CN101031644A - 通过分级洗脱从阴离子交换材料中纯化批量凝血因子ⅶ多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用包括特定浓度钙离子的洗脱缓冲液通过分级洗脱从阴离子交换材料中根据所需糖型从批量凝血因子VII多肽中纯化凝血因子VII多肽。本发明使得能够根据所需糖型来富集批量凝血因子VII多肽。
Description
发明领域
本发明涉及利用包括特定浓度钙离子的洗脱缓冲液通过分级洗脱从阴离子交换材料中根据所需糖型从批量凝血因子VII多肽中纯化凝血因子VII多肽。本发明使得能够根据所需糖型来富集批量凝血因子VII多肽。本发明还使得能够利用具有相对低丰度的所需糖型的凝血因子VII多肽的批量凝血因子VII多肽。
发明背景
在凝血级联中涉及的蛋白质，包括例如凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X和蛋白质C，证明是治疗各种病理状态的有用治疗剂。相应地，对于包括这些蛋白质的制剂的需要在不断上升，所述蛋白质是药学上可接受的并显示一致且预定的临床效果。
因为使用人血浆作为药物产物来源的诸多不便，所以优选在重组系统中生产这些蛋白质。然而，对凝血蛋白实施各种共翻译修饰和翻译后修饰，包括，例如天门冬酰胺-连接的(N-连接的)糖基化；O-连接的糖基化；和Glu残基的γ-羧化作用。当使用异源细胞作为蛋白质大规模生产的宿主时，这些修饰在性质上或数量上可能是不同的。特别地，在异源细胞中的生产通常产生不同排列的糖型，所述糖型代表具有不同共价连接的寡糖结构的相同多肽。
在不同系统中，治疗蛋白质寡糖结构中的变化与例如免疫原性和体内清除率的变化相关。因此，本领域需要商品化的、包含预定的糖型模式(或至少对于某种所需糖型是富集的)的凝血因子VII多肽组合物，特别是具有所需高含量的唾液酸化凝血因子VII多肽结构的纯化的批量(bulk)凝血因子VII多肽。
发明概述
本发明解决了通过从阴离子交换材料中分级洗脱批量凝血因子VII多肽来提供纯化的批量凝血因子VII多肽的问题，所述批量凝血因子VII多肽具有所需高含量的唾液酸化的凝血因子VII多肽结构。
因此，本发明的第一个方面涉及用于纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下，使批量凝血因子VII多肽与阴离子交换材料接触；
(b)用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料；和
(c)用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集作为洗出液的纯化的批量凝血因子VII多肽；
其中选择阈值X从而使得在第一个洗脱步骤(b)中从所述阴离子交换材料中去除至少5wt％的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二个洗脱步骤(c)中可以收集作为纯化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt％的批量凝血因子VII多肽。
在本发明的第二个方面，以绝对值表示，阈值为3-12mM，例如4-11mM，例如5-10mM。
新型工业规模方法使得能够根据所需糖型来纯化粗制的批量凝血因子VII多肽，特别是——但不是唯一的——具有很低丰度所需糖型的粗制的批量凝血因子VII多肽。
因此，本发明的第三个方面涉及用于生产并纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(i)在细胞培养物中生产粗制的批量凝血因子VII多肽，和
(ii)通过纯化顺序利用一种或多种阴离子纯化方法来纯化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，
其中至少一种此类阴离子交换纯化方法如上文限定的进行。
发明详述
如上所述，本发明提供了用于纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下，使批量凝血因子VII多肽与阴离子交换材料接触；
(b)用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料；和
(c)用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集作为洗出液的纯化的批量凝血因子VII多肽；
其中选择阈值X从而使得在第一个洗脱步骤(b)中从所述阴离子交换材料中去除至少5wt％的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二个洗脱步骤(c)中可以收集作为纯化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt％的批量凝血因子VII多肽。
在本发明方法的一个可替代的变化方案中，阈值以绝对值进行限定，即本发明还提供了用于纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下，使所述批量凝血因子VII多肽与阴离子交换材料接触；
(b)用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料；和
(c)用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集作为洗出液的纯化的批量凝血因子VII多肽；
其中阈值X为3-12mM。
本发明方法特别适合于“工业规模”(或“大规模”)的批量凝血因子VII多肽。术语“工业规模”一般指下述方法，其中液体凝血因子VII多肽组合物的体积为至少100L，例如至少500L，例如至少1000L，或至少5000L，或其中组合物的重量为至少100kg，例如至少500kg，例如至少1000kg，或至少5000kg，或其中产物重量为至少1g(干物质)，例如至少10g，例如至少50g，例如1-1000g或1-500g或1-100g。
在本上下文中，术语“糖型(glycoform)”指具有不同共价连接的寡糖结构，特别是唾液酸(sialyl)基团的存在或缺乏，但在其他方面序列相同的凝血因子VII多肽。
在本上下文中，术语“纯化”指去除具有不合需要的糖型的凝血因子VII多肽，所述不合需要的糖型即具有不完全的唾液酸模式的糖型(例如，没有或数目不完全的唾液酸基团)。
已发现当含钙(Ca2+)缓冲液与阴离子交换色谱法组合使用时，此类不合需要的糖型(具有不完全的唾液酸模式)在“需要的糖型”(即，具有“完全”的唾液酸模式的糖型)前洗脱。因此，通过本文所限定的分级洗脱，可以获得所需糖型富集的纯化的批量凝血因子VII多肽。
本文所使用的“批量”的表达意指固体物质和液体物质，例如包括凝血因子VII多肽的溶液或悬浮液。“批量”的表达特指“大的”体积或量，即，指已知来自大规模和工业规模方法的体积和量。
术语“凝血因子VII多肽”在下文中进一步限定。
“阈值”在本上下文中是最重要的，因为它限定了利用Ca2+洗脱缓冲液分级洗脱的重要参数。阈值限定了形成纯化的批量凝血因子VII多肽的被收集部分和被抛弃、处理或再循环/再使用的先前部分之间的界线。对于柱(最普遍和最有用的排列)中排列的阴离子交换材料，阈值对应柱入口处的缓冲液中的Ca2+浓度，并且应当理解延迟时间收集相应的洗出液，所述延迟的时间对应洗脱缓冲液的“前面部分”通过柱所需要的时间。
步骤(a)-使批量与阴离子交换材料接触
在本方法的第一个步骤中，批量凝血因子VII多肽与阴离子交换材料接触。目的是促进所述批量凝血因子VII多肽的一部分与所述阴离子交换材料结合。
步骤(a)中的术语“部分”指批量凝血因子VII多肽中存在的至少30％(即30-100％)的凝血因子VII多肽量。应当理解在大多数情况下希望结合远远超过30％的凝血因子VII多肽量，例如至少50％，或至少70％，或主要的部分。术语“主要的部分”指批量凝血因子VII多肽中存在的至少90％的凝血因子VII多肽量。优选甚至更高的部分与阴离子交换材料结合，例如至少95％的量，或至少98％的量，或至少99％的量，或甚至批量凝血因子VII多肽中存在的基本上所有的凝血因子VII多肽量。
批量凝血因子VII多肽一般来源于工业规模的生产方法，例如细胞培养、克隆动物(例如，牛、猪、绵羊、山羊和鱼)或昆虫等，特别是来自细胞培养。
阴离子交换材料优选强阴离子交换材料，例如含有季铵基团的阴离子交换材料。此类材料的商品化例子有来自Amersham Biosciences的Q-Sepharose Fast Flow，和来自Tosohaas的POROS HQ 50。
阴离子交换材料的最普遍排列是柱的形式。分批容器中的排列当然也可以。
批量凝血因子VII多肽一般直接得自前面的纯化步骤，或得自在必要时后来调整了pH、离子强度等的前面的纯化步骤。
一般地，批量凝血因子VII多肽的pH为7.5-9.5，例如8.0-9.0，并且传导率一般为5-30mS/cm，例如10-20mS/cm。批量的温度一般为，但不限于，0-15℃，例如约2-10℃。
批量凝血因子VII多肽的接触一般根据常规方案来进行，即批量的浓度、温度、pH、离子强度等可以照常，并且阴离子交换材料可以照常进行洗涤和达到平衡。
凝血因子VII多肽的装载量一般为10-40g，例如15-30g凝血因子VII多肽/升基质(湿润形式的阴离子交换材料)，并且批量一般应用的流速为3-200柱体积/小时(CV/h)，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如80-120CV/h。
凝血因子VII多肽与阴离子交换材料接触和结合后，在洗脱步骤(b)和(c)前可以进行一个或多个洗涤步骤。
步骤(b)-第一个洗脱步骤
批量凝血因子VII多肽与阴离子交换材料结合后，进行第一个洗脱步骤(b)以去除部分批量凝血因子VII多肽，其中所述被去除的部分含有比原始批量含量更低的唾液酸化的凝血因子VII多肽结构。通过这个步骤，阴离子交换材料上剩余(结合)部分的凝血因子VII多肽将含有比原始批量含量更高的唾液酸化的凝血因子VII多肽结构。
洗脱步骤(b)通过使用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液来进行。
第一种洗脱缓冲液包括Ca2+(例如氯化钙)和可能与其他盐(例如钠盐、钾盐和镁盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙酸镁、葡萄糖酸镁和乙酰丙酸镁(laevulate)组合的缓冲剂。缓冲剂一般是至少一种选自下列的酸和盐的组分：MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸钠)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸。应当理解缓冲剂可以包括两种或多种组分的混合物，其中所述混合物能够提供指定范围内的pH值。作为例子可以被提及的是乙酸和乙酸钠等。
选择关键的Ca2+阈值浓度X，从而使得在第一个洗脱步骤(b)中从所述阴离子交换材料中去除至少5wt％，例如至少10wt％，或至少15wt％的批量凝血因子VII多肽(同样参见进一步的下文)。因此被去除的部分代表相当高比例的不合需要的糖型。
在一个优选实施方案中，阈值X为3-12mM，例如4-11mM，例如5-10mM。
结合了凝血因子VII多肽的阴离子交换材料的温度一般为0-15℃，例如约2-10℃，例如通过使用冷却套管维持在特定范围内。
应当理解为了使不合需要的糖型通过第一个洗脱步骤(b)去除，第一种洗脱缓冲液中的Ca2+浓度必须超过0(零)，例如至少1mM。当使用梯度缓冲液时，第一种洗脱缓冲液中的平均Ca2+浓度必须超过0(零)，例如至少1mM。
在一个实施方案中，第一种洗脱缓冲液是(恒定的)Ca2+浓度为1-8mM，例如2-7mM的一批缓冲液。
在一个进一步优选的实施方案中，第一个洗脱步骤(b)通过使用梯度缓冲液，特别是Ca2+最终浓度等于X的梯度缓冲液来进行。Ca2+初始浓度一般为0-8mM，例如0-5mM。
步骤(c)-第二个洗脱步骤
在第一个洗脱步骤(b)后，用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，并可以收集作为洗出液的对于所需糖型的凝血因子VII多肽富集的纯化的批量凝血因子VII多肽。
第二种洗脱缓冲液包括Ca2+(尽管浓度高于第一种洗脱缓冲液)和可能与其他盐(例如钠盐、钾盐和镁盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙酸镁、葡萄糖酸镁和乙酰丙酸镁)组合的缓冲剂。缓冲剂一般根据上文列举的适合于第一种洗脱缓冲液的进行选择。
选择关键的Ca2+阈值浓度X，从而使得在第二个洗脱步骤(c)中可以收集作为纯化的批量凝血因子VII多肽的至少50wt％、例如至少60wt％、或70wt％的批量凝血因子VII多肽。
如上，阈值X优选为3-12mM，例如4-11mM，例如5-10mM。
在一个实施方案中，第二种洗脱缓冲液是(恒定的)Ca2+浓度为8-25mM，例如9-20mM的一批缓冲液。
在其一个变化方案中，第一个洗脱步骤(b)通过使用(恒定的)Ca2+浓度为1-8mM，例如1-7mM、2-7mM、或2-8mM的批缓冲液形式的第一种洗脱缓冲液来进行，和第二个洗脱步骤(c)通过使用(恒定的)Ca2+浓度为8-25mM，例如9-25mM、8-20mM、或9-20mM的批缓冲液形式的第二种洗脱缓冲液来进行。
在一个进一步优选的实施方案中，第二个洗脱步骤(c)通过使用梯度缓冲液，特别是Ca2+初始浓度刚超过X的梯度缓冲液来进行。Ca2+最终浓度一般为10-25mM，例如12-20mM。
在一个非常有趣的实施方案中，第一个洗脱步骤(b)和第二个洗脱步骤(c)都利用梯度缓冲液，例如连续梯度缓冲液来进行。在一个实施方案中，Ca2+初始浓度为0-5mM，例如0-3mM，例如约0mM，和Ca2+最终浓度为10-25mM，例如12-20mM，例如约15mM。如上，阈值X一般为3-12mM，例如4-11mM，例如5-10mM。
整个洗脱过程(步骤(b)和步骤(c))一般在3-200柱体积/小时(CV/h)的流速下进行，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如20-120CV/h，20-80CV/h，20-60CV/h，或80-120CV/h。由于凝血因子VII多肽在钙浓度为中间范围的溶液中存在的时间非常有限，所以产物降解的风险被降到最低。因此，本发明人没有发现与本文所限定的方法有关的任何稳定性的问题。
第二个洗脱步骤(c)的另一特征是在许多情况下凝血因子VII多肽将在洗脱条件下完全活化。这是有利的，因为分开的活化步骤变得不必要。
术语“纯化的批量”指所得到的批量，即在步骤(c)中所收集的批量，含有比步骤(a)中应用的批量更低含量的不合需要糖型的凝血因子VII多肽。术语“纯化”指其中可以得到纯化的批量的方法，即本发明的方法。
通常，为了后续使用通过一系列步骤使阴离子交换材料再生。
工业规模的生产和纯化
本发明对于批量凝血因子VII多肽的工业规模生产和纯化特别有用。在此类方法中，凝血因子VII多肽一般通过细胞培养进行生产。
因此，本发明还提供了用于生产并纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(i)在细胞培养物中生产粗制的批量凝血因子VII多肽，和
(ii)通过纯化顺序利用一种或多种阴离子纯化方法来纯化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，
其中至少一种此类阴离子交换纯化方法如上文限定的进行。
优选地，如上文限定的阴离子交换纯化方法是一个或多个阴离子交换纯化方法中的最后一个。
一个引起兴趣的可能性是生产步骤(i)无需相对于所需糖型的凝血因子VII多肽进行优化。因此，在一个有趣的实施方案中，生产步骤(i)相对于粗制的批量凝血因子VII多肽的质量得率进行优化。在这种情况下，所需糖型的凝血因子VII多肽的含量可以是80％或更低，并且由于分离不合需要的糖型的困难，此类“质量-优化”的批量至今对于工业生产凝血因子VII多肽产物用途有限。然而，本发明同样提供了针对这个问题的良好解决方法。
因此，在其一个变化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至多80％，并且纯化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至少90％。
因此，在其一个变化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至多90％，并且纯化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至少95％。
因此，在其一个更进一步的变化方案中，粗制的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至多93％，并且纯化的批量凝血因子VII多肽中唾液酸化的凝血因子VII多肽结构的质量含量为至少96％。
在其另一变化方案中，粗制批量在细胞培养中的生产在7.0-7.6的pH值下进行。
一般地，粗制批量的生产在宿主细胞，例如真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞中实现。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞选自HEK细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、和骨髓瘤细胞例如SP2-0。
这就是说，生产和纯化(除了本发明的分级洗脱纯化步骤)可以根据本领域技术人员已知的进行。因此，粗制的批量凝血因子VII多肽的工业规模生产可以如本申请人早期申请例如WO 04/027072 A2、WO 02/29083 A2、WO 02/29025 A2、WO 00/28065 A1、WO 02/77218 A1等中所公开的进行。
凝血因子VII多肽
如本文所使用的，术语“凝血因子VII多肽”涵盖了野生型凝血因子VII(即具有美国专利号4,784,950中所公开的氨基酸序列的多肽)，以及显示出相对于野生型凝血因子VII基本上相同或改进的生物活性的凝血因子VII的变异体。术语“凝血因子VII”意欲涵盖未切割(酶原)形式的凝血因子VII多肽，以及已用蛋白水解处理以产生其分别的生物活性形式的那些，它们可以被称为凝血因子VIIa。一般地，凝血因子VII在残基152和153之间切割以产生凝血因子VIIa。术语“凝血因子VII多肽”还涵盖了其中凝血因子VIIa的生物活性相对于野生型凝血因子VIIa已基本上修饰或略微减少的多肽，包括变异体。这些多肽包括，但不限于，其中已导入修饰或破坏多肽生物活性的特定氨基酸序列改变的凝血因子VII或凝血因子VIIa。
凝血因子VIIa在血液凝固中的生物活性来源于其下列能力：(i)结合组织因子(TF)，和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X蛋白水解切割以产生活化凝血因子IX或X(分别为凝血因子IXa或Xa)。
对本发明来说，凝血因子VII多肽的生物活性(“凝血因子VII生物活性”)可以通过测量制剂促进血液凝固的能力来量化，参照本文所述的测定法4。在这个测定法中，生物活性表示为相对于对照样品的凝血时间减少，并通过与包含1单位/mL凝血因子VII活性的混合人血清标准的比较转换为“凝血因子VII单位”。可替代地，凝血因子VIIa的生物活性可以通过下列方法进行量化：(i)测量凝血因子VIIa或凝血因子VII相关多肽在包括嵌入脂质膜的TF和凝血因子X的系统中产生活化凝血因子X(凝血因子Xa)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.272：19919-19924，1997)；(ii)测量凝血因子X在含水系统中的水解(“体外蛋白水解测定法”，参见下文的测定法2)；(iii)利用基于表面等离子体共振的仪器测量凝血因子VIIa或凝血因子VII相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.413：359-363，1997)；(iv)测量由凝血因子VIIa和/或凝血因子VII相关多肽对合成的基质的水解(“体外水解测定法”，参见下文的测定法1)；或(v)测量体外系统中不依赖TF的凝血酶的产生(参见下文的测定法3)。
具有相对于野生型凝血因子VIIa基本上相同或改良的生物活性的凝血因子VII变异体涵盖当在一个或多个如上所述的凝集测定法(测定法4)、蛋白水解测定法(测定法2)或TF结合测定法中测试时，显示出在相同细胞类型中产生的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％和最优选至少约90％的凝血因子VIIa特异活性的那些。具有相对于野生型凝血因子VIIa基本上减少的生物活性的凝血因子VII变异体是当在一个或多个如上所述的凝集测定法(测定法4)、蛋白水解测定法(测定法2)、或TF结合测定法中测试时，显示出在相同细胞类型中产生的野生型凝血因子VIIa的少于约25％、优选少于约10％、更优选少于约5％和最优选少于约1％的凝血因子VIIa特异活性的那些。具有相对于野生型凝血因子VIIa基本上修饰的生物活性的凝血因子VII变异体包括，但不限于，显示TF不依赖性凝血因子X蛋白水解活性的凝血因子VII变异体以及结合TF但不切割凝血因子X的那些。
无论是显示基本上相同或比野生型凝血因子VII更佳的生物活性，还是可替代地显示相对于野生型凝血因子VII基本上修饰或减少的生物活性的凝血因子VII变异体，他们包括，但不限于，具有通过一个或多个氨基酸的插入、删除或置换而不同于野生型凝血因子VII序列的氨基酸序列的多肽。
具有与野生型凝血因子VII基本上相同的生物活性的凝血因子VII变异体的非限制性例子包括S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；如美国专利号5,580,560中所公开的显示增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变异体；已在残基290和291之间或残基315和316之间进行蛋白水解切割的凝血因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；氧化形式的凝血因子VIIa(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；如PCT/DK02/00189中所公开的FVII变异体；和如WO 02/38162(Scripps Research Institute)中所公开的显示增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变异体；如WO 99/20767(University of Minnesota)中所公开的具有修饰的Gla结构域并显示增强的膜结合性的FVII变异体；和如WO 01/58935(Maxygen ApS)中所公开的FVII变异体。
具有相对于野生型FVIIa增加的生物活性的凝血因子VII变异体的非限制性例子包括如WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/27147、WO 03/37932、WO 02/38162(Scripps ResearchInstitute)所公开的凝血因子VII变异体；和如JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中所公开的具有增强活性的凝血因子VII变异体。
具有相对于野生型凝血因子VII基本上减少或修饰的生物活性的凝血因子VII变异体的非限制性例子包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem 29：3413-3420，1990)、S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.270：66-72，1995)、FFR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15：515-520，1998)、和缺少Gla结构域的凝血因子VIIa(Nicolaisen等人，FEBS Letts.317：245-249，1993)。
凝血因子VII多肽的例子包括，但不限于，野生型凝血因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，
S52A-因子VII、S60A-因子VII；
R152E-因子VII、S344A-因子VII、缺少Gla结构域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在233Thr-240Asn的氨基酸序列中有置换、添加或删除的FVII、在304Arg-329Cys的氨基酸序列中有置换、添加或删除的FVII、和在Ile153-Arg223的氨基酸序列中有置换、删除或添加的FVII。
在某些实施方案中，凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa(hFVIIa)，优选重组制备的人凝血因子VIIa(rhVIIa)。
在其他实施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII序列变异体。
在某些实施方案中，凝血因子VII多肽具有不同于野生型人凝血因子VII的糖基化。
在各种实施方案中，例如其中凝血因子VII多肽是凝血因子VII相关多肽或凝血因子VII序列变异体的那些，当在如本说明书中所述的“体外蛋白水解测定法”(测定法2)中测试时，凝血因子VII多肽的活性和天然的人凝血因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率为至少约1.25，优选至少约2.0、或4.0，最优选至少约8.0。
在某些实施方案中，凝血因子VII多肽是凝血因子VII相关多肽，特别是变异体，其中当在“体外水解测定法”(参见下文的测定法1)中测试时，所述凝血因子VII多肽的活性和天然的人凝血因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率为至少约1.25；在其他实施方案中，该比率为至少约2.0；在进一步的实施方案中，该比率为至少约4.0。
纯化的批量凝血因子VII多肽的用途
对应纯化的批量凝血因子VII多肽的部分收集后可以配制为溶液，所述溶液可以分装到管形瓶中并冷冻干燥。作为对应市售、重组制备的FVII多肽组合物NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Denmark)的最终产物的说明性例子，可以提及的是包含1.2mg重组人凝血因子VIIa、5.84mg NaCl、2.94mg CaCl2、2H2O、2.64mg GlyGly、0.14mg聚山梨醇酯80、和60.0mg甘露醇的管形瓶(1.2mg)。这种产物在使用前用2.0mL注射用水(WFI)复原至pH5.5。当复原时，蛋白质溶液对于24小时内使用是稳定的。
重组活化凝血因子VII(rFVIIa)的整个生产过程由Jurlander等人在Thrombosis and Hemostasis，第27卷，No.4，2001中描述。
实施例
适合于确定凝血因子VII多肽生物活性的测定法
依照本发明使用的凝血因子VII多肽可以通过适当的测定法来选择，所述测定法可以作为简单初步的体外测试进行。因此，本说明书公开了关于凝血因子VII多肽活性的简单测试(命名为“体外水解测定法”)。
体外水解测定法(测定法1)
可以测定天然的(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VII多肽(这两种在本文都称为“凝血因子VIIa”)的比活性。它们还可进行平行测定以直接比较它们的比活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行。将终浓度为1mm的显色底物D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入在pH 7.4，包含0.1M NaCl、5mM CaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白的50mM HEPES中的凝血因子VIIa(终浓度为100nM)。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，USA)上连续测量405nm处的吸光度。在孵育20分钟后产生的吸光度减去不含酶的空白孔的吸光度后用于计算凝血因子VII多肽和野生型凝血因子VIIa活性之间的比率：
比率＝(A405nm凝血因子VII多肽)/(A405nm野生型凝血因子VIIa)。
基于上式可以鉴别具有比天然凝血因子VIIa更低、相当或更高活性的凝血因子VII多肽，例如，其中凝血因子VII多肽的活性与天然凝血因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为约1.0相对大于1.0的凝血因子VII多肽。
利用生理学底物例如100-1000mM适当浓度的凝血因子X(“体外蛋白水解测定法”)也可测量凝血因子VII多肽的活性，其中在加入适当显色底物(例如S-2765)后测量产生的凝血因子Xa。此外，该活性测定法可以在生理学温度下进行。
体外蛋白水解测定法(测定法2)
平行测定天然的(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VII多肽(这两种在本文都称为“凝血因子VIIa”)以直接比较它们的比活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将在pH 7.4，包含0.1M NaCl、5mM CaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白的100μL 50mM HEPES中的凝血因子VIIa(10nM)和因子X(0.8 microM)孵育15分钟。随后通过加入pH 7.4，包含0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/mL牛血清白蛋白的50μL 50mM HEPES来终止凝血因子X切割。通过加入终浓度为0.5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide(S-2765，Chromogenix，Sweden)来测量所产生的因子Xa的量。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，USA)上连续测量405nm处的吸光度。在孵育10分钟时产生的吸光度减去不含FVIIa的空白孔的吸光度后用于计算凝血因子VII多肽和野生型凝血因子VIIa蛋白水解活性之间的比率：
比率＝(A405nm凝血因子VII多肽)/(A405nm野生型凝血因子VIIa)。
基于上式可以鉴别具有比天然凝血因子VIIa更低、相当或更高活性的凝血因子VII多肽，例如，其中凝血因子VII多肽的活性与天然凝血因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为约1.0相对大于1.0的凝血因子VII多肽。
凝血酶产生测定法(测定法3)
在包括生理浓度的所有相关凝血因子和抑制剂(当模拟血友病A病状时，除去凝血因子VIII)和活化血小板的测定法(测定法3)中还可测量凝血因子VIIa或凝血因子VII多肽产生凝血酶的能力(如Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中第543页所述，所述文献据此引入本文作为参考)。
单步凝集测定法(测定法4)
还可使用单步凝集测定法(测定法4)来测量凝血因子VII多肽的生物活性。为此，将待测样品稀释于50mM PIPES缓冲液(pH7.5)和0.1％BSA中，将40μl与40μl缺乏凝血因子VII的血浆和包含10mM Ca2+和合成磷脂的80μl人重组组织因子一起孵育。在平行线性测定法中测量凝集时间并利用参照标准与标准曲线进行比较。
凝血因子VII多肽的制备与纯化
适用于本发明的纯化的人凝血因子VIIa优选通过例如，Hagen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2412-2416，1986或欧洲专利号0 200 421(ZymoGenetics，Inc.)中所述DNA重组技术来制备。
还可通过Broze and Majerus，J.Biol.Chem.255(4)：1242-1247，1980和Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841，1983所述方法来产生凝血因子VII。这些方法生成了不含可检测量的其它凝血因子的凝血因子VII。通过包括作为最后纯化步骤的另外的凝胶过滤法可以得到更进一步纯化的凝血因子VII制剂。随后通过已知方法将凝血因子VII转化为活化的凝血因子VIIa，例如通过几种不同的血浆蛋白质，例如凝血因子XIIa、IXa或Xa。可替代地，如Bjoern等人所描述的(Research Disclosure，269 September 1986，第564-565页)，通过使其经过离子交换色谱柱例如Mono Q(Pharmaciafine Chemicals)等，或通过在溶液中自体活化，可以将凝血因子VII完全激活。
通过修饰野生型凝血因子VII或通过重组技术可以产生凝血因子VII相关多肽。与野生型凝血因子VII比较时具有改变的氨基酸序列的凝血因子VII相关多肽可以通过下列方法来产生：通过已知方法例如定点诱变改变编码天然凝血因子VII的核酸中的氨基酸密码子或通过去除某些氨基酸密码子来修饰编码野生型凝血因子VII的核酸序列。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以在凝血因子VIIa分子功能关键区域之外进行置换并仍产生活性多肽。凝血因子VII多肽活性必需并因此优选不实施置换的氨基酸残基可以根据本领域已知程序进行鉴别，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如Cunningham andWells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个带正电荷的残基上导入突变，并测试所得突变体分子的凝集活性、分别的交联活性以鉴别对分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点还可通过分析三维结构进行确定，所述三维结构根据技术例如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记法进行确定(参见，例如de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。
通过定点诱变利用本领域已知的任何方法可以将突变导入核酸序列以使一种核苷酸替换为另一种核苷酸。特别有用的是采用超螺旋双链DNA载体的方法，所述DNA载体含有目的插入片段和包含所需突变的2个合成引物。每一个与载体的相反链互补的寡核苷酸引物在温度循环过程中通过Pfu DNA聚合酶进行延伸。并入引物后，产生包含交错切口的突变质粒。在温度循环后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板并选择包含突变的合成DNA。也可使用本领域已知的用于制备、鉴别和分离变异体的其他方法，例如，基因重排或噬菌体展示技术。
通过本领域已知的任何方法可以完成多肽与其来源细胞的分离，所述方法包括，但不限于，从细胞附着培养中取下包含所需产物的细胞培养基；离心或过滤以去除非粘附细胞；等。
任选地，凝血因子VII多肽可以进一步纯化。纯化可以利用本领域已知的任何方法实现，所述方法包括，但不限于，亲和色谱法，例如，在抗凝血因子VII抗体柱上(参见，例如Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.261：11097，1986；和Thim等人，Biochem.27：7785，1988)；疏水作用色谱法；离子交换色谱法；大小排阻色谱法；电泳法(例如，制备型等电聚焦(IEF)、差异溶解(例如硫酸铵沉淀)，或提取等。一般参见，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，NewYork，1982；和Protein Purification，J.C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989。纯化后，该制剂优选包含少于10wt％、更优选少于5％、并最优选少于1％的来源于所述宿主细胞的非凝血因子VII多肽。
在本发明的上下文中，纯化包括至少一个阴离子交换色谱步骤。
如果未被本发明方法完全活化，则凝血因子VII多肽可以通过蛋白水解切割来活化，所述蛋白水解切割利用凝血因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其他蛋白酶，例如，凝血因子IXa、激肽释放酶、凝血因子Xa和凝血酶。参见，例如，Osterud等人，Biochem.11：2853(1972)；Thomas，美国专利号4,456,591；和Hedner等人，J.Clin.Invest.71：1836(1983)。可替代地，通过使其经过离子交换色谱柱例如Mono Q(Pharmacia)等，或通过在溶液中自体活化，可以将凝血因子VII多肽活化。所得到的活化凝血因子VII多肽随后可以如本申请中所述进行配制和施用。
下列实施例举例说明了本发明方法的实践。所包括的这些实施例仅用于举例说明的目的并不希望在任何方面限制本发明所要求的范围。
实施例1-利用Ca2+梯度缓冲液通过分级洗脱从阴离子交换材料中纯化批量凝血因子VII多肽
本发明方法可以如下进行：
包括阴离子交换材料(来自Amersham Biosciences的Q-Sepharose FF)的柱用WFI(注射用水)洗涤，并随后用NaCl/Glygly缓冲液(175mM NaCl和10mM Glygly)平衡。
将来源于细胞培养的批量rFVII(重组凝血因子VII；MW约50,000)在pH 8.5下应用于柱，由此基本上所有的凝血因子VII多肽批量与柱材料结合。具有所需糖型(唾液酸化的糖型)的凝血因子VII多肽的含量为约78％。凝血因子VII多肽的装载量为约20g/升基质(湿润形式的阴离子交换材料)。
柱用NaCl/Glygly缓冲液(175mM NaCl和10mM Glygly)，并随后用另一种NaCl/Glygly缓冲液(50mM NaCl和10mM Glygly)洗涤。
分级洗脱用在NaCl/Glygly缓冲液中的CaCl2梯度(0-15mMCaCl2；50mM NaCl和10mM Glygly)在40柱体积/小时的速率下进行。
Ca2+浓度阈值X设定为7.5mM。收集对应Ca2+浓度为7.5-13.5mM的部分，并预期具有所需糖型(唾液酸化的糖型)的凝血因子VII多肽的含量超过90％。
Claims (14)
1.一种用于纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分与阴离子交换材料结合的条件下，使所述批量凝血因子VII多肽与所述阴离子交换材料接触；
(b)用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料；和
(c)用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集作为洗出液的纯化的批量凝血因子VII多肽；
其中选择所述阈值X从而使得在第一个洗脱步骤(b)中从所述阴离子交换材料中去除至少5wt％的批量凝血因子VII多肽，并且在所述第二个洗脱步骤(c)中可以收集至少50wt％的批量凝血因子VII多肽作为纯化的批量凝血因子VII多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述阈值X为3-12mM。
3.一种用于纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在有利于所述批量凝血因子VII多肽的一部分与阴离子交换材料结合的条件下，使所述批量凝血因子VII多肽与所述阴离子交换材料接触；
(b)用包括浓度至多阈值X mM的Ca2+的第一种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料；和
(c)用包括浓度超过阈值X mM的Ca2+的第二种洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集作为洗出液的纯化的批量凝血因子VII多肽；
其中所述阈值X为3-12mM。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个洗脱步骤(b)通过使用梯度缓冲液来进行。
5.根据权利要求4的方法，其中所述梯度缓冲液的Ca2+最终浓度等于X。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二个洗脱步骤(c)通过使用梯度缓冲液来进行。
7.根据权利要求6的方法，其中所述梯度缓冲液的Ca2+初始浓度刚大于X。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个洗脱步骤(b)和所述第二个洗脱步骤(c)都利用梯度缓冲液来进行。
9.根据权利要求8的方法，其中所述梯度的Ca2+初始浓度为0-5mM，和所述梯度的Ca2+最终浓度为10-25mM。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个洗脱步骤(b)通过使用(恒定的)Ca2+浓度为1-7mM的批缓冲液形式的第一种洗脱缓冲液来进行，和所述第二个洗脱步骤(c)通过使用(恒定的)Ca2+浓度为8-25mM的批缓冲液形式的第二种洗脱缓冲液来进行。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述阴离子交换材料为强阴离子交换材料。
12.一种用于生产并纯化批量凝血因子VII多肽的工业规模方法，所述方法包括下列步骤：
(i)在细胞培养物中生产粗制的批量凝血因子VII多肽，和
(ii)通过利用一种或多种阴离子交换纯化方法的纯化顺序来纯化所述粗制的批量凝血因子VII多肽，
其中至少一种此类阴离子交换纯化方法如权利要求1-11中任一项所限定的进行。
13.根据权利要求12的方法，其中所述生产步骤(i)相对于所述粗制的批量凝血因子VII多肽的质量得率进行优化。
14.根据权利要求12-13中任一项的方法，其中所述粗制的批量在细胞培养物中的生产在7.0-7.6的pH值下进行。
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