽鉴定失败及足够去除HCP可导致减少的功效和/或不利的患者反应。一种方法是涉及ELISA的"HCP ELISA"，其中在测定中使用的第2抗体特异于由用来产生抗体的细胞，例如，CHO细胞所产生的HCP。第2抗体可根据本领域技术人员知道的常规方法产生。例如，第2抗体可使用通过假产生和纯化运行获得的HCP产生，即，使用用来产生目的抗体的相同的细胞系，但细胞系未经抗体DNA转染。在例示实施方式中，第2抗体使用类似于在选择的细胞表达系统，即，用来产生靶抗体的细胞表达系统中表达的那些的HCP来产生。

一般而言，HCP ELISA包括将将包含HCP的液体样品夹在抗体，即，第1抗体和第2抗体的2层之间。样品经温育，期间样品中的HCP被第1抗体，例如，亲和性纯化的山羊抗-CHO（Cygnus）捕获。添加特异于自用来产生抗体，例如，生物素化的抗-CHO HCP的细胞产生的HCP的标记的第2抗体，并结合于样品之中的HCP。样品中含有的HCP量使用基于第2抗体的标记物的适当的测试来测定。可使用HCP ELISA来测定在抗体组合物，诸如使用以上部分III描述的方法获得的洗出液或流通中HCP的水平。本发明也提供包含抗体的组合物，其中组合物无通过HCP酶联免疫吸附测定（"ELISA"）测定的可检测的水平的HCP。

术语“宿主细胞核酸”是指存在于表达目的多肽的宿主细胞中的任何多核苷酸例如RNA或DNA。核酸分子可为单链或双链。

术语“产物相关的混杂物”涉及降解产物，聚集物或错折叠的或另外变性的形式的目的多肽，其不是期望的和应从最终纯目的多肽除去。可减少的一种特定目的降解产物是FIX纯化中的FIXα。

术语“病毒”包括DNA或RNA病毒。这些病毒可被磷脂膜包裹或非-包裹。

术语“朊病毒”涉及传染性错折叠的蛋白。这些错折叠的蛋白可导致正确地折叠的版本的蛋白本身成为错折叠的。

术语“内毒素”是指源于细胞膜的脂多糖。

术语“方法相关的杂质”涉及任何分子尤其在方法中添加的蛋白。通过非限制性例的方式，该方法相关的杂质可为例如自来自上游免疫亲和性纯化的单克隆抗体的蛋白A，聚山梨酯-80，三-n-磷酸丁酯或浸出的配体。

术语"收获的细胞培养液"，是指已通过包括离心或过滤的手段去除细胞的原核生物或真核细胞培养液。细胞培养是原核生物或真核细胞在受控条件下生长的方法。

术语"细胞培养"指称源于多细胞真核生物的细胞，包括动物细胞或单细胞原核生物，包括细菌和酵母的培养。真核细胞培养包括哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞，杂交瘤和昆虫细胞。用适当的细胞培养容器，分泌的多肽可从固着依赖性细胞或悬浮液细胞系得到。哺乳动物细胞培养物包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。

术语"减少的"指称物质的减少或渐小的量。减少的制备物包括具有相对于初始量少的物质，诸如HCP的制备物。在一实施方式中，物质是杂质或混杂物。在一实施方式中，术语"减少的"是指实质上少物质。在另一实施方式中，术语"减少的"是指无物质的量。在一实施方式中，无物质的量包括使用本文所述的测定"无可检测的量"。

术语"基本上无"包括无物质量，但也可包括物质的最小量。在一实施方式中，无物质的量包括使用本文所述的测定"无可检测的量"。

术语"去污剂"指称对于防止多肽聚集及防止混杂物与目的多肽的非特异性相互作用或结合有用，且可以各种浓度存在的离子，两性离子和非离子表面活性剂。

"清洁"溶液一般用来在纯化方法之前，通过去除任何结合的混杂物，例如，生物学来源的那些来清洁柱层析中使用的基质。可使用任何期望缓冲剂用于此目的，只要其与根据本发明的方法选择的特定柱和基质相容。优选地，清洁溶液的pH高，例如，pH10或更大，更优选pH11或更大，且仍更优选pH12或更大；替代性地，清洁溶液的pH可低，例如pH 4或更小，更优选pH3或更小。在特定实施方式中，在本发明的方法中使用的基质使用包括1N NaOH，pH大于12的清洁溶液清洁。

如本文所用，术语"导电率"指称水溶液在特定温度下在2个电极之间导电流的能力。电流经溶液中的离子运输流动。因此，随着存在于水溶液中的离子的增加量，溶液会具有更高导电率。在本发明的方法中，纯化一般进行的温度，在特定的pH范围之内，可为约4～约37℃，更优选约15～约25℃。

导电率的测量单位是milliSiemens/cm（mS/cm），且可使用标准导电率计测量。溶液的导电率可通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可改变溶液中的缓冲剂浓度和/或盐（例如NaCl或KCl）浓度，以便达到期望的导电率。优选地，如下例中描述，将盐浓度修饰为达到期望的导电率。相应流体的导电率不是本发明的必要的特征。本领域技术人员可用允许目的多肽和化合物结合于离子交换基质的平衡液，装载液或洗脱液中的标准实验导电率测定。

多肽的"pI"或"等电点"指称多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pI可根据各种常规方法，例如，由多肽上的氨基酸和/或唾液酸残基上的净电荷或通过使用等电聚焦来计算。

【维生素K-依赖性目的多肽】

本发明在广方面涉及维生素K-依赖性目的多肽的纯化及包含该多肽的特定纯化的组合物。本文应用术语"目的"作为与以最纯形式获得关联的特定物质（维生素K-依赖性多肽）的指标，例如在治疗性情景中使用维生素K-依赖性多肽的目的。

本文所述的方法可原理上可应用于任何维生素K-依赖性多肽的纯化，包含但不限于GAS-6，多肽S，因子II（凝血酶原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽1，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽2，跨膜γ羧基谷氨酸多肽3，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽4，基质Gla多肽，及骨钙素)，尤其是选自因子VII多肽，因子IX多肽，因子X多肽及活化的多肽C的维生素K-依赖性凝血因子。在一个特定实施方式中，方法用于在细胞培养，尤其是非-人细胞培养条件下产生的重组维生素K-依赖性目的多肽的纯化。

在一特定实施方式中，维生素K-依赖性目的多肽是因子IX多肽，诸如FIX或FIXa。

如本文所用，术语"因子IX多肽"和"FIX多肽"是指包含野生型人因子IX的氨基酸序列的任何多肽（即,具有美国专利No.4,994,37或欧洲专利No.EP 0107278中公开的氨基酸序列的多肽），其变体，以及因子IX-相关的多肽，因子VII衍生物和因子VII缀合物。此包括相对野生型人因子IX呈现基本上相同的或改善的生物学活性的因子IX变体，因子IX-相关的多肽，因子IX衍生物和因子IX缀合物。

人FIX，维生素K-依赖性多肽的组的成员是具有57kDa的分子量的单链糖蛋白，其作为415个氨基酸的无活性酶原由肝细胞分泌到血流。其含有定位于多肽的N-端Gla-结构域的12个γ-羧基-谷氨酸残基。Gla残基对于它们的生物合成需要维生素K。在Gla结构域之后，有2个表皮生长因子结构域，活化肽，及胰蛋白酶-型丝氨酸蛋白酶结构域。FIX的进一步翻译后修饰包括羟化（Asp 64），N-（Asn157和Asn167）以及O-型糖基化（Ser53,Ser61,Thr159,Thr169和Thr172），硫酸化（Tyr155），及磷酸化（Ser158）。

FIX将转化为其有活性的形式，因子IXa，通过在Arg145-Ala146和Arg180-Val181的活化肽的蛋白水解导致形成2个多肽链，N-端轻链（18kDa）和C-端重链（28kDa），它们通过一个二硫桥连接在一起。因子IX的活化切割可例如通过因子XIa或因子VIIa/TF体外达到。因子IX以5～10μg/ml的浓度存在于人血浆中。人中因子IX的末端血浆半衰期发现是约15～18小时（White GC et al.1997.Recombinant factor IX.Thromb Haemost.78:261-265;EwensteinBM et al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived andrecombinant F IX concentrates in previously treated patients withmoderate or severe hemophilia B.Transfusion 42:190-197）。

在另一实施方式中，本发明涉及自FIXα分离全长FIX的方法。FIXα是一种由在仅Arg145-Ala146活化位点FIX的切割得到的特异性蛋白水解破断产物。此形式的蛋白不可通过SEC分离，由于其经二硫键保持一起，且由此是FIX纯化中的特定问题。在本发明的一实施方式中，通过使用本发明的方法，FIXα量对比完整FIX量减少。

在另一特定实施方式中，维生素K-依赖性目的多肽是因子VII多肽，诸如因子VII-相关的多肽，或因子VII衍生物，或因子VII缀合物，尤其是人因子VII多肽，尤其是人野生型因子VII或野生型人因子VIIa。

如本文所用，术语"因子VII多肽"和"FVII多肽"是指任何包含野生型人因子VIIa的氨基酸序列1～406的多肽（即,具有美国专利No.4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽），其变体以及因子VII-相关的多肽，因子VII衍生物和因子VII缀合物。此包括相对于野生型人因子VIIa呈现基本上相同的或改善的生物学活性的因子VII变体，因子VII-相关的多肽，因子VII衍生物和因子VII缀合物。

FVII是具有约50kDa的分子量的单链糖蛋白，其作为406个氨基酸的无活性酶原由肝细胞分泌到血流。其含有定位于蛋白的N-端Gla-结构域的10个γ-羧基-谷氨酸残基（第6,7,14,16,19,20,25,26,29和35位）。Gla残基需要维生素K用于它们的生物合成。位于Gla结构域的C-端的是2个表皮生长因子结构域，之后是胰蛋白酶-型丝氨酸蛋白酶结构域。FVII的进一步翻译后修饰包括羟化（Asp 63），N-（Asn145和Asn322）以及O-型糖基化（Ser52和Ser60）。

FVII通过在Arg152-Ile153的单肽键的蛋白水解转化为其有活性的形式因子VIIa，导致形成2个多肽链，N-端轻链（24kDa）和C-端重链（28kDa），它们通过一个二硫桥连接在一起。与其他维生素K-依赖性凝血因子相反，对FVII未描述在这些其他维生素-K依赖性凝血因子的活化期间切割下的活化肽。Arg152-Ile153切割位点和一些氨基酸下游显示与其他维生素K-依赖性多肽的活化切割位点的同源性。

【重组表达】

多肽的重组产生可使用各种技术达到。一般将目的多核苷酸序列克隆进"表达载体"。载体可为质粒载体，病毒载体，或任何其他适应于插入外源序列的适合的媒质，根据需要将它们的导入真核或原核生物细胞和表达导入的序列。一般载体包括宿主细胞中融合多肽表达需要的转录/翻译控制序列，诸如启动子，核糖体结合位点，起始密码子，终止密码子，任选地操作子序列和可能的其他调控序列诸如增强子。

适合于产生本发明的重组多肽的重组表达载体一般包括一种或更多调控序列，基于用于表达的宿主细胞选择，可操作地连接到编码待表达的融合多肽的核酸序列。本领域技术人员会同意，表达载体的设计可依赖于因素，如待转化的宿主细胞的选择及期望的肽表达水平。载体DNA可经常规转化或转染技术导入原核生物或真核细胞。用于制备重组载体，使用复制载体转化宿主细胞，及以生物学方式表达有活性的外源多肽的方法和材料是本领域通常熟知的。本发明的重组多肽也可在无细胞的系统中产生。

也可设计重组目的多肽，从而它们是细胞外分泌的和/或运输到细胞内的特定位置。例如，重组肽可设计为运输到细胞器，诸如植物细胞的质体或液泡或其他类型的非-膜细胞器或包含诸如存在于原核生物的那些。本领域通常知道用于靶向肽到细胞外或细胞位置的方法。例如，重组肽和/或载体构建体可设计为包括致使细胞运输的靶向序列和/或翻译后修饰。该运输可为翻译后或共翻译。

重组目的多肽也可在特定细胞器或细胞位置，诸如质体产生。本领域技术人员已知用于达到在期望的位置的表达的适当的方法，且包括，例如具有适合的启动子和其他根据需要具有的5’和3’控制序列的重组肽和/或载体的设计。

除了原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是对于编码多肽的载体适合的克隆或表达宿主。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），或常见的面包酵母，是其中最常使用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属，物种和株是通常可利用的和有用的，诸如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）；克鲁维酵母属（Kluyveromyces）宿主诸如，例如，乳克鲁维酵母（K.lactis），脆壁克鲁维酵母（K.fragilis）（ATCC 12,424），保加利亚克鲁维酵母（K.bulgaricus）（ATCC 16,045），威克曼氏克鲁维酵母（K.wickeramii）（ATCC 24,178），瓦尔提克鲁维酵母（K.waltii）（ATCC56,500），果蝇克鲁维酵母（K.drosophilarum）（ATCC 36,906），耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）及马克思克鲁维酵母（K.marxianus）；耶氏酵母属（Yarrowia）（EP 402,226）；巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）（EP 183,070）；念珠菌属（Candida）；瑞氏木霉（Trichoderma reesei）（EP 244,234）；粗糙链孢霉（Neurosporacrassa）；许旺氏酵母属（Schwanniomyces）诸如西方许旺氏酵母（Schwanniomyces occidentalis）；及丝状真菌诸如，例如，链孢霉属（Neurospora），青霉属（Penicillium），弯颈霉属（Tolypocladium）和曲霉属（Aspergillus）宿主，诸如沟巢曲霉（A.nidulans）及黑曲霉（A.niger）。表达糖基化的抗体的适合的宿主细胞源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的例包括植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体及对应允许的自宿主的昆虫宿主细胞，诸如草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda），埃及伊蚊（Aedes aegypti），白条伊蚊（Aedesalbopictus），黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），及家蚕蛾（Bombyxmori）。转染的各种病毒株是以公共渠道可利用的，例如，苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）NPV的L-I变体和家蚕蛾（Bombyx mori）NPV的Bm-5株，且可将该病毒根据本发明用作病毒，特别用于转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞。也可将棉花，玉米，马铃薯，大豆，牵牛花，番茄和烟草的植物细胞培养物用作宿主。

用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞,描述于Urlaub和Chasin，（1980）PNAS USA 77:4216-4220,以DHFR可选择的标记物使用,例如,描述于Kaufman和Sharp（1982）Mol.biol.159:601-621），NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过以足以允许宿主细胞中抗体表达或，更优选地，抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间培养宿主细胞来产生抗体。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例是：由SV40转化的猴肾CV1系（COS-7,ATCC CRL 1651）；人胚胎肾系（用于在悬浮液培养中生长而亚克隆的293或293细胞,Graham等人,J.Gen Virol.36:59（1977））；幼仓鼠肾细胞（BHK,ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO,Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)）；小鼠Sertoli细胞（TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）；猴肾细胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76,ATCC CRL-1587）；人子宫颈癌细胞（HELA,ATCC CCL 2）；狗肾细胞（MDCK,ATCC CCL 34）；水牛鼠肝细胞（BRL 3A,ATCC CRL 1442）；人肺细胞（W138,ATCCCCL 75）；人肝细胞（Hep G2,HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562,ATCC CCL51）；TRI细胞（Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝细胞瘤系（HepG2）。

将宿主细胞用上述用于产生的表达或克隆载体转化，且在对于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望的序列的基因适当修饰的常规营养培养基中培养。

【药物组合物】

可将使用本发明的方法获得的多肽掺入适合于施用给受试者的药物组合物。一般而言，药物组合物包含抗体，或其抗原-结合部分，及药学可接受的载体。

如本文所用，"药学可接受的载体"包括任何和全部生理相容的溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例包括下列一种或更多：水，盐水，磷酸盐缓冲液，右旋糖，甘油，乙醇等，以及其组合。在许多情况中，可优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇诸如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可还包含少量的辅助物质，诸如润湿或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其增强抗体，或其抗原-结合部分的货价期或有效性。

可将使用本发明的方法获得的目的多肽掺入适合于施用给受试者的药物组合物。如本文所用，"药学可接受的载体"包括生理相容的任何和全部溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例包括下列一种或更多：水，盐水，磷酸盐缓冲液，右旋糖，甘油，乙醇等，以及其组合。在许多情况中，可优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇诸如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可还包含少量的辅助物质，诸如润湿或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其增强抗体，或其抗原-结合部分的货价期或有效性。

可处理溶液，以例如通过冷冻干燥，喷雾干燥，冷冻干燥去除一些或全部溶剂或另外自溶液回收重组肽。然后可存储重组肽，例如，作为液体制剂或固体制剂。终产物的期望的制剂通过肽的需要的下游应用来确定。

包含本发明的多肽的药物组合物可见于各种形式。这些包括，例如，液体，半-固体和固体剂型，诸如液体溶液（例如,可注射的和可输注的溶液），分散或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的形式依赖于旨在的施用模式和治疗性应用。典型优选的组合物为可注射的或可输注的溶液形式。优选的施用模式是肠胃外（例如,静脉内,皮下,腹膜内,肌内）。在优选的实施方式中，抗体由静脉内输注或注射施用。在另一优选的实施方式中，抗体由肌内或皮下注射施用。

治疗组合物一般必需是无菌的和在制备和存储条件下稳定。组合物可制成溶液，微乳剂，分散，脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过将活性化合物（即,抗体或其抗原-结合部分）根据需要以需要的量合并进适当的含以上列举的成分之一或组合的溶剂，之后是过滤的灭菌来制备。一般而言，分散剂通过将活性化合物合并进含有碱性分散介质及自以上列举的那些的需要的其他成分的无菌媒质来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉的情况中，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥，这从其之前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉。可维持溶液的适当的流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散剂的情况中通过维持需要的粒径，及通过使用表面活性剂。可通过在组合物中包括延迟吸收的剂，例如，单硬脂酸盐和明胶来导致可注射的组合物的延长的吸收。

使用本发明的方法获得的多肽可由各种本领域知道的方法施用，尽管对于许多治疗性应用，优选的施用途径/模式是皮下注射。在另一实施方式中，施用是经静脉内注射或输注。本领域技术人员会同意，施用途径和/或模式会依赖于期望的结果而改变。在特定实施方式中，活性化合物可用会保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如受控释放制剂，包括植入物，经皮贴剂及微胶囊包裹的递送系统。可使用可生物降解的，生物相容性聚合物，诸如亚乙基乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，多正酯和聚乳酸。制备该制剂的许多方法已被授予专利权或本领域技术人员通常知道。

本发明的药物组合物可包括"治疗有效量"或"预防性有效量"的使用本发明的方法纯化的目的多肽。"治疗有效量"指称对于达到期望的治疗结果在剂量及必需的时间上有效的量。治疗有效量的抗体，或其抗原-结合部分，可根据下列因素改变诸如：个体疾病状态，龄，性别和重量，及多肽在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是抗体，或其抗原-结合部分的治疗有益效应大于任何毒性或有害效应的量。"预防性有效量"指称在剂量及必需时间上，对于达到期望的预防结果有效的量。一般而言，由于预防性剂量用于疾病之前或早先阶段的受试者，预防性有效量会小于治疗有效量。可将剂量方案调至提供最佳所需应答（例如,治疗或预防应答）。例如，可施用单次推注，可经时施用几分次的剂量或剂量可根据治疗状况的急迫程度按比例减少或增加。以为了容易施用和剂量均一性的剂量单元形式配制肠胃外组合物尤其有利。本文所用的剂量单元形式指称适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单元剂型的物理学独立单元；各单元包含预定量的活性化合物，计算为与需要的药学载体关联产生期望的治疗效果。本发明的剂量单元形式的规格取决于和直接依赖于（a）要达到的活性化合物和特定治疗或预防效应的独特性质，及（b）配合该用于治疗个体敏感度的活性化合物的领域固有的限制。

本发明也属于包含使用本发明的方法获得的抗体，或其抗原-结合部分的包装的药物组合物，制备物品，或试剂盒。制备物品可包含使用本发明的方法获得的抗体，或其抗原-结合部分，及包装物质。制备物品也可包含指示具有减少的水平的HCP的包含抗体，或其抗原-结合部分的制剂或组合物的标签或包装单。

本发明参照下列实施例进一步描述，这些实施例仅是例证性的和非限制性的。实施例涉及下列图：

【附图说明】

图1：在各种EDTA浓度的CHOP清除

图2：来自含有对照和EDTA的方法的洗出液的分析SEC

图3：含有对照和EDTA的方法的洗出液中的因子IXα水平

图4：大规模生产中的CHOP清除

图5：

50HQ上不同化合物的CHOP减缩因数。

图6：使用EDTA的不同阴离子交换基质的CHOP减缩因数。

图7：在装载后洗涤缓冲剂中仅

50HQ和EDTA的CHOP减缩因数。

图8：使用EDTA的阴离子交换基质

EMD TMAE（M）上单克隆抗体的CHOP减缩因数。

图9：使用DPA的阳离子交换基质

EMD SO3（M）上单克隆抗体的CHOP减缩因数。

图10：使用不同浓度的EDTA对比不添加EDTA的对照的

50HQ上rVIIa-FP的CHOP减小因素

【实施例】

【实施例1：

上rIX-FP的EDTA-介导的纯化的方法】

rIX-FP在CHO细胞中作为白蛋白融合蛋白表达，FIX在C-端融合到描述于WO2007/144173的人白蛋白。发酵培养之后使通过Cunoζ60SP之后是10SP来经历过滤。澄清的细胞培养液然后经“含有EDTA的”本发明的阴离子交换方法或经“对照”方法处理。

【实施例1a：对照方法】

将澄清的细胞培养液（装载液）以380cm/hr应用于装有HQ 50（Applied Biosystems）的阴离子交换柱。此柱之前通过以380cm/hr应用3个柱体积的平衡液（50mM MES,150mM NaCl,pH5.0）来平衡。导电率的范围是16～18mS/cm。应用澄清的细胞培养液之后，通过以380cm/hr应用3个柱体积洗涤液（50mM MES,150mM NaCl,pH5.0）来从柱洗涤任何未结合的物质。然后将相比rIX-FP欠强烈结合的其他混杂物通过以380cm/hr应用5个柱体积的洗涤液（50mM MES,195mM NaCl,2mM CaCl₂,pH5.0）来从柱洗涤，之后是用2个柱体积的50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.5以380cm/hr再平衡，防止rIX-FP蛋白损失，所述损失会源自CaCl₂的导入而存在于柱的高导电率的洗涤缓冲剂或有该效应的某物，和最终以380cm/hr应用5个柱体积的50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mMCaCl₂，pH8.5。然后通过以190cm/hr应用5个柱体积的洗脱液具有50mM Tris-HCl，150mM NaCl，30mM CaCl₂，pH8.5来从柱洗脱纯化的rIX-FP。

纯化的rIX-FP的洗脱和收集之后，通过以380cm/hr应用3个柱体积的50mM Tris-HCl，2M NaCl，pH8.5来再生柱。

【实施例1b：本发明的含有EDTA的方法】

向澄清的细胞培养液在观察下加入EDTA水平（见表1）或到5～150mM范围的值。然后将导电率调整到≤18mS/cm，以用由20mMTris，pH7.0，以与加入细胞培养液的相同的浓度加EDTA组成的稀释缓冲剂给关于与对照样品等价的导电率。

当以35mM EDTA进行大规模制备（见实施例1f）时，澄清的细胞培养液首先通过用20mM Tris-HCl，pH7.0稀释来调整到≤13.5mS/cm的导电率。然后将二钠-EDTA添加到此溶液到35mM的水平，使导电率回到达与未调整的对照原料可比较的水平（≤18mS/cm）。

无论两种方式中的任何方式，将最终溶液（装载液）以380cm/hr应用于装有

HQ 50（Applied Biosystems）的阴离子交换柱。此柱已之前通过以380cm/hr应用3个柱体积的平衡液（50mM MES,100mM NaCl,50mM二钠-EDTA,pH5.0）来平衡。此平衡缓冲剂的导电率类似于通过降低NaCl浓度的对照方法中的对应缓冲剂的导电率。

应用调整的，含有EDTA的澄清的细胞培养液（装载液）之后，通过以380cm/hr应用3个柱体积的洗涤液(50mM MES,100mM NaCl,50mM二钠-EDTA,pH5.0）来从柱洗涤任何未结合的物质。然后将相比rIX-FP欠强烈结合的其他混杂物通过以380cm/hr应用5个柱体积的洗涤液（50mM MES,195mM NaCl,2mM CaCl₂,pH5.0）之后是用2个柱体积的50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.5以380cm/hr再平衡，最终是以380cm/hr应用5个柱体积的50mM Tris-HCl，100mMNaCl，10mM CaCl₂，pH8.5来从柱洗涤。然后通过以190cm/hr应用5个柱体积的洗脱液（50mM Tris-HCl,150mM NaCl,30mM CaCl₂,pH8.5）来从柱洗脱纯化的rIX-FP。

洗脱和收集纯化的rIX-FP之后，通过以380cm/hr应用3个柱体积的50mM Tris-HCl，2M NaCl，pH8.5来将柱再生。

【实施例1c：CHOP清除】

重复的对照实验和在装载液中以不同水平的EDTA的含有EDTA的实验的结果显示于表1。此清除以图像显示于图1。随着EDTA浓度达约35mM的峰（允许一些实验变异）CHOP清除线性地增加，过了此点未观察到增益。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（CygnusTechnologies catalog#F015）定量CHOP水平。

【实施例1d：聚集的或降解的形式的rIX-FP的去除】

经分析大小排阻层析（SEC）在高效液相层析上观察的主要蛋白物质显示于表2。含有EDTA的方法的使用显著减少洗脱中聚集物和片段（破断产物）的水平。此也可见于图2，其呈现来自对照和含有EDTA的方法的洗脱的产物的SEC迹。

【实施例1e：因子IXα的去除】

因子IXα是一种由在仅Arg145-Ala146活化位点切割得到的特异性蛋白水解破断产物。此形式的蛋白不可通过SEC分离，由于其经二硫键连接在一起，且由此是FIX纯化中的特定问题。如显示于图3，通过在还原及变性条件下操作的分析毛细管电泳测量，使用含有EDTA的方法改善此物质的清除。

【实施例1f：rIX-FP的大规模纯化】

将500L的澄清的细胞培养液通过用20mM Tris-HCl，pH7.0稀释来调整到≤13.5mS/cm的导电率。然后将二钠-EDTA添加到此溶液到35mM的水平，导致导电率回到达与未调整的原料可比较的水平（≤18mS/cm）。然后基本上如实施例1b中所述将此物质应用于

HQ 50。在此规模达到的宿主-细胞清除显示于表3和图4，将其与对照（实施例1a）方法的大规模应用中达到的进行比较。

表1：自对照（无添加的EDTA）和含有EDTA的实验的实验数据。将EDTA以各种浓度加入澄清的细胞培养液。在全部含有EDTA的实验中，平衡和装载后洗涤缓冲剂是相同的（50mM MES,100mMNaCl,50mM EDTA,pH5.0）。

表2：通过分析SEC测定的洗脱中各形式的rIX-FP的%丰度

实验(装载液中的EDTA浓度)	聚集物	单体	片段
				对照1	6.91	83.63	9.46
对照2	6.23	87.47	6.3
				对照3	9.89	85.0	5.11
10mM EDTA	3.84	92.2	3.95
				20mM EDTA	3.79	93.16	3.04
33mM EDTA	3.66	93.6	2.75
				35mM EDTA	3.52	94.43	2.5
36mM EDTA	1.75	92.46	5.79
				50mM EDTA	2.33	94.89	2.78

表3：通过使用EDTA的大规模CHOP清除

【实施例2：不同于装载缓冲剂中的EDTA的化合物存在下在

上rIX-FP的改善的纯化方法】

使用高通量批筛选方法用96孔过滤微平板研究不同于EDTA的不同化合物的效应。研究的化合物是次氮基三乙酸（NTA），乙二胺-N，N'-二琥珀酸（EDDS），二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）和乙二胺四(亚甲基膦酸)（EDTMP）。将代表性的澄清的收获物物质用2×平衡缓冲剂1:1稀释，并用10，20，40和60mM的最终化合物浓度或用于对照运行的无添加的化合物调整到导电率16.5mS/cm。筛选不同化合物浓度，因为最佳化合物浓度可不同于EDTA，且pH和导电率不是对其他化合物优化的。在表4中列出了各步骤的缓冲剂或溶液。

表4：用于在

50HQ上不同于EDTA的不同化合物的高通量筛选的缓冲剂

对于温育步骤，在微平板搅拌器上以1100rpm搅拌滤板指定的温育时间，并将液体通过使用真空歧管装置移出到深孔存储板。每组实验以一式四份进行，并使用平均结果。

详细而言，将50HQ树脂浆转移到96孔滤板（0.65μmPVDF膜），并通过真空从树脂除去存储缓冲剂。将树脂与相应平衡缓冲剂温育5min。将调整的装载物质与树脂温育总共40min和收集流通物。将树脂还用相应平衡缓冲剂洗涤5min和收集装载后洗涤级分。将全部树脂与洗涤1，2和3缓冲剂各温育5min。将树脂用150μL的洗脱缓冲剂洗脱5min。就人白蛋白含量，将装载物质，流通，装载后洗涤和洗脱级分通过白蛋白蓝580测定（Sigma Aldrich catalog#05497）分析。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（Cygnus Technologiescatalog#F015）分析CHOP含量。表5显示使用高通量筛选方法的EDTA方法和其他化合物对比对照方法的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且在图5中，结果以表来表示。

表5：在

50HQ上不同于EDTA的不同化合物的高通量筛选的每CHOP产物含量的升高和CHOP减小

【实施例3：在装载缓冲剂中EDTA存在下，但使用不同阴离子交换基质的rIX-FP的改善的纯化方法】

使用高通量批筛选方法用96孔过滤微平板研究不同于50HQ的不同阴离子交换基质的效应。研究的阴离子交换基质是

25Q（Bio-Rad），

DEAE（Bio-Rad）和Cellufine Q-500（Chisso）。将代表性的澄清的收获物物质用2×平衡缓冲剂1:1稀释，并用10，20，40和60mM的最终EDTA浓度或用于对照运行的无添加的化合物调整到导电率16.5mS/cm。筛选不同EDTA浓度，因为最佳EDTA浓度可不同于

50HQ，且pH和导电率不是对于其他阴离子交换基质优化的。在表6中列出各步骤的缓冲剂或溶液。

表6：用于使用EDTA的不同阴离子交换基质的高通量筛选的缓冲剂

详细而言，将阴离子交换树脂浆转移到96孔滤板（0.65μm PVDF膜），并从树脂通过真空除去存储缓冲剂。将树脂与相应平衡缓冲剂温育5min。将调整的装载物质与树脂温育总共40min和收集流通物。将树脂用相应平衡缓冲剂还洗涤5min和收集装载后洗涤级分。将全部树脂与洗涤1，2和3缓冲剂各温育5min。将树脂用150μL的洗脱缓冲剂洗脱5min。就人白蛋白含量，对装载物质，流通，装载后洗涤和洗脱级分通过白蛋白蓝580测定（Sigma Aldrich catalog#05497）分析。CHOP含量通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（CygnusTechnologies catalog#F015）分析。表7显示使用高通量筛选方法的

方法和其他阴离子交换基质对比对照的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且图6结果以表来表示。

表7：对于使用EDTA的不同阴离子交换基质的高通量筛选的每CHOP产物含量的升高和CHOP减小

【实施例4：洗涤缓冲剂中EDTA存在下，在

上rIX-FP的改善的纯化方法】

使用高通量批筛选方法用96孔过滤微平板研究在50HQ上，在装载后洗涤缓冲剂中单独具有EDTA的效应。将代表性的澄清的收获物物质用2×平衡缓冲剂1:1稀释，并在无添加的EDTA下调整到导电率16.5mS/cm。在装载后洗涤缓冲剂中使用40mM的EDTA浓度。在表8中列出各步骤的缓冲剂或溶液。

表8：用于使用EDTA的不同阴离子交换基质的高通量筛选的缓冲剂

对于温育步骤，在微平板搅拌器上1100rpm搅拌滤板指定的温育时间，并将液体通过使用真空歧管装置移出到深孔存储板。每组实验以一式四份进行，并使用平均结果。

将

50HQ树脂浆转移到96孔滤板（0.65μm PVDF膜），并从树脂通过真空除去存储缓冲剂。将树脂与相应平衡缓冲剂温育5min。将调整的装载物质与树脂温育总共40min和收集流通物。将树脂用相应平衡缓冲剂还洗涤5min和收集装载后洗涤级分。将全部树脂与洗涤1，2和3缓冲剂各温育5min。将树脂用150μL的洗脱缓冲剂洗脱5min。就人白蛋白含量，对装载物质，流通，装载后洗涤和洗脱级分通过白蛋白蓝580测定（Sigma Aldrich catalog#05497）来分析。CHOP含量通过酶联免疫吸附测定（ELISA)(Cygnus Technologiescatalog#F015）分析。表9显示在装载后洗涤缓冲剂中对比对照对于仅EDTA的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且图7结果以表来表示。

表9：使用

50HQ，在装载后洗涤缓冲剂中仅EDTA的高通量筛选的每CHOP产物含量的升高和CHOP减小

【实施例5：装载缓冲剂中EDTA存在下，在AEX基质

EMD TMAE上单克隆抗体的改善的纯化方法】

使用高通量批筛选方法用96孔过滤微平板研究EDTA对在阴离子交换基质上单克隆抗体纯化的效应。将代表性的澄清的收获物物质用2×平衡缓冲剂1:1稀释，对于对照运行，是5，10和20mM的最终EDTA浓度或无添加的化合物。筛选不同EDTA浓度，因为纯化条件未优化。

表10列出用于筛选的各步骤的缓冲剂。

表10：用于在

EMD TMAE上使用EDTA的单克隆抗体纯化的高通量筛选的缓冲剂

将

EMD TMAE树脂浆转移到96孔滤板（0.65μmPVDF膜），并从树脂通过真空除去存储缓冲剂。将树脂与相应平衡缓冲剂温育5min。将调整的装载物质与树脂温育总共40min和收集流通物。将树脂用相应平衡缓冲剂还洗涤5min和收集装载后洗涤级分。全部树脂用无添加的化合物的平衡缓冲剂各洗涤5min。将树脂用150μL的洗脱缓冲剂洗脱5min。就IgG含量，对装载物质，流通，装载后洗涤和洗脱级分通过蛋白A HPLC来分析。CHOP含量通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（Cygnus Technologies catalog#F015）分析。

表11显示在

EMD TMAE上，使用高通量筛选方法，对单克隆抗体纯化的增加EDTA浓度对比对照的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且图8结果以表来表示。

表11：在

EMD TMAE上，使用EDTA的单克隆抗体纯化的高通量筛选的每CHOP产物含量的升高和CHOP减小

【实施例6：在CEX基质

EMD SO3上，在装载缓冲剂中DPA存在下，单克隆抗体的改善的纯化方法】

使用高通量批筛选方法用96孔过滤微平板研究2,2’-二甲基吡啶胺（DPA）对在阳离子交换基质上单克隆抗体纯化的效应。将代表性的澄清的收获物物质用2×平衡缓冲剂1:1稀释，对于对照运行，是5，10和20mM的最终DPA浓度或无添加的化合物。筛选不同DPA浓度，因为纯化条件未优化。表12列出了用于筛选的各步骤的缓冲剂。

表12：用于在

EMD SO3上，使用DPA的单克隆抗体纯化的高通量筛选的缓冲剂

将EMD SO3树脂浆转移到96孔滤板（0.65μm PVDF膜），并从树脂通过真空除去存储缓冲剂。将树脂与相应平衡缓冲剂温育5min。将调整的装载物质与树脂温育总共40min和收集流通物。将树脂用相应平衡缓冲剂还洗涤5min和收集装载后洗涤级分。全部树脂用无添加的化合物的平衡缓冲剂各洗涤5min。将树脂用150μL的洗脱缓冲剂洗脱5min。就IgG含量，对装载物质，流通，装载后洗涤和洗脱级分通过蛋白A HPLC来分析。CHOP含量通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（Cygnus Technologies catalog#F015）分析。表13显示在

EMD SO3上，使用高通量筛选方法，对单克隆抗体纯化的增加DPA浓度对比对照的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且图9结果以表来表示。

表13：在

EMD SO3上，使用DPA的单克隆抗体纯化的高通量筛选的产物每CHOP含量的升高和CHOP减小

【实施例7：在AEX基质

50HQ上，使用EDTA作为添加剂的rVIIa-FP的改善的纯化方法】

如Weimer等人（Thromb.Hemost.(2008)Vol 99(4)pp.659-67）描述，在CHO-S细胞中表达重组白蛋白融合的FVIIa。将澄清的细胞培养液调至不同EDTA，pH和导电率水平，并应用于装有

HQ 50（Applied Biosystems）的阴离子交换柱。此柱已经在之前用20mM HEPES，50mM NaCl，pH6.2平衡，调整到与澄清的细胞培养液相同的条件，例如EDTA spike。装载之后是用相应平衡缓冲剂的装载后洗涤。用20mM HEPES，100mM NaCl，pH6.2从柱洗涤任何未结合的物质。然后用20mM HEPES，150mM NaCl，10mM CaCl₂，pH6.2从柱洗脱纯化的rVIIa-FP。用发色活性测定来测量rFVIIa-FP活性，而CHOP含量通过酶联免疫吸附测定（ELISA）（CygnusTechnologies catalog#F015）分析。表14显示对于不同EDTA浓度，

方法对比对照的CHOP减缩因数和CHOP减缩因数的升高的结果，且图10结果以表来表示。

表14：在50HQ上，对于EDTA的每CHOPFVIIa含量的升高和CHOP减小

Claims

1.通过离子-交换层析纯化目的多肽的方法，其中化合物以至少7mM的浓度加入

（a）离子交换基质的平衡液，其中调整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质，

和/或

（b）应用于离子交换基质、且包含目的多肽的装载液，其中调整装载液，使得装载液中的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于与离子交换基质的电荷相反的电荷而结合于离子交换基质，

和/或

2.权利要求1的方法，其中离子交换基质是阴离子交换基质，而化合物具有负电荷。

3.权利要求1和2的方法，其中化合物上的负电荷聚集。

4.权利要求1～3的方法，其中化合物具有络合一种或更多金属离子的能力。

5.权利要求1～4的方法，其中化合物选自：

（a）包含五-乙酸基和它们的各种盐的化合物

（b）包含四-乙酸基和它们的各种盐的化合物

（c）包含三-乙酸基和它们的各种盐的化合物

（d）包含二-乙酸基和它们的各种盐的化合物

（e）包含多个胺基和它们的各种盐的化合物

（f）包含多个氢硫基和它们的各种盐的化合物

（g）膦酸和其衍生物及它们的各种盐。

6.权利要求1～5的方法，其中杂质包含宿主细胞蛋白和/或宿主细胞核酸和/或产物-相关的混杂物和/或病毒和/或朊病毒和/或内毒素和/或方法-相关的混杂物。

7.权利要求1～6的方法，其中化合物是EDTA和其相应盐或EGTA和其相应盐。

8.权利要求1～7的方法，其中目的多肽带电，且其中电荷聚集。

9.根据1～8的方法，其中目的多肽能络合一种或更多金属离子。

10.权利要求1～9的方法，其中目的多肽是维生素K-依赖性多肽。

11.权利要求1～10的方法，其中目的多肽是FIX或FVII。

12.权利要求1～11的方法，其中目的多肽是FIX，而杂质包含FIXα。

13.权利要求1～12的方法，其中杂质包含宿主细胞蛋白。

14.权利要求13的方法，其中与在另外同一方法参数下不使用化合物相比，当使用化合物时，宿主细胞蛋白的减少高于至少2倍。

15.权利要求1的方法，其中离子交换基质是阳离子交换基质，而化合物带正电。

16.权利要求15的方法，其中化合物上的正电荷聚集。

17.权利要求16的方法，其中化合物选自：具有氨基的化学结构和/或阳离子氨基酸聚合物，诸如四亚乙基五胺（TEPA），二甲基吡啶胺（DPA），聚-赖氨酸，聚-精氨酸和聚-组氨酸。

18.权利要求15～17的方法，其中杂质包含宿主细胞蛋白和/或宿主细胞核酸和/或产物-相关的混杂物和/或病毒和/或朊病毒和/或内毒素和/或方法-相关的混杂物。

19.化合物用于减少通过离子-交换层析的目的多肽纯化中的杂质的用途，其中将化合物添加于：

和/或

20.权利要求19的用途，其中离子交换基质是阴离子交换基质，而化合物具有负电荷。

21.权利要求19的用途，其中离子交换基质是阳离子交换基质，而化合物具有正电荷。

22.权利要求19～21的用途，其中化合物上的电荷聚集。

23.权利要求20的用途，其中化合物具有结合金属阳离子的能力。

24.权利要求19～24的用途，其中杂质包含宿主细胞蛋白和/或宿主细胞核酸和/或产物-相关的混杂物和/或病毒和/或朊病毒和/或内毒素和/或方法-相关的混杂物。

25.权利要求19～24的用途，其中化合物浓度是至少7mM。

26.权利要求19～24的方法，其中化合物选自：