CN102659982A - 一种黄酮磁性分子印迹聚合物、制备及其在竹叶黄酮分离中的应用 - Google Patents

Abstract

一种黄酮磁性分子印迹聚合物、制备及其在竹叶黄酮分离中的应用，属于药物分离技术领域。将经过油酸表面改性的纳米Fe₃O₄，模板分子木犀草素、功能单体4-乙基吡啶和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，按模板分子∶功能单体∶交联剂摩尔比为1∶5～8∶80，通过悬浮聚合制备出一种黄酮磁性分子印迹聚合物微球。本发明制得的黄酮磁性分子印迹聚合物微球应用于竹叶提取液中竹叶黄酮的选择性富集和纯化，具有简单、快速、回收率高等特点，在天然黄酮类化合物分离领域应用前景广阔。

Description

一种黄酮磁性分子印迹聚合物、制备及其在竹叶黄酮分离中的应用

技术领域

本发明属于药物分离技术领域，具体地说，是涉及竹叶提取物中黄酮类化合物的高选择性分离、纯化和富集的黄酮磁性分子印迹聚合物微球、制备方法及应用。

背景技术

经典的生物活性成分制备方法主要是采用有机溶剂萃取，再通过柱层析、重结晶等分离技术进一步纯化，存在提取步骤多而复杂、生产成本高、有机溶剂消耗量大、容易造成溶剂残留和污染环境等问题。对于复杂基质如发酵液和植物浸提液等，采用硅胶和吸附树脂柱层析法分离会造成层析柱污染，离心和过滤也无法实现吸附的目标成分与基质中悬浮成分的分离。

磁性分子印迹技术是通过聚合反应，在磁性纳米颗粒表面，进行分子印迹聚合，达到分子印迹与磁性颗粒的有机结合，制备的磁性分子印迹聚合物兼具良好的超顺磁性和高度的识别选择性。从而利用分子印迹聚合物对模板分子快速的选择性吸附，达到从复杂样品溶液中分离目标化合物的目的；同时克服了离心、过滤等技术无法实现直接从悬浮液中分离目标成分的制约，借助外加磁场力的作用，可方便地对不同磁性的物质进行分离。

竹叶黄酮是从竹叶中提取出的一类天然产物，具有抗氧化、抗衰老等作用，是新兴的功能性食品添加剂和天然药物。竹叶黄酮以炭苷黄酮为主，其中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异特荆苷是竹叶黄酮的主要成分。目前市场上的竹叶黄酮产品主要为粗制品，上述4种黄酮的总含量一般在10%以内，难以满足市场对高含量竹叶黄酮产品的需求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有竹叶黄酮分离、富集方法的缺点和不足，提供一种竹叶黄酮磁性分子印迹聚合物微球的制备方法，使其能够直接快速简单的分离纯化竹叶提取液中的黄酮类化合物，可直接应用于竹叶提取液中竹叶黄酮中炭苷黄酮的选择分离、高效富集。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种黄酮磁性分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备浓度为3%-3.5%的分散剂水溶液，加入经过油酸改性后的纳米Fe₃O₄粒子，然后加入功能单体4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解；将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈分别溶解在有机溶剂中，将上述三种溶液混合，并进行超声脱气；在70-75℃下搅拌，在通氮气保护下进行聚合反应10-24h，生成聚合物微球；

所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为1∶5-8∶80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有机溶剂、分散剂溶液的体积比为1∶2-3∶20－30，油酸改性后的纳米Fe₃O₄只是作为磁性体，其用量可根据实际需要添加。

溶解交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈的有机溶剂优选二甲苯。

（2）反应结束后，采用磁分离得到含有模板分子的磁性分子印迹聚合物微球；将含有模板分子的磁性分子印迹聚合物微球用水反复洗涤，再用甲醇、乙酸洗涤多次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后真空干燥，即得到黄酮磁性分子印迹聚合物微球。

上述磁流体采用化学共沉淀法制备，具体包括以下步骤：将1mol·L^-1FeCl₃溶液、1mol·L^-1HCl的混合溶液加入反应器中，用真空泵抽气，然后通氮气以除去空气，再快速加入FeSO₄·7H₂O，摩尔比Fe³⁺:Fe²⁺=1.8:1，待FeSO₄·7H₂O完全溶解后，加入10%PEG4000溶液，滴加1.5mol·L^-1的NaOH溶液，调节pH至10，通氮气置换除氧，于70°C、800r·min^-1快速搅拌反应10min，降低搅拌速度至500r·min^-1，再升温至80°C恒温反应1h，反应结束后在外加磁场的作用下固液分离，弃去上层清液，将得到的黑色磁流体用去离子水及无水乙醇洗至中性，干燥即得纳米磁流体。

将Fe₃O₄磁流体，加入质量浓度1%-3%油酸溶液中，在通氮气、85℃条件下，搅拌1h后，在外加磁场作用下固液分离，用蒸馏水洗涤干净，60℃烘箱中干燥，得到表面改性处理的Fe₃O₄粒子。

所述的分散剂为羧乙基纤维素或聚乙二醇。

所述的超声脱气时间为10-20min；所述的搅拌转速为280-360rpm。

本发明缩制备的聚合物微球平均粒径可达100-800μm，聚合物微球的饱和磁化强度达10.473-10.992emu/g，比表面积可达416.7m²/g。

上述黄酮磁性分子印迹聚合物微球在竹叶黄酮分离制备中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

⑴活化：在制备的黄酮磁性分子印迹聚合物微球中加入乙腈，搅拌，然后于外加磁场作用下固液分离；加入蒸馏水洗涤，洗去表面的甲醇后再磁分离，弃去废液，得到活化好的磁性分子印迹聚合物；其中磁性分子印迹聚合物的质量与乙腈的体积比优选=1g∶（10-20）ml，聚合物的质量与蒸馏水的体积比为1g∶（30-50）ml；

⑵萃取：将竹叶黄酮提取液或样品溶液与磁性分子印迹聚合物混合搅拌充分萃取，（时间可为150min-300min，优选210min），磁性分子印迹聚合物的质量与竹叶黄酮提取液或样品溶液的体积比优选为1g∶（150-200）ml；

⑶分离：萃取结束后，于外加磁场中进行磁分离，将吸附了竹叶黄酮的磁性分子印迹聚合物从样品萃取液中分离出来；

⑷漂洗：在分离出的磁性分子印迹聚合物中加入漂洗剂，搅拌1-5min，再次磁分离，弃去漂洗液；磁性分子印迹聚合物质量与漂洗剂的体积比优选=1g∶（30-50）ml；漂洗剂为质量浓度为5-15%的乙醇水溶液，优选浓度10%；

⑸洗脱：加入甲醇∶乙酸或甲酸体积比为（8-9）∶（1-2）的洗脱液，搅拌洗涤磁性分子印迹聚合物，磁性分子印迹聚合物的质量∶洗脱液的体积比=1∶30-50，洗脱1-5次，磁分离后，收集洗脱液，将收集的洗脱液于45℃下减压浓缩，得到分离的竹叶黄酮样品。

上述步骤（2）中竹叶黄酮提取液或样品溶液的溶剂为水和乙醇。

本发明制备的竹叶黄酮磁性分子印迹聚合物微球是一种具有固定空穴大小、形状和确定排列功能基团的高分子交联聚合物，对竹叶黄酮的立体结构具有动态记忆功能。本发明可应用于竹叶提取液中的竹叶黄酮的分离、富集和纯化，较普通的液-液萃取法、C₁₈固相萃取法更为简单、快速、更为高效。

附图说明

图1为本发明制备的磁性印迹聚合物微球的场发射电镜扫描照片；

图2为本发明制备的磁性分子印迹聚合物的磁滞回线；

图3为本发明制备的磁性分子印迹；

图4为本发明制备的磁性分子印迹聚合物微球的XRD图谱。

具体实施方式

以下结合实施例进一步阐明本发明内容，但本发明并不限制于如下实施例的范围。

实施例1.黄酮磁性分子印迹聚合物微球的制备(模板分子与功能单体摩尔比为1∶5)

⑴准确移取36mlL(1molL^-1)FeCl₃和40mlL(1molL^-1)的HCl的混合溶液，加入到500mL三口烧瓶中，用真空泵抽气，然后通氮气30min以除去三口烧瓶中的空气，再称取0.02mol即5.5604g FeSO₄·7H₂O快速加入到三口烧瓶中(摩尔比Fe³⁺∶Fe²⁺=1.8∶1)，待FeSO₄·7H₂O完全溶解后，再加入25mL(10%)的PEG4000溶液，滴加1.5molL^-1的NaOH溶液，调节pH至10。通氮气置换除氧，升温至70°C，于转速800r·min^-1，快速搅拌反应10min后，降低搅拌速度至500r·min^-1，同时升温至80°C恒温反应1h，反应结束后在外加磁场作用下固液分离，弃去上层清液，收集得到的黑色磁流体，用去离子水及无水乙醇洗涤至中性，磁分离后在60°C烘箱中干燥6h，得到纳米磁流体。

⑵称取3.5g制得的Fe₃O₄磁流体，加入到装有100mL 1%油酸溶液三口烧瓶中，在通氮气、85℃条件下，剧烈搅拌1h后，在外加磁场作用下固液分离，用蒸馏水洗涤干净，60℃烘箱中干燥，得到表面改性处理的Fe₃O₄粒子。

⑶配制浓度为3%~3.5%的羧乙基纤维素水溶液120mL；加入3g经过油酸改性后的纳米Fe₃O₄粒子；将5mmol功能单体4-乙烯基吡啶(4-vp)和1mmol模板分子木犀草素溶解在羧乙基纤维素溶液中；将7.5mL交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0.3g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)分别溶解在7.5mL二甲苯中；将上述混合溶液转移到500mL三口烧瓶中，并进行超声脱气10min；在通氮气、70℃、290rpm条件下恒温搅拌15h。

⑷反应结束后，在外加磁场作用下，分离出聚合物微球；再将分离出的聚合用水洗涤5次，再用甲醇、乙酸洗涤5次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后于烘箱中真空干燥，得到印迹聚合物微球(100~800μm)。

实施例2.黄酮磁性分子印迹聚合物微球的制备(模板分子与功能单体摩尔比为1∶8)

⑴按实施例1方法制备表面改性的Fe₃O₄粒子。

⑵配制浓度为3%~3.5%的聚乙二醇水溶液120mL；加入3.5g经过油酸改性后的纳米Fe₃O₄粒子；将8mmol功能单体4-乙烯基吡啶(4-vp)和0.1431g(1mmol)的模板分子木犀草素溶解在聚乙二醇溶液中；将7.5mL交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、0.25g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶解在7.5mL二甲苯中；将上述混合溶液转移到500mL三口烧瓶中，并进行超声脱气10min；在通氮气、70℃、300rpm条件下恒温搅拌15h。

⑶反应结束后，在外加磁场作用下，分离出聚合物微球；再将分离出的聚合用水洗涤5次，再用甲醇、乙酸洗涤5次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后于烘箱中真空干燥，得到印迹聚合物微球(100~800μm)。

实施例3.黄酮磁性分子印迹聚合物在竹叶黄酮分离中的应用

⑴称取100g干燥的毛竹叶样品，按料液比1∶10加入95%乙醇，制备竹叶黄酮提取液。在提取液中添加木犀草素、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷和槲皮素6种标准品；

⑵称取250mg制备的磁性分子印迹聚合物(MMIPs)，置于100mL锥形瓶中。

⑶移取50mL步骤中⑴制备的竹叶提取液，加入装有MMIPs的锥形瓶中，于室温条件下150rpm振荡提取210min。

⑷在外加磁场作用下固液分离，加入10%乙醇溶液10mL漂洗3次，磁性分离后，再加入10mL甲醇∶乙酸(甲酸)=9∶1(8∶2)溶液，于180rpm振荡洗脱1h，收集洗脱液，用0.45μm滤膜过滤后，HPLC分析。

⑸该MMIPs吸附模板分子木犀草素效果较好，在添加浓度为10mg/L时，对6种竹叶黄酮的回收率为：荭草苷60.5%~63.5%、异荭草苷51.7%~58.9%、牡荆苷68.6%~71.6%、异牡荆苷74.7%~80.4%、槲皮素37.8%~43.1%、木犀草素97.4%~100.1%；相对标准偏差为1.12%~5.96%。

实施例4.黄酮磁性分子印迹聚合物在竹叶黄酮分离中的应用

⑴称取10g市售竹叶黄酮粉样品，用10%乙醇溶解并稀释100倍，过滤或离心，得到竹叶黄酮样品溶液。

⑵称取250mg制备的磁性分子印迹聚合物(MMIPs)，置于100mL锥形瓶中。

⑶移取50mL步骤中⑴制备的竹叶黄酮样品溶液，加入装有MMIPs的锥形瓶中，于室温条件下150rpm振荡提取210min。

⑷在外加磁场作用下固液分离，加入10%乙醇溶液10mL漂洗3次，磁性分离后，再加入10mL甲醇∶乙酸(甲酸)=9∶1(8∶2)溶液，于180rpm振荡洗脱1h，磁分离后收集洗脱液，重复洗脱3次，合并洗脱液。

⑸将收集的洗脱液于45℃下减压浓缩，得到分离的竹叶黄酮样品，经HPLC检测，所得竹叶黄酮样品中总黄酮含量为92.15%。

上述实施例1制备的磁性印迹聚合物微球的场发射电镜扫描照片见图1，可以看出，制备的木犀草素模板分子制备的磁性印迹聚合物微球呈现规则的球形，粒径均匀，表面具有微孔，利用目标化合物的吸附、分离。实施例1制备的磁性分子印迹聚合物的磁滞回线见图2，可以看出制备的磁性分子印迹聚合物的饱和磁化强度为10.473emu/g，能够在外加磁场作用很好的运动和聚集；矫顽磁力和剩磁较小，当磁场撤去之后粒子能够很快的分散开。实施例1制备的磁性分子印迹聚合物微球的红外光谱图见图3，图中3631.9cm^-1、3558.3cm^-1、3443.1cm^-1为OH的伸缩振动峰，2988.0cm^-1、2955.4cm^-1为不饱和碳氢伸缩振动峰，2359.3cm^-1、2337.0cm^-1为作图时未能全扣除空气中二氧化碳的伸缩振动峰，1732.2cm^-1为C=O伸缩振动峰，1637.0cm^-1为4-乙烯基吡啶上的C=N吸收峰，1600.7cm^-1为杂芳环(4-乙烯基吡啶)的吸收峰，1390.9cm^-1、1456.4cm^-1、1319.5cm^-1为C-H弯曲振动峰，1161.9cm^-1、1259.5cm^-1、1295cm^-1为EGDMA上羧酸酯中间的C-O吸收峰，817.4cm^-1、880.7cm^-1、959.7cm^-1为烯烃的弯曲振动吸收峰。在590.9cm^-1处有一明显的吸收峰，这与Fe₃O⁴的特征吸收峰一致，说明Fe₃O₄被包裹在聚合物中；1732.2cm^-1(C=O)和3443.1cm^-1(OH)处伸缩振动表明了羧基的存在，且吡啶吸收峰的存在表明4-乙烯基吡啶通过聚合反应与EGDMA成功包裹了磁核，且在表面含有羧基。实施例1制备的磁性分子印迹聚合物微球的XRD图谱见图4，从图中得知以木犀草素为模板分子制备的磁性分子印迹聚合物微球的X射线衍射峰与Fe₃O₄标准品和合成Nano-Fe₃O₄出峰2θ几乎完全一致，说明制备的MMIPs中确实含有Fe₃O₄。

本发明的实施例2同样具有同上述实施例1聚合物微球的表征数据。

Claims (10)

1.一种黄酮磁性分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备浓度为3%-3.5%的分散剂水溶液，加入经过油酸改性后的纳米Fe₃O₄粒子，然后加入功能单体4-乙烯基吡啶和模板分子木犀草素溶解；将交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈分别溶解在有机溶剂中，将上述三种溶液混合，并进行超声脱气；在70-75℃下搅拌，在通氮气保护下进行聚合反应10-24h，生成聚合物微球；

所述的模板分子木犀草素、4-乙烯基吡啶、二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩尔比为1∶（5-8）∶80，二甲基丙烯酸乙二醇酯、有机溶剂、分散剂溶液的体积比为1∶（2-3）∶（20－30）；

（2）反应结束后，采用磁分离得到含有模板分子的磁性分子印迹聚合物微球；将含有模板分子的磁性分子印迹聚合物微球用水反复洗涤，再用甲醇、乙酸洗涤多次；最后通过索氏提取进一步除去聚合物颗粒中的模板分子木犀草素，直至检测不出模板分子，然后真空干燥，即得到黄酮磁性分子印迹聚合物微球。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于，磁流体采用化学共沉淀法制备，具体包括以下步骤：将1mol·L^-1FeCl₃溶液、1mol·L^-1HCl的混合溶液加入反应器中，用真空泵抽气，然后通氮气以除去空气，再快速加入FeSO₄·7H₂O，摩尔比Fe³⁺:Fe²⁺=1.8:1，待FeSO₄·7H₂O完全溶解后，加入质量浓度10%的PEG4000溶液，滴加1.5mol·L^-1的NaOH溶液，调节pH至10，通氮气置换除氧，于70°C、800r·min^-1快速搅拌反应10min，降低搅拌速度至500r·min^-1，再升温至80°C恒温反应1h，反应结束后在外加磁场的作用下固液分离，弃去上层清液，将得到的黑色磁流体用去离子水及无水乙醇洗至中性，干燥即得纳米磁流体。

3.按照权利要求1的方法，其特征在于，油酸改性的Fe₃O₄磁流体的制备方法：将Fe₃O₄磁流体加入质量浓度1%-3%油酸溶液中，在通氮气、85℃条件下，搅拌1h后，在外加磁场作用下固液分离，用蒸馏水洗涤干净，60℃烘箱中干燥，得到表面改性处理的Fe₃O₄粒子。

4.按照权利要求1的方法，其特征在于，所述的分散剂为羧乙基纤维素或聚乙二醇。

5.按照权利要求1的方法，其特征在于，所述的超声脱气时间为10-20min；所述的搅拌转速为280-360rpm。

6.按照权利要求1的方法，其特征在于，溶解交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁腈的有机溶剂为二甲苯。

7.按照权利要求1-6任一方法所制备的黄酮磁性分子印迹聚合物微球。

8.权利要求7中的黄酮磁性分子印迹聚合物微球在竹叶黄酮分离制备中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

⑴活化：在制备的黄酮磁性分子印迹聚合物微球中加入乙腈，搅拌，然后于外加磁场作用下固液分离；加入蒸馏水洗涤，洗去表面的甲醇后再磁分离，弃去废液，得到活化好的磁性分子印迹聚合物；

⑵萃取：将竹叶黄酮提取液或样品溶液与磁性分子印迹聚合物混合搅拌充分萃取，磁性分子印迹聚合物的质量与竹叶黄酮提取液或样品溶液的体积比为1g∶（150-200）ml；

⑶分离：萃取结束后，于外加磁场中进行磁分离，将吸附了竹叶黄酮的磁性分子印迹聚合物从样品萃取液中分离出来；

⑷漂洗：在分离出的磁性分子印迹聚合物中加入漂洗剂，搅拌1-5min，再次磁分离，弃去漂洗液；漂洗剂为质量浓度为5-15%的乙醇水溶液；

⑸洗脱：在步骤⑷漂洗后的磁性分子印迹聚合物中加入甲醇∶乙酸或甲酸体积比为（8-9）∶（1-2）的洗脱液，搅拌洗涤磁性分子印迹聚合物，磁性分子印迹聚合物的质量∶洗脱液的体积比=1g∶（30-50）ml，洗脱1-5次，磁分离后，收集洗脱液，将收集的洗脱液于45℃下减压浓缩，得到分离的竹叶黄酮样品。

9.按照权利要求8的方法，其特征在于，上述步骤（2）中竹叶黄酮提取液或样品溶液的溶剂为水和乙醇。

10.按照权利要求8的方法，其特征在于，漂洗剂的质量浓度为10%。

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