CN101031586A - 通过去除desGla－因子Ⅶ多肽结构物来纯化因子Ⅶ多肽药品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有desGla－因子VII多肽结构物形式杂质的因子VII多肽药品的纯化方法。该方法利用阴离子交换材料并包含用预定pH的缓冲液洗涤和/或洗脱。
Description
技术领域
本发明涉及含有desGla-因子VII多肽结构物形式杂质的因子VII多肽药品的纯化方法。该方法利用阴离子交换材料并包含用预定pH的缓冲液洗涤和/或洗脱。
背景技术
在凝血级联中涉及的蛋白质，包含例如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和蛋白质C，被证明是治疗各种病理状态的有用治疗剂。相应地，对于包含药学上可接受的并显示一致且预定的临床效果的这些蛋白质的制剂的需要在不断上升。
用于纯化因子VII多肽药品的整个工业规模生产在某些情况下可能有下述缺点：药品包含大量相应的desGla-因子VII多肽结构物，即药品被视为包含大量杂质。当然，这是不期望的并且在某些情况下也是不能接受的。
据本发明人所知，工业规模生产中desGla-因子VII多肽结构物形成和去除的问题在现有技术中还未被充分关注。
发明内容
本发明人现在已发现通过进行在最关键步骤维持较低pH的特定阴离子交换操作可以减少或基本上消除药品中存在的desGla-因子VII多肽结构物。
本发明提供了用于纯化因子VII多肽药品的方法，所述药品包含至少3％的desGla-因子VII多肽结构物，所述方法包含下列步骤：
(a)在有利于所述药品的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下，使药品与阴离子交换材料接触；
(b)用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集纯化的因子VII多肽药品作为洗出液；
其中上样缓冲液和/或洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9。
因此，根据本发明的方法特别涉及含有大量desGla-因子VII多肽结构物杂质，即至少3％的desGla-因子VII多肽结构物的因子VII多肽药品。应当理解，在某些情况下，工业规模的因子VII多肽药品可以包含甚至更高量的desGla-因子VII多肽结构物，例如至少4％，例如至少4.5％，或至少5％的desGla-因子VII多肽结构物，并且本发明的方法更与此类药品相关。
当与因子VII多肽偶联使用时，desGla-因子VII多肽结构物的百分比(％)被定为重量百分比。
“desGla-因子VII多肽结构物”的表达意指其中在Lys38附近从因子VII多肽分子中切除了Gla结构域的因子VII多肽结构物。
如实施例1中所述通过SDS-PAGE可以确定因子VII多肽药品中的desGla-因子VII多肽结构物的含量。
尽管不局限于此，但本发明方法特别适合于“工业规模”(或“大规模”)的因子VII多肽药品。术语“工业规模”一般指下述方法，其中液体因子VII多肽组合物的体积为至少100L，例如至少500L，例如至少1000L，或至少5000L，或其中组合物的重量为至少100kg，例如至少500kg，例如至少1000kg，或至少5000kg，或其中产物重量为至少1g(干物质)，例如至少10g，例如至少50g，例如1-1000g或1-500g或1-100g。
本文所使用的“药品”的表达意指固体物质和液体物质，例如包含因子VII多肽的溶液或悬浮液。“药品”的表达特别指“大”体积或量，即指已知来自大规模和工业规模生产的体积和量。
术语“因子VII多肽”在下文中进一步限定。
步骤(a)-使药品与阴离子交换材料接触
在方法的第一个步骤中，因子VII多肽药品与阴离子交换材料接触。目的是促进所述因子VII多肽药品的一部分与所述阴离子交换材料结合。
与步骤(a)一起的术语“部分”指因子VII多肽药品中存在的至少30％(即30-100％)的因子VII多肽量。应当理解在大多数情况下希望结合远远超过30％的因子VII多肽量，例如至少50％，或至少70％，或占优势的部分。术语“占优势的部分”指因子VII多肽药品中存在的至少90％的因子VII多肽量。优选更高的部分与阴离子交换材料结合，例如至少95％的量，或至少98％的量，或至少99％的量，或甚至因子VII多肽药品中存在的基本上所有的因子VII多肽量。
因子VII多肽药品一般来源于工业规模的生产方法，例如细胞培养、克隆动物(例如，母牛、猪、绵羊、山羊和鱼)或昆虫等，特别是来自细胞培养。
阴离子交换材料优选强效阴离子交换材料，例如含有季铵基团的阴离子交换材料。此类材料的市售例子有DEAE Sepharose、BlueSepharose、和来自Amersham Biosciences的Q-Sepharose FastFlow，和来自Per Septive Biosystems或Tosohaas的POROS HQ 50。
阴离子交换材料的最普遍排列是柱的形式。批容器中的排列当然也可以。
因子VII多肽药品一般直接得自前述纯化步骤，或得自在必要的情况下后来调整了pH、离子强度、二价金属离子螯合作用等的前述纯化步骤。
应用到阴离子交换材料之前和正在应用到阴离子交换材料上的药品的pH看来对desGla-因子VII多肽结构物的形成起相应的作用。因此，优选药品为液体形式并且在应用到阴离子交换材料时的pH为2.0-6.9，例如3.0-6.5或3.5-6.9。在某些令人感兴趣的实施方案中，药品的pH为2.0-6.8，例如3.0-6.8或3.5-6.8，或pH为2.0-6.7，例如3.0-6.7或3.5-6.7，或pH为2.0-6.6，例如3.0-6.6或3.5-6.6，或pH为2.0-6.5，例如3.0-6.5或3.5-6.5，或pH为2.0-6.4，例如3.0-6.4或3.5-6.4。
一般地，但不限制地，传导率为5-30mS/cm，例如10-20mS/cm。药品的温度一般为，但不限于，0-15℃，例如约2-10℃。
结合了因子VII多肽的阴离子交换材料的温度一般为，但不限于，0-15℃，例如约2-10℃，例如通过使用冷却套管和控制温度的溶液来维持在特定范围内。
因子VII多肽药品的接触一般根据常规方案来进行，即药品的浓度、温度、离子强度等可以按照惯例，并且阴离子交换材料在应用前可以常规地进行洗涤和达到平衡。
因子VII多肽的装载量一般为10-40g，例如15-30g因子VII多肽/升基质(湿润形式的阴离子交换材料)，并且药品一般应用的流速为3-200柱体积/小时(CV/h)，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如80-120CV/h。
步骤(b)-洗涤步骤
因子VII多肽药品与阴离子交换材料结合后，进行洗涤步骤(b)以从阴离子交换材料中去除大部分desGla-因子VII多肽结构物。通过这个步骤，阴离子交换材料上剩余(结合)部分的因子VII多肽将含有非常少量的desGla-因子VII多肽结构物。
这个洗涤步骤(b)优选用pH为2.0-6.9，例如3.0-6.5或3.0-6.9的洗涤缓冲液来进行。在某些令人感兴趣的实施方案中，洗涤缓冲液的pH为2.0-6.8，例如3.0-6.8或3.5-6.8，或pH为2.0-6.7，例如3.0-6.7或3.5-6.7，或pH为2.0-6.6，例如3.0-6.6或3.5-6.6，或pH为2.0-6.5，例如3.0-6.5或3.5-6.5，或pH为2.0-6.4，例如3.0-6.4或3.5-6.4。
洗涤步骤(b)一般以3-200柱体积/小时(CV/h)的流速来进行，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，或至少40CV/h，或至少80CV/h，例如80-120CV/h。
洗涤缓冲液一般为包含缓冲剂的水溶液，缓冲剂一般包含至少一种选自下列酸和盐的组分：MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、组氨酸、咪唑、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰胺、磷酸、乙酸(例如乙酸钠)、乳酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸和琥珀酸。应当理解缓冲剂可以包含两种或多种组分的混合物，其中所述混合物能够提过指定范围内的pH值。作为例子可以被提及的是乙酸和乙酸钠等。
洗涤缓冲液还可包含盐等，一般为其浓度不足以进行从柱中洗脱因子VII多肽的阴离子。在pH 6.0时，洗涤缓冲液的组成可以是100-250mM NaCl，约10mM组氨酸(缓冲剂)，pH 6.0。
应当理解洗涤步骤(b)可以利用一种、两种或数种不同的洗涤缓冲液来进行，或通过应用梯度洗涤缓冲液来进行。
步骤(c)-洗脱步骤
在洗涤步骤后，(c)用洗脱缓冲液洗脱阴离子交换材料，并收集纯化的因子VII多肽药品作为洗出液。
洗脱步骤(c)可以存在大量的变化性。如果洗脱非常快速地进行，即使洗脱在超过6.9的pH下进行，也可以抑制大量desGla-因子VII多肽结构物的形成。然而，为了避免形成desGla-因子VII多肽结构物，优选洗脱缓冲液的pH也为2.0-6.9，例如3.0-6.5或3.5-6.9。在某些令人感兴趣的实施方案中，洗脱缓冲液的pH为2.0-6.8，例如3.0-6.8或3.5-6.8，或pH为2.0-6.7，例如3.0-6.7或3.5-6.7，或pH为2.0-6.6，例如3.0-6.6或3.5-6.6，或pH为2.0-6.5，例如3.0-6.5或3.5-6.5，或pH为2.0-6.4，例如3.0-6.4或3.5-6.4。
洗脱步骤(c)一般以3-200柱体积/小时(CV/h)的流速来进行，例如至少10CV/h，例如至少20CV/h，例如20-60CV/h。
洗脱的类型不是特别关键，因此，可以用包含二价阳离子的洗脱缓冲液来洗脱，利用高浓度的特定阴离子进行竞争洗脱，或利用pH梯度，或上述的组合。
在一个实施方案中，使用包含一种或多种二价阳离子的洗脱缓冲液来有效洗脱。二价阳离子的浓度一般为至少5mM，例如至少10mM，或甚至至少15mM。
二价阳离子优选包含至少一种选自Ca2+、Sr2+、Mg2+和Ba2+的二价阳离子。此类二价阳离子有结合因子VII多肽的Gla结构域的趋势，并将从而促进因子VII多肽药品从阴离子交换材料中释放。在一个优选实施方案中，二价阳离子包含Ca2+。
洗脱缓冲液一般含有浓度为至少5mM，例如5-100mM，例如10-40mM的二价阳离子。
在一个不同的方案中，洗脱缓冲液是关于二价阳离子(例如Ca2+)的梯度缓冲液，例如其中二价阳离子(例如Ca2+)的起始浓度为0-20mM，和梯度缓冲液的二价阳离子(例如Ca2+)的最终浓度为15-100mM的梯度缓冲液。
在另一实施方案中，洗脱步骤(c)通过药品与一种或多种阴离子例如一价、二价或三价阴离子的竞争洗脱来进行。此类阴离子一般选自氯化物、乙酸盐、丙二酸盐、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐和硝酸盐；特别是氯化物(Cl-)、乙酸盐和丙二酸盐。
在一个不同的方案中，洗脱缓冲液含有浓度为100-800mM，例如200-500mM的Cl-。或者，洗脱缓冲液是关于Cl-的梯度缓冲液，例如其中Cl-的起始浓度为0-300mM，和Cl-的最终浓度为300-1000mM的梯度缓冲液。
在一个进一步的不同的方案，洗脱缓冲液含有浓度为100-800mM，例如200-500mM的丙二酸盐。或者，洗脱缓冲液是关于丙二酸盐的梯度缓冲液，例如其中丙二酸盐的起始浓度为0-300mM，和丙二酸盐的最终浓度为300-1000mM的梯度缓冲液。
在另外一个进一步的不同的方案，洗脱缓冲液含有浓度为100-1000mM，例如400-800mM的乙酸盐。或者，洗脱缓冲液是关于乙酸盐的梯度缓冲液，例如其中乙酸盐的起始浓度为0-400mM，和乙酸盐的最终浓度为400-1000mM的梯度缓冲液。
在另外一个实施方案中，洗脱缓冲液是关于pH的梯度缓冲液。在其一个不同的方案中，梯度缓冲液的起始pH为5.0-6.9，和梯度缓冲液的最终pH为2.5-4.5。
在某些实施方案中，选自上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的至少一种缓冲液的pH为2.0-6.9。在某些特别优选的实施方案中，洗涤缓冲液以及洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9。在其他实施方案中，上样缓冲液以及洗涤缓冲液的pH为2.0-6.9。在其他实施方案中，上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中每一个的pH为2.0-6.9。在其他实施方案中，上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中只有一个的pH为2.0-6.9。
当洗脱缓冲液有pH梯度时，可以将洗涤步骤(b)与洗脱步骤(c)组合，因此在这种情况下，起始pH为4.5-6.9，和最终pH为2.5-4.5的pH梯度将产生有用的特征，其中放弃最前部并收集剩余部分。
关于洗脱步骤(c)，一般而言，优选洗脱缓冲液的离子强度为100-1000mM，例如200-800mM。
术语“纯化的药品”指所得到的药品，即步骤(c)中所收集的药品，与步骤(a)中应用的药品相比，具有较低含量的desGla-因子VII多肽结构物。术语“纯化”指其中可以获得纯化的药品的方法，即本发明的方法。
已发现本发明的方法能够非常有效地从因子VII多肽药品中去除desGla-因子VII多肽结构物，还能够抑制这种desGla-因子VII多肽结构物的形成。因此，在一个优选实施方案中，与步骤(a)中的药品相比，在步骤(c)中收集的纯化的因子VII多肽药品包含至少少于1个百分点的desGla-因子VII多肽结构物。
更具体而言，纯化的因子VII多肽药品包含至多2.5％，例如至多2.0％，或至多1.5％的desGla-因子VII多肽结构物。
通常，为了一系列步骤的后续使用，阴离子交换材料是再生的。
具体实施方式
本方法对于获得纯化的因子VII多肽药品特别有用，并且如果适当选择步骤(a)-(c)关于pH的条件，则甚至可以减少desGla-因子VII多肽结构物的形成并从而提高该方法的总产率。
因此，本发明的一个优选实施方案提供了用于纯化因子VII多肽药品的方法，所述药品包含至少4％的desGla-因子VII多肽结构物，所述方法包含下列步骤：
(a)在有利于所述药品的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下使所述药品与阴离子交换材料接触，所述药品为液体形式并且pH为2.0-6.9；
(b)用pH为2.0-6.9的洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9并包含二价阳离子，并收集作为洗出液的纯化的因子VII多肽药品，收集的纯化的药品包含至多2.0％的desGla-因子VII多肽结构物。
因子VII多肽
如本文所使用的，术语“因子VII多肽”涵盖了野生型因子VII(即具有美国专利号4,784,950中所公开的氨基酸序列的多肽)，以及显示出相对于野生型因子VII基本上相同或改进的生物活性的因子VII的变体、衍生物和结合物。术语“因子VII”意欲涵盖以其未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及已用蛋白水解处理以产生其分别的生物活性形式的那些，它们可以被称为因子VIIa。一般地，因子VII在残基152和153之间切割以产生因子VIIa。术语“因子VII多肽”还涵盖了其中因子VIIa的生物活性相对于野生型因子VIIa已基本上修饰或略微减少的多肽，包含变体。这些多肽包含，但不限于，其中已导入修饰或破坏多肽生物活性的特定氨基酸序列改变的因子VII或因子VIIa。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性来源于其下列能力：(i)结合组织因子(TF)，和(ii)催化因子IX或因子X蛋白水解切割以产生活化因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)。
术语“改良的生物活性”指i)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增强的蛋白水解活性的FVII多肽，或ii)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增强的TF结合活性的FVII多肽，或iii)与重组野生型人因子VIIa相比，具有基本上相同或增加的血浆半衰期的FVII多肽。
对本发明来说，因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物活性”)可以通过测量制剂促进血液凝固的能力来量化，参照本文所述的测定法4。在这个测定法中，生物活性表示为相对于对照样品凝固时间减少，并通过与包含1单位/mL因子VII活性的混合人血清标准的比较转换为“因子VII单位”。或者，因子VIIa的生物活性可以通过下列方法进行量化：(i)测量因子VIIa或因子VII相关多肽在包含嵌入类脂膜的TF和因子X的系统中产生活化因子X(因子Xa)的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.272：19919-19924，1997)；(ii)测量因子X在水系统中的水解(“体外蛋白水解测定法”，参见下文的测定法2)；(iii)利用基于表面等离子体共振的仪器测量因子VIIa或因子VII相关多肽与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.413：359-363，1997)；(iv)测量由因子VIIa和/或因子VII相关多肽对合成的底物的水解(“体外水解测定法”，参见下文的测定法1)；或(v)测量体外系统中不依赖TF的凝血酶的产生(参见下文的测定法3)。
具有相对于野生型因子VIIa基本上相同或改良的生物活性的因子VII变体涵盖当在一个或多个如上所述的凝集测定法(测定法4)、蛋白水解测定法(测定法2)、或TF结合测定法中测试时，显示出在相同细胞类型中产生的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％和最优选至少约90％的因子VIIa的特异活性的那些。具有相对于野生型因子VIIa基本上减少的生物活性的因子VII变体是当在一个或多个如上所述的凝集测定法(测定法4)、蛋白水解测定法(测定法2)、或TF结合测定法中测试时，显示出在相同细胞类型中产生的少于约25％、优选少于约10％、更优选少于约5％和最优选少于约1％的因子VIIa的特异活性的那些。具有相对于野生型因子VIIa基本上修饰的生物活性的因子VII变体包含，但不限于，显示TF不依赖性因子X蛋白水解活性的因子VII变体以及结合TF但不切割因子X的那些。
无论是显示基本上相同或比野生型因子VII更好的生物活性，还是或者显示相对于野生型因子VII基本上修饰或减少的生物活性的因子VII变体包含，但不限于，具有通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代而不同于野生型因子VII序列的氨基酸序列的多肽。
具有与野生型因子VII基本上相同的生物活性的因子VII变体的非限制性例子包含S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；如美国专利号5,580,560中所公开的显示增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；已在残基290和291之间或残基315和316之间进行蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；氧化形式的因子VIIa(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；如PCT/DK02/00189中所公开的FVII变体；和如WO 02/38162(Scripps Research Institute)中所公开的显示增加的蛋白水解稳定性的FVIIa变体；如WO 99/20767(University ofMinnesota)中所公开的具有修饰的Gla结构域并显示增强的膜结合性的FVII变体；和如WO 01/58935(Maxygen ApS)中所公开的FVII变体。
相对于野生型FVIIa具有增加的生物活性的因子VII变体的非限制性例子包含如WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO03/27147、WO 03/37932、WO 02/38162(Scripps Research Institute)所公开的因子VII变体；和如JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中所公开的具有增强活性的因子VII变体。
相对于野生型因子VII具有基本上减少或修饰的生物活性的因子VII变体的非限制性例子包含R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem29：3413-3420，1990)、S344A-FVIIa(Ka zama等人，J.Biol.Chem.270：66-72，1995)、FFR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15：515-520，1998)、和缺少Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等人，FEBS Letts.317：245-249，1993)
因子VII多肽的例子包含，但不限于，野生型因子VII、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K 337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、和S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII 、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-因子VII、S60A-因子VII；
R152E-因子VII、S344A-因子VII、缺少Gla结构域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在233Thr-240Asn的氨基酸序列中有取代、添加或缺失的FVII、在304Arg-329Cys的氨基酸序列中有取代、添加或缺失的FVII、和在Ile153-Arg223的氨基酸序列中有取代、缺失或添加的FVII。
如本文所使用的术语“因子VII衍生物”意指显示出相对于野生型因子VII基本上相同或改良的生物活性的FVII多肽，其中原始肽的一个或多个氨基酸已经过遗传学和/或化学和/或酶修饰，例如通过烷化、糖基化、聚乙二醇化(PEGylation)、酰化、酯的形成或酰胺的形成等。这包含但不限于聚乙二醇化人因子VIIa、半胱氨酸-聚乙二醇化人因子VIIa及其变体。因子VII衍生物的非限制性例子包含如WO 03/31464和美国专利申请US 20040043446、US 20040063911、US20040142856、US 20040137557、和US 20040132640(NeoseTechnologies、Inc.)中所公开的糖基聚乙二醇化(GlycoPegylated)FVII衍生物；如WO 01/04287、美国专利申请20030165996、WO01/58935、WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO 02/02764、美国专利申请20030211094(University of Minnesota)中所公开的FVII偶联物。
术语“聚乙二醇化人因子VIIa”指具有与人因子VIIa多肽偶联的PEG分子的人因子VIIa。应当理解，PEG分子可以与因子VIIa多肽的任何部分结合，所述任何部分包含因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。术语“半胱氨酸-聚乙二醇化人因子VIIa”指具有PEG分子的因子VIIa，所述PEG分子与人因子VIIa中导入的半胱氨酸的巯基偶联。
在一个优选实施方案中，因子VII多肽通过DNA重组技术进行制备(重组因子VII多肽)。
在某些实施方案中，因子VII多肽是人因子VIIa(hFVIIa)，优选重组制备的人因子VIIa(rhFVIIa)。在某些实施方案中，因子VII多肽是聚乙二醇化因子VII，优选聚乙二醇化重组制备的人因子VIIa。
在其他实施方案中，因子VII多肽是因子VII序列变体。
在某些实施方案中，因子VII多肽具有不同于野生型人因子VII的糖基化。
在各种实施方案中，例如其中因子VII多肽是因子VII相关多肽或因子VII序列变体的那些，当在如本说明书中所述的“体外蛋白水解测定法”(测定法2)中测试时，因子VII多肽的活性和天然的人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率为至少约1.25，优选至少约2.0、或4.0，最优选至少约8.0。
在某些实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽，特别是变体，其中当在“体外蛋白水解测定法”(参见下文的测定法1)中测试时，所述因子VII多肽的活性和天然的人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比率为至少约1.25；在其他实施方案中，该比率为至少约2.0；在进一步的实施方案中，该比率为至少约4.0。
纯化的因子VII多肽药品的用途
对应纯化的因子VII多肽药品的成分收集后可以配制为溶液，所述溶液可以分装到管形瓶中并冷冻干燥。作为对应市售、重组制备的FVII多肽组合物NovoSeven(Novo Nordisk A/S，Denmark)的最终产物的举例说明性例子，可以提及的是包含1.2mg重组人因子VIIa、5.84mg NaCl、2.94mg CaCl2、2H2O、2.64mg GlyGly、0.14mg聚山梨醇酯80、和60.0mg甘露醇的管形瓶(1.2mg)。这种产物在使用前用2.0mL注射用水(WFI)复原至pH5.5。当复原时，蛋白质溶液对于24小时内使用是稳定的。
重组活化因子VII(rFVIIa)的整个生产过程由Jurlander等人在Thrombosis and Hemostasis，第27卷，No.4，2001中描述。
实施例
适合于确定因子VII多肽生物活性的测定法
依照本发明使用的因子VII多肽可以通过适当的测定法来选择，所述测定法可以作为简单初步的体外测试进行。因此，本说明书公开了关于因子VII多肽活性的简单测试(命名为“体外蛋白水解测定法”)。
体外蛋白水解测定法(测定法1)
可以测定天然的(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(这两种在本文都称为“因子VIIa”)的特异活性。它们还可进行平行测定以直接比较它们的特异活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行。将终浓度为1mM的显色底物D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到在pH 7.4，包含0.1M NaCl、5mM CaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白的50mM HEPES中的因子VIIa(终浓度为100nM)。在SpectraMaxTM340读板仪(Molecular Devices，USA)上连续测量405nm处的吸光度。在孵育20分钟后产生的吸光度减去不合酶的空白孔的吸光度后用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa活性之间的比率：
比率＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子VIIa)。
基于上式可以鉴别具有比天然因子VIIa更低、相当或更高活性的因子VII多肽，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为约1.0相对大于1.0的因子VII多肽。
利用生理学底物例如100-1000nM适当浓度的因子X(“体外蛋白水解测定法”)也可测量因子VII多肽的活性，其中在加入适当显色底物(例如S-2765)后测量产生的因子Xa。此外，该活性测定法可以在生理学温度下进行。
体外蛋白水解测定法(测定法2)
平行测定天然的(野生型)因子VIIa和因子VII多肽(这两种在本文都称为“因子VIIa”)以直接比较它们的特异活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将在pH 7.4，包含0.1M NaCl、5mM CaCl2和1mg/mL牛血清白蛋白的100μL 50mM HEPES中的因子VIIa(10nM)和因子X(0.8microM)孵育15分钟。随后通过加入pH 7.4，包含0.1M NaCl、20mM EDTA和1mg/mL牛血清白蛋白的50μL 50mM HEPES来终止因子X切割。通过加入终浓度为0.5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide(S-2765，Chromogenix，Sweden)来测量所产生的因子Xa的量。在SpectraMaxTM340读板仪(Molecular Devices，USA)上连续测量405nm处的吸光度。在孵育10分钟时产生的吸光度减去不含FVIIa的空白孔的吸光度后用于计算因子VII多肽和野生型因子VIIa蛋白水解活性之间的比率：
比率＝(A405nm因子VII多肽)/(A405nm野生型因子VIIa)。
基于上式可以鉴别具有比天然因子VIIa更低、相当或更高活性的因子VII多肽，例如，其中因子VII多肽的活性与天然因子VII(野生型FVII)的活性之间的比率为约1.0相对大于1.0的因子VII多肽。
凝血酶产生测定法(测定法3)
在包含生理浓度的所有相关凝血因子和抑制剂(当模拟血友病A病状时，除去因子VIII)和活化血小板的测定法(测定法3)中还可测量因子VIIa或因子VII多肽产生凝血酶的能力(如Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中第543页所述，所述文献据此引入本文作为参考)。
单步凝集测定法(测定法4)
还可使用单步凝集测定法(测定法4)来测量因子VII多肽的生物活性。为此，将待测样品稀释于50mM PIPES缓冲液(pH7.5)中，将0.1％BSA和40μl与40μl缺乏因子VII的血浆和包含10mM Ca2+和合成磷脂的80μl人重组组织因子一起孵育。在平行线性测定法中测量凝集时间并利用参照标准与标准曲线进行比较。
因子VII多肽的制备与纯化
适用于本发明的纯化的人因子VIIa优选通过例如，Hagen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2412-2416，1986或欧洲专利号0 200421(ZymoGenetics，Inc.)中所述DNA重组技术来制备。
还可通过Broze and Majerus，J.Biol.Chem.255(4)：1242-1247，1980和Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841，1983所述方法来产生因子VII。通过包含作为最后纯化步骤的另外的凝胶过滤法可以得到更进一步纯化的因子VII制剂。随后通过已知方法将因子VII转化为活化的因子VIIa，例如通过几种不同的血浆蛋白质，例如因子XVIIa、IXa或Xa。或者，如Bjoern等人所描述的(ResearchDisclosure，269September 1986，第564-565页)，通过使其经过离子交换色谱柱例如Mono Q(Pharmaciafine Chemicals)等，或通过在溶液中自体活化，可以将因子VII完全激活。
通过修饰野生型因子VII或通过重组技术可以产生因子VII相关多肽。与野生型因子VII比较时具有改变的氨基酸序列的因子VII相关多肽可以通过下列方法来产生：通过已知方法例如定点诱变改变编码天然因子VII的核酸中的氨基酸密码子或通过去除某些氨基酸密码子来修饰编码野生型因子VII的核酸序列。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以在因子VIIa分子功能关键区域之外进行置换并仍产生活性多肽。因子VII多肽活性必需并因此优选不实施取代的氨基酸残基可以根据本领域已知程序进行鉴别，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个带正电荷的残基上导入突变，并测试所得突变体分子的凝集活性、分别的交联活性以鉴别对分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点还可通过分析三维结构进行确定，所述三维结构根据技术例如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记法进行确定(参见，例如de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journal ofMolecular Biology 224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBSLetters 309：59-64)。
通过定点诱变利用本领域已知的任何方法可以将突变导入核酸序列以使一种核苷酸替换为另一种核苷酸。特别有用的是采用超螺旋双链DNA载体的方法，所述DNA载体含有目的插入片段和包含所需突变的2个合成引物。每一个与载体的相反链互补的寡核苷酸引物在温度循环过程中通过Pfu DNA聚合酶进行延伸。并入引物后，产生包含交错切口的突变质粒。在温度循环后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板并选择包含突变的合成DNA。也可使用本领域已知的用于制备、鉴别和分离变体的其他方法，例如，基因重排或噬菌体展示技术。
通过本领域已知的任何方法可以完成多肽与其起源细胞的分离，所述方法包含，但不限于，从细胞附着培养中取下包含所需产物的细胞培养基；离心或过滤以去除非粘附细胞；等。
任选地，因子VII多肽可以进一步纯化。纯化可以利用本领域已知的任何方法实现，所述方法包含，但不限于，亲和色谱法，例如，在抗因子VII抗体柱上(参见，例如Waka bayashi等人，J.Biol.Chem.261：11097，1986；和Thim等人，Biochem.27：7785，1988)；疏水作用色谱法；离子交换色谱法；分子筛析色谱法；电泳法(例如，制备型等电聚焦(IEF)、溶解性差异(例如磷酸铵沉淀)，或提取等。一般参见，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，NewYork，1982；和Protein Purification，J.C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989。纯化后，该制剂优选包含少于10重量％、更优选少于5％、并最优选少于1％的来源于宿主细胞的非因子VII多肽。
在本发明的上下文中，纯化包含至少一个阴离子交换色谱步骤。
如果未被本发明方法完全活化，则因子VII多肽可以通过蛋白水解切割来活化，所述蛋白水解切割利用因子XIIa或具有胰岛素样特异性的其他蛋白酶，例如，因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶。参见，例如，Osterud等人，Biochem.11：2853(1972)；Thomas，美国专利号4,456,591；和Hedne r等人，J.Clin.Invest.71：1836(1983)。或者，通过使其经过离子交换色谱柱例如Mono Q(Pharmacia)等，或通过在溶液中自体活化，可以将因子VII多肽活化。所得到的活化因子VII多肽随后可以如本申请中所述进行配制和施用。
下列实施例举例说明了本发明方法的实践。所包含的这些实施例仅用于举例说明的目的，并不希望在任何方面限制本发明所要求的范围。
实施例1：desGla-因子VII多肽结构物含量的确定
通过SDS-PAGE确定desGla-因子VII多肽结构物相对于全长因子VII多肽结构物的含量。将150μl样品加入50μl样品缓冲液(非还原型，NuPAGE)中并煮沸5分钟。将10μl样品加到12％BisTris NuPAGEGel(Invitrogen)上。凝胶在200伏，120mA下运行55分钟。凝胶利用考马斯亮蓝溶液进行染色、脱色并干燥。根据desGla-因子VII多肽带的面积除以在大约50kDa处的因子VII多肽带和在大约45kDa处的desGla-因子VII多肽带的面积来计算desGla-因子VII多肽的相对含量。
实施例A
阴离子交换色谱在用Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow填充，用5CV的包含5mM EDTA、10mM组氨酸，pH 6.0的溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/mlFVIIa类似物包含12％的desGla-因子VII多肽结构物的40CV已过滤溶液，随后为利用50mM NaCl、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV洗涤液。利用在pH6.0下通过10mM组氨酸缓冲、25mM NaCl-50mM CaCl2、25mM NaCl的10CV梯度进行洗脱。整个纯化在20CV/h的流速和5℃的温度下进行。
产物峰大约在12mM CaCl2处洗脱。洗出液通过SDS-PAGE进行分析，它将显示desGla-因子VII多肽结构物含量少于2％(低于检测极限)。
实施例B
阴离子交换色谱在用Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow填充，用包含5mM柠檬酸三钠、10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0的5CV溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/ml FVIIa类似物包含12％的desGla-因子VII多肽结构物的40CV已过滤溶液，随后为利用50mM NaCl、10mM三羟甲基氨基甲烷和pH 8.0的5CV洗涤液。利用在pH6.0下通过10mM组氨酸缓冲、50mM NaCl-750mM NaCl的20CV梯度进行洗脱。整个纯化在10CV/h的流速和5℃的温度下进行。
产物峰大约在350mM NaCl处洗脱。洗出液通过SDS-PAGE进行分析，它将显示desGla-因子VII多肽结构物含量少于2％(低于检测极限)。
实施例C
阴离子交换色谱在用Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow填充，用包含5mM EDTA、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/mlFVIIa类似物包含10％的desGla-因子VII多肽结构物的40CV已过滤溶液，随后为利用50mM NaCl、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV洗涤液。利用25mM NaCl，25mM柠檬酸，25mM组氨酸，pH6-25mM NaCl，25mM柠檬酸，25mM组氨酸，pH3的25CV梯度进行洗脱。整个纯化在20CV/h的流速和5℃的温度下进行。
实施例D
阴离子交换色谱在用Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow填充，用包含5mM柠檬酸盐、10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0的5CV溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/ml FVIIa类似物(包含10％的desGla-因子VII多肽结构物)的40CV已过滤溶液，随后为利用150mM NaCl、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV洗涤液。利用在pH6.0下通过10mM组氨酸缓冲、0mM NaCl-750mM NaCl的20CV梯度进行洗脱。整个纯化在10CV/h的流速和5℃的温度下进行。
实施例E
阴离子交换色谱在用POROS 50HQ填充，用包含5mM EDTA、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/ml FVIIa类似物(包含10％的desGla-因子VII多肽结构物)的40CV已过滤溶液，随后为利用175mM NaCl、10mM组氨酸，pH 6.0的5CV洗涤液。利用在pH6.0下通过10mM组氨酸缓冲、50mM NaCl-30mM CaCl2、50mM NaCl的25CV梯度进行洗脱。整个纯化在80CV/h的流速和5℃的温度下进行。
参照实施例F
阴离子交换色谱在用Q Sepharose FF填充，用包含10mM Glygly，pH 8.6的5CV溶液平衡的柱(1cm内径×10cm高度＝7.85ml柱体积(CV))上进行。装载物为包含1mg/ml FVIIa(包含10％的desGla-因子VII多肽结构物)的40CV已过滤溶液，随后为利用175mM NaCl、10mM Glygly，pH 8.6的5CV洗涤液。利用在pH 8.6下通过10mM Glygly缓冲、50mM NaCl-30mM CaCl2、50mM NaCl的25CV梯度进行洗脱。整个纯化在40CV/h的流速和5℃的温度下进行。
SDS-PAGE显示5-10％的desGla-因子VII多肽含量。通过RP-HPLC的质量平衡显示80％的步骤产率，即损耗约为20％。
Claims (30)
1.一种纯化重组因子VII多肽药品的方法，所述药品包含至少3％的desGla-因子VII多肽结构物，所述方法包含下列步骤：
(a)在有利于所述药品的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下使所述药品与阴离子交换材料接触；
(b)用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，并收集纯化的因子VII多肽药品作为洗出液；
其中所述上样缓冲液和/或洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中所述因子VII多肽药品包含至少4％的desGla-因子VII多肽结构物。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(a)中所述药品为液体形式并且pH为2.0-6.9。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗涤缓冲液的pH为2.0-6.9。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗涤缓冲液和所述洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9。
7.根据权利要求5和6中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH至多为6.5。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液包含一种或多种二价阳离子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述二价阳离子包含至少一种选自Ca2+、Sr2+、Mg2+和Ba2+的二价阳离子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述二价阳离子包含Ca2+。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液具有浓度为至少5mM，例如5-100mM的二价阳离子。
12.根据权利要求8-11中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液是关于二价阳离子的梯度缓冲液。
13.根据权利要求12的方法，其中所述梯度缓冲液的二价阳离子的起始浓度为0-20mM，和所述梯度缓冲液的二价阳离子的最终浓度为15-100mM。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱步骤(c)通过所述药品与一种或多种阴离子的竞争洗脱来进行。
15.根据权利要求14的方法，其中所述阴离子选自氯化物、乙酸盐、丙二酸盐、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐和硝酸盐。
16.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液具有浓度为100-800mM的Cl-。
17.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液是关于Cl-的梯度缓冲液。
18.根据权利要求17的方法，其中所述梯度缓冲液的Cl-的起始浓度为0-300mM，和所述梯度缓冲液的Cl-的最终浓度为300-1000mM。
19.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液具有浓度为100-800mM的丙二酸盐。
20.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液是关于丙二酸盐的梯度缓冲液。
21.根据权利要求20的方法，其中所述梯度缓冲液的丙二酸盐的起始浓度为0-300mM，和所述梯度缓冲液的丙二酸盐的最终浓度为300-1000mM。
22.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液具有浓度为100-1000mM的乙酸盐。
23.根据权利要求15的方法，其中所述洗脱缓冲液是关于乙酸盐的梯度缓冲液。
24.根据权利要求23的方法，其中所述梯度缓冲液的乙酸盐的起始浓度为0-400mM，和所述梯度缓冲液的乙酸盐的最终浓度为400-1000mM。
25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液是关于pH的梯度缓冲液。
26.根据权利要求25的方法，其中所述梯度缓冲液的起始pH为5.0-6.9，和所述梯度缓冲液的最终pH为2.5-4.5。
27.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液的离子强度为100-1000mM。
28.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(c)中收集的所述纯化的因子VII多肽药品包含比步骤(a)中所述药品至少少1个百分点的desGla-因子VII多肽结构物。
29.根据权利要求22的方法，其中所述纯化的因子VII多肽药品包含至多2.0％的desGla-因子VII多肽结构物。
30.一种用于纯化因子VII多肽药品的方法，所述药品包含至少4％的desGla-因子VII多肽结构物，所述方法包含下列步骤：
(a)在有利于所述药品的一部分与所述阴离子交换材料结合的条件下使所述药品与阴离子交换材料接触，所述药品为液体形式并且pH为2.0-6.9；
(b)用pH为2.0-6.9的洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换材料；和
(c)用洗脱缓冲液洗脱所述阴离子交换材料，所述洗脱缓冲液的pH为2.0-6.9并包含二价阳离子，并收集纯化的因子VII多肽药品作为洗出液，所述收集的纯化的药品包含至多2.0％的desGla-因子VII多肽结构物。
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