CN102657875B - 基于ant1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用，该免疫脂质体是在内部包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体表面结合有抗SM22α单克隆抗体，ANT1重组真核表达载体中含有核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的ANT1基因；本发明将ANT1重组真核表达载体有效地包封在脂质体中形成纳米级颗粒，再与抗SM22α单克隆抗体连接，借助抗SM22α单克隆抗体与VSMC表面的SM22α抗原的特异性结合，使脂质体主动靶向VSMC，进而在VSMC中释放ANT1重组真核表达载体并表达ANT1，诱导VSMC凋亡并抑制其增殖，来发挥抗血管狭窄的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗血管狭窄的药物，在冠状动脉粥样性硬化等疾病的防治方面具有良好的应用前景。

Description

基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，涉及一种靶向型免疫脂质体，还涉及该免疫脂质体的制备方法和在制药领域中的应用。

背景技术

冠状动脉内支架植入术（PCI）及经皮腔内冠状动脉形成术（PTCA）后，最主要的并发症是术后6 个月内30%-50%发生再狭窄，表现为血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）密度增加和新生内膜增厚，VSMC凋亡不足是再狭窄发生的机制之一。研究表明，增加VSMC的凋亡可以防治再狭窄。因此，针对VSMC凋亡方面的研究成为治疗再狭窄的热点领域。

腺嘌呤核苷酸转位酶（adenine nucleotide translocase，ANT）是位于线粒体内膜上的转运蛋白，参与由线粒体经内膜到胞质转运氧化磷酸化过程中的ATP 和ADP，与细胞内的能量代谢密切相关。此外，ANT还参与线粒体膜渗透性转换（mitochondrial permeability transition，MPT），从而与细胞凋亡关系紧密，但其作用与能量转运无关。ANT有4 种异构体，其中ANT1诱导细胞凋亡的作用最强，但其是否能诱导VSMC凋亡国内外尚未见报道。

细胞骨架是VSMC保持特定细胞形态和行使收缩功能的重要结构基础。平滑肌SM22α（smooth muscle 22 alpha）蛋白又称转凝蛋白（transgelin），是一种重要的细胞骨架相关蛋白，在分化型VSMC中大量表达，可通过与肌动蛋白（actin）相互作用参与细胞骨架重构和表型调节。此外，SM22α 还可作为信号分子参与VSMC的生长和细胞外基质的降解。因此，SM22α在VSMC表型转化和血管重塑性疾病发生发展中的作用日益成为人们关注的焦点。

脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体，可以包裹多种物质（如药物、核酸等）并将其转入多种类型的细胞中，具有延长包裹物的作用时间、增加细胞对包裹物的摄取量、提高疗效、减少毒副作用等特点，但其缺乏主动靶向性。免疫脂质体是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体，其借助抗体或抗体片段与靶细胞表面抗原的特异性结合，可以特异性识别并结合靶细胞，使脂质体在靶区释放包裹物，从而实现主动靶向功能。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，可以主动靶向VSMC，在细胞中表达ANT1，诱导VSMC凋亡并抑制其增殖，从而发挥抗血管狭窄的作用；目的之二在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，操作简便易行；目的之三在于提供所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体在制药领域中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，在脂质体的内部包封有ANT1重组真核表达载体，脂质体表面结合有抗SM22α单克隆抗体，所述ANT1重组真核表达载体中含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因。

进一步，所述ANT1重组真核表达载体是将ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG- CMV-14的多克隆位点中而得到。

进一步，所述脂质体是以质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇为原料制得。

2、所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，包括以下步骤：

a、ANT1重组真核表达载体的制备：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的NotI和XbaI位点之间，制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1；

b、ANT1重组真核表达载体的脂质体包封：将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器，用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，再用琼脂糖凝胶柱分离除去被核酸酶降解的p3xFLAG- CMV-14/ANT1，即制得包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体；

c、包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体与抗SM22α单克隆抗体的连接：将抗SM22α单克隆抗体经巯基化修饰后，与包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去未连接的抗SM22α单克隆抗体，即得基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体。

进一步，所述步骤a是将大鼠VSMC总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的上、下游引物进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化后，用NotI和XbaI双酶切，再与同样经NotI和XbaI双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA连接酶的作用下连接，即制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1。

进一步，所述步骤a中PCR扩增的条件为：95℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

进一步，所述步骤b是将质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声5分钟，再加入浓度为0.5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，p3xFLAG-CMV-14/ANT1与胆固醇的质量比为1:40，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器。

3、所述基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体在制备抗血管狭窄药物中的应用。

进一步，所述抗血管狭窄药物为能够诱导VSMC凋亡并抑制其增殖的药物。

本发明的有益效果在于：本发明将ANT1重组真核表达载体有效地包封在脂质体中形成纳米级颗粒，再与抗SM22α单克隆抗体连接，借助抗SM22α单克隆抗体与VSMC表面的SM22α抗原的特异性结合，使脂质体主动靶向VSMC，进而在VSMC中释放ANT1重组真核表达载体并表达ANT1，诱导VSMC凋亡并抑制其增殖，来发挥抗血管狭窄的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗血管狭窄的药物，在冠状动脉粥样性硬化等疾病的防治方面具有良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为琼脂糖凝胶电泳检测ANT1基因的PCR产物，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物。

图2为Western blot检测ANT1重组真核表达载体，其中1泳道为从p3xFLAG-CMV- 14/ANT1转染的COS-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液，2泳道为从p3xFLAG-CMV-14转染的COS-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液。

图3为透射电子显微镜观察包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体。

图4为脂质体核酸酶降解电泳图，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为未包封质粒，2泳道为脂质体包封质粒。

图5为Anti-SM22α-Lip-ANT1的电泳检测图，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为Anti-SM22α-Lip-ANT1溶液，2泳道为抗SM22α单克隆抗体。

图6为Anti-SM22α-Lip-ANT1的ELISA检测图。

图7为各组细胞的凋亡率。

图8为各组细胞的增殖抑制率。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体（Anti-SM22α-Lip-ANT1）的制备

1、ANT1重组真核表达载体的制备与检测

（1）ANT1重组真核表达载体的制备

取SD大鼠VSMC，加入液氮充分研磨后，称取100mg置无RNA酶的离心管中，用RNA提取试剂盒（TaKaRa公司）提取VSMC总RNA，按照试剂盒说明书操作。

根据GenBank登录号为NM_007450.4的ANT1基因序列设计1对特异性引物，在每条引物的5’端加上保护碱基并在其后引入限制性内切酶识别序列。引物序列如下：上游引物：5’-gcggccgcaaaatatgtgtaa-3’（SEQ ID No.2，下划线部分为NotI酶切位点）；下游引物：5’-tctagagtaccccctagtccg-3’（SEQ ID No.3，下划线部分为XbaI酶切位点）；设计的引物委托上海生工公司进行合成。

采用RT-PCR逆转录扩增试剂盒（TaKaRa公司）将上述VSMC总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR扩增，按照试剂盒说明书操作；PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物用浓度为10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，可见PCR产物在约950bp处有一特异性条带，与目的片段的分子量大小相符；用胶回收试剂盒（TIANGEN公司）切胶回收纯化目的片段，按照试剂盒说明书操作，获得两端带有NotI和XbaI酶切位点的ANT1基因。

将两端带有NotI和XbaI酶切位点的ANT1基因用NotI和XbaI（TaKaRa公司）双酶切，酶切产物经纯化后，与同样经NotI和XbaI双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14（Sigma-Aldrich公司）在T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α（TIANGEN公司）感受态细胞，用含有氨苄青霉素（AMP）的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基中，温度37℃振摇培养12小时，用质粒小量提取试剂盒（TIANGEN公司）提取质粒，按照试剂盒说明书操作，所得质粒采用双酶切法和PCR法鉴定并委托上海生工公司进行测序验证，在p3xFLAG-CMV-14的NotI和XbaI位点之间插入有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列完全一致的DNA片段的阳性克隆质粒即为ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1。

取含有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的大肠杆菌DH5α（阳性克隆），接种于含有AMP的LB液体培养基中，温度37℃振摇培养过夜，待培养液的光吸收值OD_490nm达到1~1.5时，采用超纯质粒抽提试剂盒（TIANGEN公司）大量抽提质粒，按照试剂盒说明书操作，所得质粒用超纯水溶解，即得p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，用紫外分光光度计测定其A260值和A280值，根据A260/A280值估算其纯度为1.90，根据A260值计算其质量浓度为1.0mg/mL。

（2）Western blot检测ANT1重组真核表达载体

将COS-7细胞接种于6孔板中，用PRIM 1640培养基在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养24小时，待细胞融合率达到约80%时，采用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将p3xFLAG-CMV-14/ANT1转染入COS-7细胞，按照试剂说明书操作，同时设空载体对照，转染4小时后，将培养液更换为PRIM 1640培养基，继续培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，超声裂解细胞，离心收集上清液，采用His Bind融合蛋白纯化试剂盒纯化带有His标签的ANT1，按照试剂盒说明书操作。取纯化的蛋白溶液，采用质量百分浓度为5%的浓缩胶、质量百分浓度为12.5%的分离胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，用脱脂奶封闭1小时后，加入兔抗大鼠ANT1多克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗膜，再加入羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，PBST洗膜，再加入发光底物，37℃孵育1分钟，暗室中用X光片曝光，显影，定影，观察p3xFLAG-CMV-14/ANT1在真核细胞中的表达，以β-actin为内参照。结果如图2所示，从p3xFLAG-CMV-14/ANT1转染的COS-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液有一特异的蛋白质条带，与ANT1的预期分子量大小一致，而从p3xFLAG-CMV-14转染的COS-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液无相应条带，表明p3xFLAG-CMV-14/ANT1可以在真核细胞中正确表达ANT1。

2、包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体（Lip-ANT1）的制备与检测

（1）逆向蒸发法制备Lip-ANT1

将卵磷脂2g和胆固醇0.4g溶解于乙醚60mL中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声5分钟，再加入浓度为0.5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液20mL，在干冰和42℃水浴中反复冻融，并连续数次通过孔径为100nm的薄膜挤出器（上海光健公司），然后加入核酸酶Dnase I和exonuclease III（上海亚培公司），37℃作用1小时降解未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，用乙二胺四乙酸终止反应，再用琼脂糖凝胶CL-4B柱（北方伟业公司）分离Lip-ANT1和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，由于脂质体的体积比质粒DNA大，通过凝胶过滤色谱可以将二者很好的分离。

（2）Lip-ANT1的检测

透射电镜观察：将制得的Lip-ANT1溶液用浓度为3g/L的磷钨酸溶液负染后，滴至专用铜网上，自然风干，置透射电子显微镜下观察脂质体的形态结构和粒径分布。结果如图3所示，可见所得Lip-ANT1为球形或近球形小囊泡，粒径分布范围为50~120nm，平均粒径低于100nm。

琼脂糖凝胶电泳检测：取与制备方法中等量的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液、通过100nm薄膜挤出器的脂质体溶液、用琼脂糖凝胶柱CL-4B分离所得的Lip-ANT1溶液和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液进行琼脂糖凝胶电泳，再置紫外灯下观察。结果如图4所示，经核酸酶Dnase I和exonuclease III处理后，未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1已经被降解，而脂质体能够抵抗核酸酶的降解。同时通过Gel pro analyzer 4.0软件比较凝胶图中DNA的条带亮度，计算总DNA量和未包封入脂质体的DNA量，再根据以下公式：包封率(%)=[(总DNA量－未包封入脂质体的DNA量)/总DNA量]×100%，计算得到p3xFLAG- CMV-14/ANT1的包封率为82.3%。

3、Anti-SM22α-Lip-ANT1的制备与检测

（1）Anti-SM22α-Lip-ANT1的制备

将羊抗大鼠SM22α单克隆抗体（SantaCruz公司）经巯基化修饰后，与Lip-ANT1在室温下轻摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱CL-4B分离连接成功的Anti-SM22α-Lip-ANT1和未连接的抗SM22α单克隆抗体，由于免疫脂质体的体积比抗体大，通过凝胶过滤色谱可以将二者很好的分离。

（2）Anti-SM22α-Lip-ANT1的检测

琼脂糖凝胶电泳检测：向琼脂糖凝胶柱CL-4B分离所得的Anti-SM22α-Lip-ANT1溶液和未连接的抗SM22α单克隆抗体溶液中，分别加入浓度为5g/L的SDS溶液（SDS能破坏脂质体的膜表面结构，从而使脂质体释放内部的包裹物），同时设置不加入SDS的空白对照，混匀静置，取上清液进行浓度为5g/L的琼脂糖凝胶电泳，置紫外灯下观察，结果如图5所示，加入SDS的Anti-SM22α-Lip-ANT1溶液有一明亮的DNA条带，而加入SDS的抗SM22α单克隆抗体无相应条带出现。说明所得Anti-SM22α-Lip-ANT1中包封有ANT1重组真核表达载体。

ELISA检测：用琼脂糖凝胶柱CL-4B分离所得的Anti-SM22α-Lip-ANT1溶液和未连接的抗SM22α单克隆抗体溶液分别包被96孔板，以HRP标记的羊抗大鼠IgG为一抗，进行直接ELISA实验。结果如图6所示，所得Anti-SM22α-Lip-ANT1和未连接的抗SM22α单克隆抗体都呈阳性反应，说明Anti-SM22α-Lip-ANT1中含有抗SM22α单克隆抗体，即脂质体的表面已成功连接上抗SM22α单克隆抗体。

二、基于ANT1基因的免疫脂质体对VSMC的作用检测

1、流式细胞仪检测Anti-SM22α-Lip-ANT1诱导VSMC凋亡

将处于指数生长期的COS-7细胞和VSMC分别用含有浓度为100g/L的新生牛血清的完全培养基制成细胞密度为1×10⁶/mL的悬液，接种至96孔板，每孔100μL，分成两组：对照组和实验组，每组设3个复孔，对照组每孔加入完全培养液100μL，实验组每孔加入终浓度为1μg/mL的Anti-SM22α-Lip-ANT1 100μL，然后在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养72小时，用PBS洗涤细胞2次，收集细胞，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL Annexin V-FITC混匀，再加入5μL Propidium Iodide混匀，室温下避光反应5~15分钟，流式细胞仪检测。结果如图7所示，经Anti-SM22α-Lip-ANT1处理的COS-7细胞的凋亡率为3.7±0.5%，而经Anti-SM22α-Lip-ANT1处理的VSMC的凋亡率为24.3±4.1%，说明本发明的免疫脂质体能够特异性诱导VSMC的凋亡。

2、MTT比色法检测Anti-SM22α-Lip-ANT1抗VSMC增殖作用

将处于指数生长期的COS-7细胞和VSMC分别用含有浓度为100g/L的新生牛血清的完全培养基制成细胞密度为1×10⁶/mL的悬液，接种至96孔板，每孔100μL，分成两组：对照组和实验组，每组设3个复孔，对照组每孔加入完全培养液100μL，实验组每孔加入终浓度为1μg/mL的Anti-SM22α-Lip-ANT1 100μL，然后在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养72小时，每孔再加入浓度为5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，吸弃上清，每孔再加入二甲基亚砜150μL，轻摇10分钟，用酶标仪在波长490nm处测定各孔OD值，计算细胞增殖抑制率。结果如图8所示，经Anti-SM22α-Lip-ANT1处理的COS-7细胞的增殖抑制率为2.5±0.8%，而经Anti-SM22α-Lip-ANT1处理的VSMC的增殖抑制率为27.3±4.2%，说明本发明的免疫脂质体能够特异性抑制VSMC的增殖。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  中国人民解放军第三军医大学第二附属医院

<120>  基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用

 

<160>  3

 

<210>  1

<211>  897

<212>  DNA

<213>  大鼠（Rattus norregicus）

<220> 

<221>  CDS

<222>  (1)…(897)

<223>  ANT1基因

<400>  1

atgggggatc aggctttgag ctttcttaag gacttcctgg caggtggcat cgccgccgcc      60

gtctccaaga cggcggtcgc cccgatcgag agggtcaaac tgctgctgca ggtccagcat     120

gccagcaaac agatcagtgc agagaagcag tacaaaggca tcattgattg tgtcgtgaga     180

atccccaagg agcagggctt tctctctttc tggaggggta acctggccaa cgtgatccgg     240

tacttcccca ctcaagccct gaacttcgcc ttcaaagaca agtacaagca gatcttcctg     300

ggaggcgtgg atcgccataa gcagttctgg cgctactttg ctggtaacct ggcctctggt     360

ggggcagctg gggccacctc cctctgcttc gtctacccgc tggaccttgc taggaccagg     420

ctggctgccg acgtgggcaa gggatcttcc cagcgagaat tcaatgggct gggcgactgt     480

ctcaccaaga tcttcaagtc ggacggcctg aagggtctct accagggttt cagtgtctct     540

gtccagggca tcatcatcta cagagctgcc tacttcggag tctatgacac tgccaagggg     600

atgctgccag accccaagaa tgtgcacatt atcgtgagct ggatgattgc gcagagtgtg     660

acagcggtgg cggggctggt gtcctatccg tttgacactg ttcgtcgtag gatgatgatg     720

cagtctggcc ggaaaggggc tgatattatg tacacgggga cacttgactg ctggaggaag     780

attgcaaaag atgaaggagc caacgctttc ttcaaaggtg cttggtccaa tgtactgaga     840

ggcatgggtg gtgcttttgt attggtattg tatgatgaga tcaaaaaata tgtgtaa        897

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  上游引物

<400>  2

gcggccgcaa aatatgtgta a  21

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  下游引物

<400>  3

tctagagtac cccctagtcc g  21

 

Claims (9)

1.基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，在脂质体的内部包封有ANT1重组真核表达载体，脂质体表面结合有抗SM22α单克隆抗体，所述ANT1重组真核表达载体中含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因。

2.根据权利要求1所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，所述ANT1重组真核表达载体是将ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中而得到。

3.根据权利要求1或2所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，所述脂质体是以质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇为原料制得。

4.权利要求1所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．ANT1重组真核表达载体的制备：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的NotI和XbaI位点之间，制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1；

b．ANT1重组真核表达载体的脂质体包封：将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器，用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，再用琼脂糖凝胶柱分离除去被核酸酶降解的p3xFLAG- CMV-14/ANT1，即制得包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体；

c．包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体与抗SM22α单克隆抗体的连接：将抗SM22α单克隆抗体经巯基化修饰后，与包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去未连接的抗SM22α单克隆抗体，即得基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体。

5.根据权利要求4所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a是将大鼠VSMC总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的上、下游引物进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化后，用NotI和XbaI双酶切，再与同样经NotI和XbaI双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA连接酶的作用下连接，即制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1。

6.根据权利要求5所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a中PCR扩增的条件为：95℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

7.根据权利要求4所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤b是将质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声5分钟，再加入浓度为0.5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，p3xFLAG-CMV-14/ANT1与胆固醇的质量比为1:40，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器。

8.权利要求1至3任一项所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体在制备抗血管狭窄药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗血管狭窄药物为能够诱导血管平滑肌细胞凋亡并抑制其增殖的药物。

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