CN108486209B - 一种高通量快速筛选产(r)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸菌株的方法 - Google Patents

一种高通量快速筛选产(r)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量快速筛选高产R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸菌株的方法，所述方法按如下步骤进行：将待测菌株以R‑2‑苯氧基丙酸为底物经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液作为待测样品；将待测样品与显色剂混合，在25‑50℃、pH7.0‑10.0的条件下反应15‑45min，取反应液测550nm处吸光值，根据(R)‑HPOPA标准曲线获得待测样品中(R)‑HPOPA含量，筛选获得高产(R)‑HPOPA的菌株；本发明方法反应时间为35分钟，(R)‑HPOPA测定的范围为0.5‑4g/L，平均回收率为98.5％‑100.9％，具有高效性、灵敏性、可靠性，极大的提高了筛选的效率，节约了时间。

Description

一种高通量快速筛选产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸菌株的 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基于微孔板高通量快速筛选生物合成(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸((R)-HPOPA)高产菌的方法，属于高通量筛选野生菌和诱变菌种的技术领域。
(二)背景技术
2-(4-芳氧苯氧基)丙酸(APP)类除草剂是近40年来开发的一类选择性抑制植物乙酰辅酶A羧化酶的除草剂，其高效、低毒、高选择性、对作物安全及易于降解的特点极大的促进了选择性除草剂的发展。(R)-HPOPA是合成炔草酯、精吡氟氯禾灵及高效盖草能等芳氧丙酸类除草剂的重要中间体。其化合物不断推陈出新，工业化生产对其关键的手性中间体(R)-HPOPA的需求巨大。
目前工业化生产这种中间体的主要采用化学方法，其生产过程反应步骤多，周期长，反应条件苟刻，副产物多，环境污染大，收率低。生物催化法立体选择性专一、反应条件温和、环境友好、产物纯度高、产品容易分离提取等优点，因此实现生物法制备芳氧苯氧基丙酸类除草剂关键手性中间体具有巨大的经济和社会效益。
生物法制备(R)-HPOPA目前国外报道较少，其中主要由德国BASF公司研究报道。如德国BASF公司通过诱变选育白僵菌B.bassiana Lu 700制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸，(R)-HPOPA生产由0.3g/L/d提升到7g/L/d；Matthias Kinne和René Ullrich等人通过茶树菇产生的酶在添加H2O2条件下将2-苯氧基丙酸羟基化制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸，R异构体e.e.值为60％、特定选择性接近98％。
专利WO9011362A中报道了关于(R)-HPOPA的制备法，将R-2-苯氧基丙酸((R)-POPA)或其盐在有氧条件下通过微生物进行羟基化。筛选出多种能够羟基化R-2-苯氧基丙酸的微生物如：链霉菌、黑曲霉、黄曲霉、炭黑曲霉、臭曲霉、寄生曲霉、鬼伞菌、白僵菌、齐整小核菌、粉拟青霉菌。其中黑曲霉与白僵菌对培养基中(R)-POPA浓度为3g/L的转化率较高，部分菌株转化率能够达到100％。
过去的研究，常规的(R)-HPOPA的检测一般采用高效液相色谱方法。虽然这种方法具有准确，灵敏等优点，但是样品处理复杂，工作量大，不适用所有的生物实验室。常规的产(R)-HPOPA羟基化酶菌株的筛选涉及到反复的接种和摇瓶培养，整个筛选过程耗时，效率较低，成本高。因此，需要建立一种快速获得具有高酶活的(R)-POPA羟基化酶产生菌的高通量筛选方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种构建一种具有较高的应用价值、简单易行的高通量快速筛选生物合成(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸((R)-HPOPA)高产菌的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种高通量快速筛选产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸菌株的方法，所述方法按如下步骤进行：将待测菌株以(R)-2-苯氧基丙酸为底物经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液作为待测样品；将待测样品与显色剂混合(优选在微孔板中进行)，在25-50℃、pH7.0-10.0的条件下反应15-45min(优选45℃、pH10.0下反应35min)，取反应液测550nm处吸光值，根据R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量，筛选获得产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的菌株；所述显色剂是将铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])溶于4-氨基安替比林试剂配制成浓度为10-70g/L，所述4-氨基安替比林试剂终浓度组成：6-10g/L 4-氨基安替比林，15-20mM Na2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水；所述(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线是用(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液替代待测样品，在相同条件下测550nm处吸光值，以(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标，550nm处吸光值为纵坐标制成。
进一步，优选所述4-氨基安替比林试剂终浓度组成：6g/L 4-氨基安替比林，18.0mM Na2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水。
进一步，所述显色剂中铁氰化钾浓度为60g/L。
进一步，所述待测样品与显色剂体积比为1:1。
进一步，所述底物在发酵培养基中的浓度为10g/L。
进一步，所述待测菌株发酵方法条件为：28℃发酵培养7d，获得发酵液。
进一步，所述(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线如下方法制备：用去离子水分别配制0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.0g/L浓度梯度的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准溶液，分别取不同浓度的标准溶液(优选100μL)于96孔微孔板的微孔，每个微孔中加入显色剂(优选100μL)，在45℃、pH为10.0下反应35min，测定550nm处吸光值，以R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线；所述微孔中，显色剂与标准溶液体积比为1:1；所述显色剂是将铁氰化钾溶于4-氨基安替比林试剂配制成浓度10-70g/L，所述4-氨基安替比林试剂终浓度组成：6g/L 4-氨基安替比林，18.0mMNa2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水。
进一步，所述筛选方法按如下步骤进行：取采样点的泥土，用生理盐水制成悬浊液，然后静置使其沉降；用移液管取上清液涂布于PDA培养基平板中，用封口膜将平板封住，于28℃培养至长出菌落；用接种环挑平板中单菌落接种于盛有50mL第一富集培养基的250mL三角瓶中，28℃、150rpm下进行第一次富集培养2-3d；以体积浓度3％的接种量将第一次富集培养的菌液接种于第二富集培养基中，28℃、150rpm下进行第二次富集培养1d；将第二次富集培养的菌液稀释(分别取10-3和10-5两个梯度稀释液600μL)后涂布于含5g/L R-2-苯氧基丙酸的PDA平板上，并在28℃恒温静置培养3-4d；将平板上的单菌落作为待测菌株逐一接种至种子培养基，28℃培养72h；然后转接至含10g/L R-2-苯氧基丙酸的发酵培养基，28℃培养7d，获得发酵液；将发酵液离心(1000rpm，离心15min)，取上清液作为待测样品；将待测样品与显色剂以体积比1:1混合，在25-50℃、pH7.0-10.0的条件下反应15-45min，取反应液检测550nm处吸光值，根据(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量，筛选获得高产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的菌株。
进一步，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6g/L、硫酸亚铁七水合物2mg/L、硫酸锌(Ⅱ)四水合物100μg/L、硼酸300μg/L、氯化钴(Ⅱ)六水合物200μg/L、氯化铜(Ⅱ)二水合物10μg/L、氯化镍(Ⅱ)六水合物20μg/L、钼酸钠二水合物30μg/L，用2M的氢氧化钠调节pH为6.8，溶剂为蒸馏水；所述第一富集培养基、第二富集培养基和种子培养基组成均与发酵培养基组成相同。
本发明发现(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸苯环上的羟基在铁氰化钾的催化下与4-氨基安替比林(4-AAP)发生显色反应生成吲哚酚安替比林橙红色染料(图2)，设计了一种基于(R)-HPOPA苯环上的羟基在铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])的催化下与4-氨基安替比林(4-AAP)发生显色反应，生成吲哚酚安替比林橙红色染料的高通量筛选方法。反应时间为35分钟，(R)-HPOPA测定的范围为0.5-4g/L，平均回收率为98.5％-100.9％。
高通量筛选方法筛选(R)-HPOPA生产菌株，主要基于菌株对(R)-POPA的耐受性和(R)-HPOPA的产率两个因素。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)固体筛培养基用于获得单个菌落，能耐受(R)-POPA浓度>5g/L，具有高选择性且无副产品，不能降解(R)-POPA和(R)-HPOPA，适合于菌种改良和体系的放大。现有一般方法筛选(R)-HPOPA生产菌株，涉及到反复的接种和摇瓶培养，(R)-HPOPA的检测主要通过高效液相色谱。但是高通量筛选方法将平板上的单菌落逐一接种到不含(R)-POPA的96深孔板里，28℃培养72h。然后作为种子液转接到下一块含(R)-POPA(10g/L)发酵培养基的96深孔板里，28℃培养7d。将96孔深孔板于1000rpm，离心15min，每个孔取100μL上清样于96孔微孔板中，加入显色剂。通过酶标仪检测微孔板中样品的OD值。根据标准曲线计算出每个样品中(R)-HPOPA的含量，计算菌株转化(R)-POPA的转化率。
与现有技术相比，本发明方法有益效果主要体现在：
本发明涉及一种基于微孔板高通量快速筛选生物合成(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸高产菌的方法，本发明方法反应时间为35分钟，(R)-HPOPA测定的范围为0.5-4g/L，平均回收率为98.5％-100.9％，具有高效性、灵敏性、可靠性。本发明高通量筛选方法和传统的液相色谱测定的方法，(R)-HPOPA测定结果上没有显著的差异，但是本发明96孔板高通量筛选方法能够1h检测800个样品，而传统的高效液相色谱则需要1300h，极大的提高了筛选的效率，节约了时间。此外，本发明能够直观、准确的从野生菌和诱变菌株中筛选到高产(R)-HPOPA的菌株，具有简便、快速、准确等优点，具有大规模筛选高产(R)-HPOPA的菌株的能力，为筛选高产(R)-HPOPA的菌株提供了有效的策略。
(四)附图说明
图1为含有(R)-HPOPA结构的具有代表性的2-(4-芳氧苯氧基)丙酸类除草剂类除草剂。
图2为微生物羟基化(R)-POPA生成(R)-HPOPA示意图。(R)-HPOPA在K3[Fe(CN)6]的催化下与4-AAP反应，生成一种橙红色化合物，可以通过分光光度法快速测定。
图3为(R)-HPOPA和(R)-POPA的吸收光谱图。
图4为各种反应条件对(R)-HPOPA显色的影响，A为4-AAP浓度，B为铁氰化钾浓度，C为反应温度，D为pH值，E为反应时间。
图5为(R)-HPOPA浓度与OD值的相关性曲线(A)及不同浓度(R)-HPOPA的显色差异图(B)。
图6为高通量筛选方法b和常规传统筛选方法a筛选(R)-HPOPA生产菌株的比较流程图。
图7为微孔板的显色反应结果图，表明相应的96深孔板生长菌株的催化活性强弱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
一、实验材料
(1)试剂和仪器
(R)-HPOPA标准品购自阿拉丁公司，底物(R)-POPA由山东润丰提供，其余试剂均为国产分析纯。
标准溶液的配制：用去离子水准确配制5g/L的(R)-HPOPA标准溶液和5g/L的(R)-POPA标准溶液。
6g/L 4-AAP试剂的配制：6g/L 4-AAP，18.0mM Na2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水。储存于棕色瓶中，避光保存。
0.06g/mL显色剂的配制：将K3[Fe(CN)6]加入到6g/L 4-AAP试剂中配制成终浓度0.06g/mL。
仪器：SpectraMax M2多功能酶标仪(Molecular Device Company)，96微孔板，96深孔板。
二、(R)-HPOPA的酶标仪检测的分析程序
(1)吸收光谱和特征波长的选择
分别取2g/L、4g/L的(R)-HPOPA标准溶液和2g/L的(R)-POPA标准溶液各100μL加入96微孔板中，然后在每个微孔中加入100μL显色剂。设定反应的pH为10.0、温度为30℃、时间为20min。利用多功能酶标仪在400-800nm波长范围内进行连续波长扫描(见图3)，在520nm处时(R)-POPA与显色剂反应产物的OD值已经很低，且大于520nm后基本没有变化，对(R)-HPOPA与显色剂反应产物的OD值的测定影响很小。在550nm处时，4g/L的(R)-HPOPA与显色剂反应产物的OD值为0.98，当样品的OD值大于1.0时，酶标仪会出现测量误差。为了测量更大的范围，酶标仪可以测量0.5到4.0g/L的(R)-HPOPA。故选550nm为测定波长。
(2)4-AAP浓度对显色反应的影响
将6g/L 4-AAP试剂中4-AAP浓度分别改为7、8、9、10g/l，其它组成同6g/L 4-AAP试剂。每个浓度(6、7、8、9、10g/l)的4-AAP试剂加入K3[Fe(CN)6]配制成0.06g/mL显色剂。取5g/L的(R)-HPOPA标准溶液4mL加入10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，作为待测样品。取100μL待测样品于96孔微孔板中，每个微孔中加入100μL不同4-AAP浓度的显色剂。设定反应的pH为10.0，反应温度和时间分别为30℃和20min，用酶标仪检测样品在550nm处的吸光值。如图4中A所示，6-10g/l的4-AAP试剂对显色反应产物的吸光值没有显著影响，为了节约试剂的用量，优选6g/l 4-AAP试剂。
(3)铁氰化钾对显色反应的影响
取7个EP管，分别加入1mL 6g/L 4-AAP试剂，每个EP管依次加入0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g的K3[Fe(CN)6]，配制成不同浓度的显色剂。取5g/L的(R)-HPOPA标准溶液4mL加入10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，作为待测样品。取100μL待测样品于96孔微孔板中，每个微孔中加入100μL不同浓度的显色剂。设定反应的pH为10.0，反应温度和时间分别为30℃和20min，用酶标仪检测样品在550nm处的吸光值。如图4中B所示，K3[Fe(CN)6]的浓度从0.01g/mL上升到0.06g/mL，OD值也随之升高。当K3[Fe(CN)6]的浓度从0.06g/mL到0.07g/mL，OD值的变化很小。因此，取铁氰化钾的添加量为0.06g/mL。
(4)温度和pH对显色反应的影响
取2.0g/L的(R)-HPOPA标准溶液100μL于96孔微孔板中，加入0.06g/mL显色剂100μL。设定反应的pH为10.0，反应时间20min，反应的温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，酶标仪在波长550nm处测定样品的OD值。如图4中C所示，反应温度从25℃上升到45℃，OD值也随之升高。当反应温度从45℃到50℃，OD值的变化很小，比较稳定。因此，选择45℃作为最适的反应温度。
取2.0g/L的(R)-HPOPA标准溶液100μL于96孔微孔板中，加入0.06g/mL显色剂100μL，设定反应的pH分别为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，反应时间20min，反应温度为45℃，酶标仪在波长550nm处测定样品的OD值。如图4中D所示，当反应的pH从7.0增加到10.0时，对应的OD值增加。当pH值为10.0时，显色反应的OD值最大。当pH从10.0到11.0时，OD值降低.因此，选择10.0作为反应的pH。
(5)反应时间对显色反应的影响
取2.0g/L的(R)-HPOPA标准溶液100μL于96孔微孔板中，加入0.06g/mL显色剂100μL，设定反应的pH分别为10.0，反应温度为45℃，反应时间分别设定为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min。在550nm处测定吸光值，结果见图4中E所示，随着反应时间的增加，从15min到35min，OD值增加，反应时间为35min时检测到最大OD值，之后OD值保持稳定。因此，选择35min为显色反应时间。
(6)标准曲线与检测范围
分别配制0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.0g/L浓度梯度的(R)-HPOPA标准溶液，做三组平行，将标准溶液浓度从低到高分别加样100μL于96孔微孔板的微孔，每个微孔中加入0.06g/mL显色剂100μL，反应温度和时间分别为45℃和35min，pH为10.0，测定OD550nm值并绘制(R)-HPOPA标准曲线。如图5所示，标准曲线方程为y＝0.2874x+0.029(R2＝0.9955)。x为(R)-HPOPA浓度，y为OD值，线性范围0.5g/L到4g/L。(R)-HPOPA浓度检测极限为0.5g/L。
三、回收率和精确度的测定
为了验证此方法能够用来计算样品中(R)-HPOPA的含量，向测定的样品加入已知浓度的标品(R)-HPOPA，测定该方法的回收率，具体方法为：将摇瓶筛选方法得到的具有转化能力的菌株分别接种到含有(R)-POPA(5g/L)50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，并于28℃恒温摇床间150rpm培养7d。离心取上清液，取100μL用去离子水适当稀释的上清样于96孔微孔板中，每个微孔中加入0.06g/mL显色剂100μL，45℃反应35min，用酶标仪检测样品在550nm处的吸光值。计算出样品中(R)-HPOPA浓度W2。取上清液加入W3浓度(R)-HPOPA的固体标品，取100μL用去离子水适当稀释的上清样于96孔微孔板中，每个微孔中加入0.06g/mL显色剂100μL，45℃反应35min，用酶标仪检测样品在550nm处的吸光值，计算出加入标品后样品中(R)-HPOPA浓度W1。回收率计算方程：(R)-HPOPA回收率(％)＝(W1—W2)/W3×100％。W1为测定的(R)-HPOPA浓度，W2为样品中(R)-HPOPA浓度，W3为加入的标品(R)-HPOPA浓度。回收率的研究用来验证方法的准确度，进行了三次平行实验，如表1所示，计算的平均回收率都大于98％。因此，此方法具有良好的重复性和准确性。
表1(R)-HPOPA平均百分比回收率(n＝8)。
Figure GDA0003455369580000071
8次实验的平均值±SD。
实施例2：
(1)培养基
发酵培养基配方：葡萄糖5g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6g/L、硫酸亚铁七水合物2mg/L、硫酸锌(Ⅱ)四水合物100μg/L、硼酸300μg/L、氯化钴(Ⅱ)六水合物200μg/L、氯化铜(Ⅱ)二水合物10μg/L、氯化镍(Ⅱ)六水合物20μg/L、钼酸钠二水合物30μg/L，用2M的氢氧化钠调节pH为6.8，溶剂为蒸馏水。
土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：去皮土豆200g切块加入1L去离子水煮沸20min双层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g、琼脂15-20g，加入去离子水补足1L，用2M的氢氧化钠调节pH为6.8。
(2)参照图6所示流程筛选
1)初筛：取各采样点的泥土10g，用生理盐水制成悬浊液，然后静置使其沉降。用移液管取1mL上清液于PDA培养基平板中，用涂布棒涂均匀，用封口膜将平板封住，防止其在培养过程中染杂菌，将接种后的平板于28℃培养至长出菌落。
2)复筛：用接种环挑平板中单菌落于盛有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，于28℃，150rpm培养2-3d。以体积浓度3％的接种量将第一次富集培养的菌液接种于富集培养基中进行第二次富集培养，28℃，150rpm培养1d，将第二次富集培养的菌液稀释，分别取10-3和10-5两个梯度稀释液600μL涂布于含5g/L底物((R)-POPA)的PDA平板上，并在28℃恒温培养箱中静置培养3-4d。在超净工作台中将平板上的单菌落逐一接种到加有发酵培养基不含(R)-POPA的96深孔板里(每个孔含有1mL无菌发酵培养基)，28℃培养72h。然后作为种子液转接到下一块每孔加有1mL含10g/L(R)-POPA发酵培养基的96深孔板里，28℃培养7d。将96孔深孔板于1000rpm，离心15min。
3)检测：每孔取100μL用去离子水适当稀释(稀释到检测范围)的上清样于96孔微孔板中，每个微孔中加入0.06g/mL显色剂100μL，45℃反应35min，pH为10.0，反应后微孔板如图7所示(字母代表行，数字代表列)，微孔板的A5、A7微孔的颜色分别为黄色和橙色，且微孔A9的颜色比A7的更深，说明微孔A9所对应的菌株比前两个微孔对应的菌株具有更好的合成产物(R)-HPOPA的能力。用酶标仪检测样品在550nm处的吸光值，根据实施例1制备的(R)-HPOPA标准曲线计算出每个样品中(R)-HPOPA的含量，计算菌株转化(R)-POPA的转化率，同时以HPLC方法检测样品中(R)-HPOPA的含量作为对照，结果如表2所示。通过此高通量筛选方法已经获得了四十多株具有催化活力的菌株，其中包括七株具有高转化率的菌株。96孔板高通量筛选方法能够1h检测800个样品，而传统的高效液相色谱则需要1300h，极大的提高了筛选的效率。
HPLC检测条件：伊利特C18色谱柱：250mm×4.6mm；流动相：V(磷酸水溶液pH＝2)：V(乙腈)＝6:4；流速：1mL/min；检测器DAD；检测波长：220nm；进样量：5μL；柱温：30℃。
表2.样品中(R)-HPOPA的检测结果(n＝8)。
Figure GDA0003455369580000091
实施例3：用三氯化铁定量测定(R)-HPOPA
用去离子水分别配制0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.0g/L浓度梯度的(R)-HPOPA标准溶液和32.4g/L三氯化铁溶液。做三组平行，将(R)-HPOPA标准溶液浓度从低到高分别加样100μL于96孔微孔板的微孔，每个微孔中加入100μL三氯化铁溶液。(R)-HPOPA和三氯化铁反应生成绿色溶液，经过全波长扫描，测定波长选为580nm。反应温度和时间分别为30℃和20min，pH为7.0。测定OD580nm值并绘制(R)-HPOPA标准曲线。标准曲线的线性不够，其原因是(R)-HPOPA和三氯化铁反应随着浓度的增加会产生沉淀且随时间变化OD值差异较大，缺乏稳定性。因此三氯化铁不能用于定量测定(R)-HPOPA。
实施例4：亚硝酸钠定量测定(R)-HPOPA
用去离子水分别配制0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L浓度梯度的(R)-HPOPA标准溶液和5g/L亚硝酸钠溶液。做三组平行，将(R)-HPOPA标准溶液浓度从低到高分别加样100μL于96孔微孔板的微孔，每个微孔中加入100μL亚硝酸钠溶液。(R)-HPOPA和亚硝酸钠在酸性条件下反应生成黄色溶液，经过全波长扫描，测定波长选为480nm。反应温度和时间分别为25℃和30min。测定OD480nm值并绘制(R)-HPOPA标准曲线。标准曲线的线性不够，其原因是(R)-HPOPA和亚硝酸钠反应随时间变化OD值差异较大，缺乏稳定性。因此亚硝酸钠不能用于定量测定(R)-HPOPA。
实施例3与实施例4说明，本发明所涉及的(R)-HPOPA的显色剂选择具有独特性。

Claims (8)

1.一种高通量快速筛选产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸菌株的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：将待测菌株以R-2-苯氧基丙酸为底物经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液作为待测样品；将待测样品与显色剂混合，在25-50℃、pH7.0-10.0的条件下反应15-45min，取反应液测550nm处吸光值，根据R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量，筛选获得产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的菌株；所述显色剂是将铁氰化钾溶于4-氨基安替比林试剂配制成浓度10-70g/L，所述4-氨基安替比林试剂终浓度组成：6-10g/L 4-氨基安替比林，15-20mM Na2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水；所述(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线是用(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液替代待测样品，在相同条件下测550nm处吸光值，以(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标，550nm处吸光值为纵坐标制成；所述(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸是指(R)-HPOPA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述显色剂中铁氰化钾浓度为60g/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品与显色剂体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述底物在发酵培养基中的浓度为10g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测菌株发酵方法条件为：28℃发酵培养7d，获得发酵液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线如下方法制备：用去离子水分别配制0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.0g/L浓度梯度的(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准溶液，分别取不同浓度的标准溶液于96孔微孔板的微孔，每个微孔中加入显色剂，在45℃、pH为10.0条件下反应35min，测定550nm处吸光值，以(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸水溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线；所述微孔中，显色剂与标准溶液体积比为1:1，所述显色剂是将铁氰化钾溶于4-氨基安替比林试剂配制成浓度60g/L，所述4-氨基安替比林试剂终浓度组成：6g/L 4-氨基安替比林，18.0mM Na2CO3，2.0M NaOH调节pH到10.0，溶剂为去离子水。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述筛选方法按如下步骤进行：取采样点的泥土，用生理盐水制成悬浊液，静置沉降；用移液管取上清液涂布于PDA培养基平板中，用封口膜将平板封住，于28℃培养至长出菌落；用接种环挑平板中单菌落接种于第一富集培养基中，28℃、150rpm下进行第一次富集培养2-3d；以体积浓度3％的接种量将第一次富集培养的菌液接种于第二富集培养基中，28℃，150rpm下进行第二次富集培养1d；将第二次富集培养的菌液稀释后涂布于含5g/L(R)-2-苯氧基丙酸的PDA平板上，并在28℃恒温静置培养3-4d；将平板上的单菌落作为待测菌株逐一接种至种子培养基，28℃培养72h；然后转接至含10g/L R-2-苯氧基丙酸的发酵培养基，28℃培养7d，获得发酵液；将发酵液离心，取上清液作为待测样品；将待测样品与显色剂以体积比1:1混合，在25-50℃、pH7.0-10.0的条件下反应15-45min，取反应液检测550nm处吸光值，根据(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸标准曲线获得待测样品中(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸含量，筛选获得产(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的菌株。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6g/L、硫酸亚铁七水合物2mg/L、硫酸锌四水合物100μg/L、硼酸300μg/L、氯化钴六水合物200μg/L、氯化铜二水合物10μg/L、氯化镍六水合物20μg/L、钼酸钠二水合物30μg/L，用2M的氢氧化钠调节pH为6.8，溶剂为去离子水；所述种子培养基、第一富集培养基和第二富集培养基组成均同发酵培养基组成。
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