CN102660632A

CN102660632A - 一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

Info

Publication number: CN102660632A
Application number: CN2012101103985A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 薛亚平; 王威; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明提供了一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。本发明将待测样品与手性的S-或R-扁桃酸及其衍生物单体进行反应后，取反应转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行显色反应，若有黄亮色絮状沉淀生成，且添加NaOH溶液后黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有与底物的立体构型一致的脱氢酶；若显淡绿色，表明待测样品中不含有与底物的立体构型一致的脱氢酶。本方法基于简单的显色法能快速的确定被测样品的脱氢酶活性及选择性，具有操作简单，反应灵敏，检测迅速，设备要求低，通用性强等优点，为具有一种光学选择性手性扁桃酸及其相关衍生物脱氢酶的筛选带来了极大的便利。

Description

一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

(一)技术领域

本发明涉及一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

(二)背景技术

立体选择性α-羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋α-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的α-酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的α-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的α-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。

利用α-羟酸脱氢酶拆分外消旋α-羟酸生产手性的α-羟酸，拓宽光学活性化合物的生产方法，具有重要的意义。近年来已有一些研究把目光放在了利用微生物或者酶法来拆分外消旋α-羟酸及其相关衍生物。

光学活性的α-羟酸是指手性碳上带有羟基同时带有羧基的一类化合物，是重要的手性“砌块”，可用于不对称合成大量生物活性分子。在这类化合物中，光学纯扁桃酸在商业角度上被认为是最重要的代表。扁桃酸又称a-羟基苯乙酸、苯乙醇酸、苦杏仁酸，其R型和S型的结构式如下：

光学活性的扁桃酸及其衍生物是一种极为重要的药物中间体：如R-(-)-扁桃酸广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素，青霉素，抗肿瘤制剂，抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A、氯吡格雷等。S-(+)-扁桃酸则是合成S-(+)-奥昔布宁的前体原料，S-(+)-奥昔布宁临床用于治疗尿急、尿频、尿失禁。研究表明，单一构型的扁桃酸所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；光学活性的扁桃酸还可以用作手性溶剂，用于多种不对称合成反应；光学活性的扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋胺类和氨基酸类以非对映体异构盐形成进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R-扁桃酸拆分。扁桃酸其苯环上不同位置上不同的卤素取代基的衍生物同样具有优良的医药用途，如苯环上单氟或多氟取代的扁桃酸衍生物(如邻氟扁桃酸、间氟扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸等)是一类控制体重的苯乙醇胺类药物的重要中间体，3，5-二氟扁桃酸的酰胺衍生物是一种很好的C-端氨基醇二肽Aβ抑制剂。氯代物方面邻间对位置具有广泛的运用，特别是(R)-邻氯扁桃酸是全球销售额第二药物氯吡格雷合成的关键手性砌块，2009年全球销售额高达99亿美元，单药销售收入排名全球第2位，是目前最畅销的药物之一。

光学活性扁桃酸侧链不同长度的衍生物也非常的有价值，苯基乳酸是一些重要的化学合成物前体，并广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸是抗高血压首选药-普利类药物合成的重要原料。

据不完全统计，目前国际市场上光学活性的α-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；学活性的α-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。

目前已报道的用于拆分α-羟酸的含有立体选择性α-羟酸脱氢酶的微生物菌株主要有Alcaligenes bronchisepticus，Pseudomonas polycolor，Brevibacterium.sp，Pseudomonas sp，Alcaligenes faecalis，Pseudomonasputida等，这些已报道的菌株均存在活性低，反应时间长，转化率低等问题，难以工业化。

虽然利用生物法拆分扁桃酸及其相关的衍生物取得了一定的成果，但立体选择性α-羟酸脱氢酶生物催化剂的筛选还是利用传统的GC或HPLC法去对海量的微生物或酶逐一检测，费时又费力，造成工作效率不高；另一方面，随着蛋白质定向进化技术的不断发展，为了更快得到突变子，能够建立对这些催化剂进行快速有效表征的方法就显得尤为迫切。迄今为止，未见有立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选模型的报道。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

本发明采用的技术方案是：

立体选择α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取被测含有α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；所述待测样品为已知具有α-羟酸脱氢酶活性的样品，可以是酶液，也可以是菌体；

对于未知活性的酶活菌体样品，筛选其是否具有α-羟酸脱氢酶活性的方法如下：取待筛选的样品(酶液或菌体)均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品。

式(I)中，n为1或2，(R)m表示m个R取代基，R为H或卤素(优选为氯或氟)，m为1或2；

(2)取转化液添加2，4-二硝基苯肼的溶液进行显色反应20～90min，反应结束30～60min后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液10～40min后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品含有的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与底物的立体选择性相反。

对于转化液显红棕色的被测样品，可进一步进行步骤(3)和(4)的操作：

(3)另重新取转化液显红棕色的待测样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

(4)取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行显色反应20～90min，反应结束后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶。

本发明中所用的显色试剂2，4-二硝基苯肼为一种羰基试剂，可以与α-羟酸脱氢酶催化后获得的产物酮酸反应生成黄亮色的苯棕化合物沉淀，而苯棕化合物在碱性条件下会形成颜色均一的红棕色化合物，本方法即是通过酮酸类化合物和2，4-二硝基苯肼反应后在碱性条件下形成红棕色的化合物来完成鉴定筛选，可以快速鉴定显示待筛选的微生物或酶的选择性及活性。所涉及的反应原理如下：

本发明方法可用于未知样品中脱氢酶的筛选，待测样品为微生物或酶液，所述微生物来自各种可分离得到的微生物样品，如污水、化工厂、农田等的土样或水样以及现存或保藏的微生物菌种，也可将待筛选的微生物经培养得到菌体后，再进行筛选操作。

本发明方法也可用于已知酶样品的立体选择性的鉴定，待测样品可为已知产脱氢酶微生物经发酵分离获得的菌体。

所述α-羟酸优选为下列之一：(1)扁桃酸，(2)2-氟扁桃酸、(3)2-氯扁桃酸、(4)3-氯扁桃酸、(5)4-氟扁桃酸、(6)4-氯扁桃酸、(7)4-溴扁桃酸、(8)2，4-二氟扁桃酸、(9)3，5-二氟扁桃酸，(10)苯基乳酸。

所述pH为5～9的缓冲液优选为pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM。

所述NaOH溶液浓度为0.1～5M。

具体的，所述的方法如下：

(1)取待筛选的微生物菌体均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，制成OD₆₀₀值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；

(2)另取α-羟酸脱氢酶阳性样品两份，溶于pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体进行对照，所添加的R-或S-α-羟酸终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，分别取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，继续加入NaOH溶液进行显色，若仅有一份转化液显红棕色表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与添加的手性α-羟酸的立体构型一致，两份转化液均显红棕色表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；

上述步骤(1)和(2)中，所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM，所述NaOH溶液浓度为0.1～5M；

如果样品中的脱氢酶具有光学手性选择性，则在相同时间内生成的酮酸含量不同，可以通过比色法来简单测定。如以S-α-羟酸为底物时转化液显色后呈红棕色，以R-α-羟酸为底物时转化液显色后呈淡绿色，表明该微生物含有S型脱氢酶。具体结果可以参考表1。

表1：显色法鉴定微生物或微生物细胞提取物脱氢酶活性和手性选择性

上述步骤(2)对照组间底物浓度、催化剂用量及其它反应条件相同。对转化液进行定时取样，离心去除菌体或细胞提取物，测定生成的酮酸的含量，通常采用分光光度计或酶标仪测定。如果被测的微生物或酶没有选择性，则在相同时间内由于底物浓度、催化剂用量及其它反应条件相同，则生成的酮酸的量相同；如果具有光学选择性，则在相同时间内生成的酮酸含量相同。两组添加相反构型底物的反应同时进行，每隔一定时间取样，检测生成的酮酸的含量，可以分别计算反应的初始反应速率r₁、r₂，r₁/r₂值的大小相当于脱氢酶选择性的严格性。

本发明所述的方法能够较好的克服传统的基于手性GC或HPLC法带来的费时费力、设备要求高、通用性差的缺点，不需要对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所筛选的微生物的脱氢酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为以外消旋的扁桃酸及其相关衍生物为底物来进行生物酶法拆分获得光学纯的产品带来了极大的便利。

(四)附图说明

图1为样品全波长扫描图；

图2为苯乙酮酸的标准曲线；

图3为邻氯苯乙酮酸的标准曲线；

图4为间氯苯乙酮酸的标准曲线；

图5为对氯苯乙酮酸的标准曲线；

图6为显色法和液相法测得的反应过程中苯乙酮酸的生成量的比较；

图7为实施例4中两组样品转化液中酮酸的生成变化曲线图；

图8为实施例5中两组样品转化液中酮酸的生成变化曲线图；

图9为实施例6中两组样品转化液中酮酸的生成变化曲线图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：几种红棕色化合物的全波长扫描方法

为了准确的测量出几种酮酸和显色剂2，4-二硝基苯肼反应后在碱性条件下生成的红棕色化合物的含量，本发明测定了各种化合物的吸光度，具体的操作方法是将扁桃酸、邻氯扁桃酸、间氯扁桃酸、对氯扁桃酸、苯乙酮酸、邻氯苯乙酮酸、间氯苯乙酮酸、对氯苯乙酮酸配制成浓度为0.5～2.5mmol/L的溶液，吸取100-500μL的样品加入到25mL的容量瓶中，加入2.5mL2，4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol 2，4-二硝基苯肼溶于1L 1M盐酸溶液中)，室温反应30min后，加入15mL NaOH溶液(0.4M)，用蒸馏水定容至刻度线后。在分光光度计上进行全波长扫描，波长扫描范围为300～700nm，其中显色剂二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol2，4-二硝基苯肼溶于1L 1M盐酸溶液中)以纯净水做参比，其余各复合物溶液以显色剂二硝基苯肼溶液作为参比，扫描图见图1，2，4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol 2，4-二硝基苯肼溶于1L，1M盐酸溶液中)最大的光吸收值在350nm处(图1曲线a)，扁桃酸、邻氯扁桃酸、间氯扁桃酸、对氯扁桃酸由于和显色剂不反应，所以没有光吸收(图1曲线f，g，h，k)，苯乙酮酸、邻氯苯乙酮酸、间氯苯乙酮酸、对氯苯乙酮酸和显色剂反应后在碱性条件下生成的红棕色化合物在458nm处有最大的光吸收值(图1曲线b，c，d，e)，故可以选择458nm作为测量波长。

实施例2：显色法测几种酮酸化合物的标准曲线的方法

配制0.5～2.5mmol/L的苯乙酮酸、邻氯苯乙酮酸、间氯苯乙酮酸、对氯苯乙酮酸的母液，依次吸取100，200，300，400，500μL等体积的溶液加入到25mL的容量瓶中，加入2.5mL2，4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol 2，4-二硝基苯肼溶于1L1M盐酸溶液中)，室温反应30min后，加入15mL NaOH溶液(0.4M)，用蒸馏水定容至刻度线后，相应的酮酸浓度可以算出。测定它们在458nm处的吸光值，可以发现他们在一定的浓度下均符合比尔定律(参见图2～5)。

实施例3：显色法和液相法两种测定方法的比较

实验室保藏的菌种Sinorhizobium sp CCTCC NO：M 2011391(中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期2011年11月13日，保藏编号CCTCC No：M 2011391，已作为新菌株提交另案申请)是已证实的含S-α-羟酸脱氢酶菌株。以10mM扁桃酸作为底物，溶于pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(10ml，100mM)中，加入Sinorhizobium sp CCTCC NO：M2011391的湿菌体，反应在10mL的体系中进行，湿菌体量为0.2g/10mL，每隔0.5h取样800μL，离心去除菌体，吸取400μL的转化液加入至25mL的容量瓶中，加入2.5mL 2，4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol 2，4-二硝基苯肼溶于1L1M盐酸溶液中)，室温反应30min后，加入15mL NaOH溶液(0.4M)，用蒸馏水定容至刻度线后，在458nm波长出测吸光值，求算出生成的苯乙酮酸的含量。样品同时也通过液相法测定，色谱柱为反相手性柱(Chirobiotic^TM R 200×4.0mm，Sigma，USA)，流动相条件为0.5％AcOH-CH₃CN(20∶80，v/v)，流速为1mL/min，检测波长为228nm。两种方法测定的结果如图6所示，两者差别不大，结果吻合的较好。

实施例4：含R-扁桃酸脱氢酶的微生物的筛选

将待筛选的微生物库的各微生物培养后，离心，经生理盐水洗涤后，均匀分散于pH＝8.0的缓冲液中，制备成OD₆₀₀＝10.0的菌悬液，反应温度为30℃，在具塞三角瓶(50mL)中进行。

反应液的组成：①磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(10ml，100mM，pH7.5)；②分散于缓冲液中的菌体(10ml，OD₆₀₀＝10.0)；③R-扁桃酸溶液(10ml，10mM)或S-扁桃酸，反应在30℃、150r/min的水浴摇床中进行，每隔30min取样800μL，离心去除菌体，吸取400μL的转化液加入至25mL的容量瓶中，加入2.5mL 2，4-二硝基苯肼溶液(1mmol/L，1mmol2，4-二硝基苯肼溶于1L1M盐酸溶液中)，室温反应30min后，加入15mLNaOH溶液(0.4M)，用蒸馏水定容至刻度线后，在458nm波长出测吸光值。由于苯乙酮酸和2，4-二硝基苯肼溶液反应形成的苯棕化合物在碱性条件下能形成红棕色化合物，而空白呈淡绿色，所以初筛过程就能凭色差判断待筛微生物是否具有脱氢酶活性以及光学选择性，通过测定吸光值的大小变化趋势图(图7)可以发现以R-扁桃酸为底物时生成的苯乙酮酸量大于以S-扁桃酸为底物时的苯乙酮酸的量，初始反应速率r₁/r₂的值为14，表明该微生物含有R-扁桃酸脱氢酶，且选择性较为严格。经鉴定，该菌株为Serratia marcescens。

实施例5：含S-邻氯扁桃酸脱氢酶的微生物的筛选

反应液的组成及检测方法同实施例4，只是将其中的底物分别换成S-邻氯扁桃酸和R-邻氯扁桃酸，浓度为20mM，转化条件同实施例4，每隔40min取样，可以发现以S-邻氯扁桃酸做底物时吸光值的变化远大于以R-邻氯扁桃酸做底物时的吸光值，从图8中可以看出，初始反应速率r₁/r₂的值大于200，证明该菌株有S-脱氢酶活性，且选择性极为严格，经鉴定该菌株为Pseudomonas aerugmosa。

实施例6：

实验室保藏的菌种Sinorhizobium sp CCTCC NO：M 2011391是已证实的含S-α-羟酸脱氢酶菌株，该菌种培养后，制成菌悬液，反应液的组成及检测方法同实施例4，底物分别为S-扁桃酸和R-扁桃酸，浓度均为20mM，转化条件同实施例4，每隔15min取样，可以发现以S-扁桃酸做底物时吸光值的变化远大于以R-扁桃酸做底物时的吸光值，从图9中可以看出，初始反应速率r1/r2的值大于200，证明该菌株有S-脱氢酶活性，且选择性极为严格。

实施例7：

将实施例5筛选到的菌株Sinorhizobium sp CCTCC NO：M 2011391以外消旋2，4-二氟扁桃酸做底物，反应液的组成、转化条件及检测方法同实施例4，可以发现转化液显色处理后呈红棕色，证明该菌株对2，4-二氟扁桃酸具有脱氢酶活性，以R-2，4-二氟扁桃酸做底物时，发现转化液呈淡绿色，证明该菌株对2，4-二氟扁桃酸的选择性为S型。

Claims

1.一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取被测含有α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

式(I)中，n为1或2，(R)m表示m个R取代基，R为H或卤素，m为1或2；

(2)取转化液添加2，4-二硝基苯肼的溶液进行显色反应20～90min，反应结束后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品含有的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与底物的立体选择性相反。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中转化液呈现红棕色时，所述方法进一步包括步骤(3)和(4)：

(3)另取转化液显红棕色的待测样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述扁桃酸及其衍生物为下列之一：(1)扁桃酸，(2)2-氟扁桃酸、(3)2-氯扁桃酸、(4)3-氯扁桃酸、(5)4-氟扁桃酸、(6)4-氯扁桃酸、(7)4-溴扁桃酸、(8)2，4-二氟扁桃酸、(9)3，5-二氟扁桃酸，(10)苯基乳酸。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述pH为5～9的缓冲液为pH 7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液浓度为0.1～5M。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下：

(A)取待筛选的微生物菌体均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，制成OD600值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，反应结束后继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；

(B)另取α-羟酸脱氢酶阳性样品两份，溶于pH 7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体进行对照，所添加的R-或S-α-羟酸终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，分别取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min后，继续加入NaOH溶液进行显色，若仅有一份转化液显红棕色，表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈红棕色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，两份转化液均显红棕色表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；

上述步骤(A)和(B)中，所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM；所述NaOH溶液浓度为0.1～5M。