CN102656281B - 用于测定非小细胞肺癌预后的诊断方法 - Google Patents

用于测定非小细胞肺癌预后的诊断方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于鉴定早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的方法，所述患者在手术切除后将具有肺癌复发的不利预后。该方法部分基于Chr19,34.7Mb-35.6Mb处的染色体拷贝数增益可以用于预后分类的发现。该方法优选使用具有荧光标记的核酸探针的荧光原位杂交，以与患者样品杂交，以定量该遗传基因座的染色体拷贝数，所述基因座包含细胞周期蛋白E1基因。

Description

用于测定非小细胞肺癌预后的诊断方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2009年10月26日提交的美国临时专利申请号61/254,955的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容整体引入本文作为参考。
发明领域
本公开内容涉及用于测定患者预后的来自肺癌患者的组织样品的体外诊断测定，且特别涉及用于测定早期患者例如诊断有I期或II期非小细胞肺癌的患者的预后的体外测定。
发明背景
肺癌是2005年美国几乎三分之一的癌症死亡的原因，并且广义地分成2个类型：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌(NSCLC)占美国80-85％的肺癌病例。NSCLC的类型针对癌症中所见的细胞类型以及细胞在显微镜下所见如何而命名。NSCLC包含3个主要类型：(i)鳞状细胞癌，其在鳞状细胞中开始，所述鳞状细胞是看起来象鱼鳞的薄的、扁平细胞。鳞状细胞癌也称为表皮样癌；(ii)大细胞癌，其在几个类型的大肺细胞中开始；(iii)腺癌，其在内衬肺的肺泡并且制备物质例如粘液的细胞中开始。其他较不常见类型的NSCLC包括多形性癌、类癌瘤和未分类癌。
NSCLC的诊断通过病理学家对可疑组织例如活组织检查样品的检查来完成。在NSCLC诊断后，使用患者的总体健康和年龄、症状例如咳嗽和呼吸困难的严重性、NSCLC的具体类型和癌症的分期，对患者的疾病指定预后(恢复机率)。分期考虑肿瘤的大小以及肿瘤是仅存在于肺中还是已扩展至机体中的其他地方。用于NSCLC患者的具体治疗选项随后基于这些考虑加以选择，并且癌症分期是用于治疗选择的重要组分。具有早期NSCLC的患者可以潜在地通过手术切除摘除肿瘤得到治愈，但目前诊断模式无法预测哪些患者将在手术后复发。癌症是具有低治愈率的通常致命的疾病，对于其大多数治疗旨在改善生活质量和寿命。因为癌细胞是人细胞，通常仅通过相对小数目的遗传异常或蛋白质突变的累积辨别，所以在杀死癌细胞中有用的药物疗法通常对于许多正常人细胞也是有害的，并且在被治疗患者中一般引起显著毒性。此外，因为癌症通常局部复发或转移至远离其起源组织的组织和器官，所以关键的是了解具有早期癌症的哪些患者在其原发性肿瘤的手术摘除后需要药物治疗。这在具有早期NSCLC的患者中是尤其关键的问题，其肿瘤早期检测且手术摘除，特别是具有I和IIA期疾病的患者。在用抗癌药治疗这些患者下导致无法接受高比率的患者发展复发性或转移性疾病，最终导致增加的死亡率和死亡。过度治疗这个群体导致无法接受高比率的患者，其不需要药物疗法，经历来自给予其的药物的毒性副作用。
美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network)因特网网站如下描述了NSCLC分期。“在美国临床实践中最常用于描述非小细胞肺癌(NSCLC)生长和扩展的系统是TNM分期系统，也称为美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)(AJCC)系统。在TNM分期中，合并关于肿瘤(T)、进入附近淋巴结内的任何扩展(N)、和任何远侧器官转移(M)的信息，并且将分期指定至特定TNM分组。分组的分期使用数目0和从I到IV的罗马数字进行描述。
“T分类基于肺癌的大小、其在肺内的扩展和定位、及其扩展至附近组织。在Tis分类中，癌症仅在内衬气道的细胞层中发现。它不扩展到其他肺组织内。这个分类也称为原位癌。
“在T1分类中，癌症不大于3厘米(略微小于1 - 1 ¼英寸)，未扩展至脏胸膜(围绕肺的膜)，并且不影响支气管的主要分支。
“在T2分类中，癌症具有下述特征中的一个或多个：(i)它大于3 cm；(ii)它涉及肺的主支气管，但与其中气管(气管)分支进入左和右主支气管内的点不近于2 cm(约3 ¼ - 4英寸)；或(iii)已扩展至脏胸膜。癌症可以部分阻断气道，但这未引起整个肺萎陷或发展肺炎。
“在T3分类中，癌症具有下述特征中的一个或多个：(i)它已扩展至胸壁、横膈膜(将胸与腹分开的呼吸肌)、纵隔胸膜(围绕2个肺之间的间隔的膜)、或心包壁层(围绕心脏的囊的膜)；(ii)它涉及肺的主支气管，并且它与其中气管(气管)分支进入左和右主支气管内的点近于2 cm(约3¼4英寸)，但不涉及这个区域；或(iii)它已生长到气道内，足以引起一个肺完全萎陷或引起整个肺的肺炎。
“在T4分类中，癌症具有下述特征中的一个或多个：(i)它已扩展至纵隔(在胸骨后和在心脏前的间隔)、心脏、气管(气管)、食道(连接咽喉与胃的管)、脊柱或其中气管分支进入左和右主支气管内的点；(ii)2个或更多个分开的肿瘤结节存在于相同叶中；或(iii)存在恶性胸腔积液，这是在围绕肺的间隔中含有癌细胞的液体的出现。
“N分类取决于肺附近的哪个淋巴结受癌症影响，如果存在的话。在N0分类中，癌症未扩展至任何淋巴结。在N1分类中，癌症已扩展至在肺内的淋巴结或进入肺门淋巴结(位于其中支气管进入肺的区域周围的那些)内。在N1分类中，受累淋巴结仅在与癌性肺相同的侧上。在N2分类中，癌症已扩展至隆突下淋巴结(在其中气管分支进入左和右支气管内的点周围的那些)或纵隔(在胸骨后和在心脏前的间隔)中的淋巴结。在N2分类中，受累淋巴结在癌性肺的相同侧上。在N3分类中，癌症已扩展至在任一侧上的锁骨附近的淋巴结、和/或在与癌性肺相对侧上的肺门或纵隔淋巴结。
“M分类取决于癌症是否已转移且扩展至任何远侧组织和器官。在M0分类中，不存在远侧癌症扩展。在M1分类中，癌症已扩展至1个或更多个远侧部位。视为远侧的部位包括肺的其他叶、远于用于测定癌症的N分类的那些的淋巴结、和其他器官或组织例如肝、骨或脑。
一旦对于特定NSCLC已指定T、N和M分类，就合并这个信息(分期分组)，以指定0、I、II、III或IV的总体分期(参见表1)。T和N分类的多个组合合并成分期。分期鉴定具有类似预后且以相似方式治疗的肿瘤类型。如表1中所示，具有远侧扩展的肿瘤(即M1分类癌症)视为IV期，与淋巴结牵涉的肿瘤大小无关。”来自NCCN因特网网站的下表显示用于NSCLC的合并分类和分期分类法。
表1
具有较低分期编号的NSCLC患者一般具有对于存活更有利的预后和前景，并且这些患者一般通过肿瘤的手术切除加以治疗。然而，即使对于早期患者，例如具有1B期、IIA或IIB期NSCLC的那些，显著百分比的这些患者也将在手术切除后复发，具有更侵略性的疾病且死亡。目前临床诊断方法无法以足够的精确度鉴定早期NSCLC预后，以指导针对更可能复发的这些患者的更攻击性治疗。因此需要更好的体外诊断方法以鉴定更高危险的早期NSCLC患者，其应接受新辅助或辅助化学疗法或甚至完全放弃手术切除。
使用荧光标记的DNA杂交探针以鉴定染色体异常的基于荧光原位杂交(FISH)的分子体外诊断测定已得到公开，用于在用于NSCLC患者的化学疗法的选择中使用(PCT/US2005/018879，“Methods for prediction of clinical outcome to epidermal growth factor inhibitors by cancer patients”，M. Garcia等人)。FISH测定已在2006年3月23日公开的美国专利申请20060063194，“Methods and probes for the detection of cancer”，L. Morrison等人(下文称为“Morrison ‘194”)中描述为用于NSCLC的起始诊断测定，所述美国专利申请的公开内容整体引入本文作为参考。Morrison ‘194申请描述了对于NSCLC筛选和诊断有用的多个FISH探针组，并且Morrison ‘194中所述的一个探针组作为在ASR(分析物特异性试剂)标记下的LAVysion™探针组从Abbott Molecular，Inc.(Des Plaines，Illinois，U.S.A.)商购可得，用于通过临床实验室使用以产生临床诊断测定。在美国食品与药物管理局ASR标记要求下，ASR标记必须不包括关于ASR的医学效用的任何要求。LAVysion ASR探针组包含4个FISH探针：用SpectrumGreen绿色荧光团标记的染色体5p15基因座特异性探针，用SpectrumGold黄色荧光团标记的染色体8q24基因座特异性探针，用SpectrumAqua蓝色荧光团标记的染色体6计数探针，和用SpectrumRed红色荧光团标记的染色体7p12基因座特异性探针。使用LAVysion探针组执行的研究已得到描述且例如在K. Halling等人，“Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology”，Hum. Path.(2007)38：1137-1144中综述。
细胞周期蛋白E的超表达先前已与肺癌中的不良后果相关(在Singhal等人，Clin. Cancer Res.，2005，11，第3974-3986页中综述)。细胞周期蛋白E的扩增也已与卵巢癌相关(M. Marone等人，Internat’l J. Cancer, 1998, 75, pp. 34-39)。然而，在细胞周期蛋白E基因座上无拷贝数改变已确立为预测标记。此外，没有关于用于NSCLC的FISH测定的先前报道已公开使用FISH探针，以更精确地鉴定关于早期NSCLC特别是分类为I期或II期的那些的预后。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了预测就肺癌治疗的患者中的疾病后果的方法，该方法包括步骤：a)提供来自患者的测试样品；b)测定测试样品中细胞周期蛋白E1基因的拷贝数；c)针对基线拷贝数2比较测试样品中细胞周期蛋白E1基因的拷贝数，从而测定测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益(gain)的存在或不存在；和d)基于测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在，当与在细胞周期蛋白E1基因中不具有拷贝数增益的患者中疾病后果的基线测量比较时，将患者鉴定为具有不良疾病后果的增加危险，其中细胞周期蛋白E1基因中的拷贝数增益的存在预测不良疾病后果。不良疾病后果是当与不具有关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的患者的总体存活时间比较时减少的总体存活时间、和当与不具有关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的患者的总体存活时间比较时更短的复发时间中的至少一个。
在另一个方面，本公开内容提供了预测就肺癌治疗的患者中的疾病后果的方法，该方法包括步骤：a)提供来自患者的测试样品；b)测定关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在；和c)基于关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在，当与不具有关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的患者的总体存活时间比较时，测定患者是具有减少的总体存活时间还是更短的复发时间的更高危险。
在任何方法中，细胞周期蛋白E1基因位于染色体19，34.7 Mb-35.6 Mb区域内。在任何方法中，测试样品可以是可能含有肿瘤细胞的组织样品，例如血液样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、肺洗涤样品、胸腔积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品或由先前任何一种产生的提取物或加工的样品。在一个示例性实施方案中，组织样品是肺组织样品或包含循环肿瘤细胞的外周血样品。测定步骤(b)可以例如通过原位杂交执行，如用荧光标记的核酸探针、应用至少2种核酸探针或用肽核酸探针执行。测定步骤(b)可以通过聚合酶链反应、核酸测序测定或核酸微阵列测定执行。在一个示例性实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌，例如鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌中的任一种。患者可以用化学疗法、放射、手术或其任何组合治疗。
在另一个方面，本公开内容提供了选择用于患有肺癌的患者的治疗的方法，该方法包括步骤：a)提供来自患者的测试样品，其中用化学治疗剂的治疗是用于患者的至少一个治疗选项；b)测定测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数；c)针对基线拷贝数2比较测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数，从而测定测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数变化的存在或不存在；和d)基于步骤c)中的比较，确定化学疗法治疗方案。基于步骤c)中的比较确定治疗方案的步骤包括例如当对于癌症后果标记存在拷贝数变化时，选择化学治疗剂且测定化学疗法治疗的频率。测试样品是例如可能含有肿瘤细胞的组织样品，例如血液样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、肺洗涤样品、胸腔积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品或由外周血样品的任何一种产生的提取物或加工的样品，并且在示例性实施方案中是肺组织样品或包含循环肿瘤细胞的外周血样品。测定步骤(b)可以例如通过原位杂交执行，例如用荧光标记的核酸探针、应用至少2种核酸探针或用肽核酸探针执行。测定步骤(b)可以通过聚合酶链反应、核酸测序测定或核酸微阵列测定执行。在一个示例性实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌，例如鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌中的任一种。患者也可以用放射或手术或其组合治疗。
在另一个方面，本公开内容提供了将患者分类为具有对于治疗是抗性的肺癌的方法，其包括步骤：a)提供来自患者的测试样品；b)测定关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数；c)针对关于细胞周期蛋白E1基因的基线拷贝数2比较测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数，以测定患者中的细胞周期蛋白E1基因中拷贝数增益的存在或不存在；和d)基于细胞周期蛋白E1基因中拷贝数增益的存在，将患者分类为具有对于治疗是抗性的肺癌。测试样品是例如组织样品，例如血液样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、肺洗涤样品、胸腔积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品或由外周血样品的任何一种产生的提取物或加工的样品，并且在示例性实施方案中是肺组织样品或包含循环肿瘤细胞的外周血样品。测定步骤(b)可以例如通过原位杂交执行，例如用荧光标记的核酸探针、应用至少2种核酸探针或用肽核酸探针执行。测定步骤(b)可以通过聚合酶链反应、核酸测序测定或核酸微阵列测定执行。在一个示例性实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌，例如鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌中的任一种。患者可以用化学疗法、放射、手术或其任何组合治疗。
在另一个方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含：a)用于测定关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂；和b)用于执行测试的说明书。在试剂盒的一个示例性实施方案中，测定拷贝数增益的存在或不存在的试剂包括与至少部分细胞周期蛋白E1基因杂交的可检测标记的多核苷酸。
附图简述
图1是显示对于通过Chr19，34.7 Mb-35.6 Mb中拷贝数增益的存在或不存在分类的、具有早期NSCLC的78患者群组(cohort)，以天表示的总体存活(OS)的Kaplan-Meier曲线图。
发明详述
先前描述的基于表达的癌症中不良后果的标记不能用充分确立的临床诊断工具FISH进行测量。迄今为止，未鉴定可以预测疾病后果的基因扩增/缺失。本发明人已发现在染色体19约35Mb处染色体序列的拷贝数增益，其含有编码细胞周期的关键调节子细胞周期蛋白E的基因。此外，本发明人已测定拷贝数增益与I-II期NSCLC中更短的总体存活统计学上显著相关。
相应地，本公开内容提供了通过评估在Chr19, 34.7 Mb-35.6 Mb (Chr 19, 起始位置: 34722418；终止位置35643933，在人基因组装配物hg18中 (NCBI Build 36; “M1”)的染色体DNA拷贝数，测定在人中的早期非小细胞肺癌(NSCLC)的预后的方法。已知该DNA段包含编码细胞周期蛋白E1(CCNE1)等的基因序列。较差预后相对于具有正常基线拷贝数、即2个拷贝的包含CCNE1的标记的患者进行评估。使用总体存活和复发时间的测量来发现较差预后与标记中的拷贝数增益相关。本方法对于提供关于早期NSCLC患者的改善预后信息是特别有利的，并且使得关于处于癌症复发的更高危险中的那些早期NSCLC患者的改进治疗选择成为可能。
本方法包括使用广泛使用的TNM分期系统，用于测定分类为早期癌症的NSCLC患者的预后的方法，所述患者特别是分类为IA期、IB期、IIA期或IIB期(IIA和IIB期统称为II期)的那些。基于其他诊断分类法的可替代的NSCLC分期系统可以用于鉴定其组织样品可以通过本发明方法进行测定的患者。如本文使用的，早期NSCLC指未扩展至超过一个淋巴结、也未转移至任何其他器官的NSCLC肿瘤。早期NSCLC患者几乎一直通过寻求完全肿瘤摘除的手术切除进行治疗，然而，即使当肿瘤被认为完全切除时，也存在关于这些早期患者的显著复发危险。目前诊断模式不允许精确预测这些早期癌症中的哪些是复发的高危险，并且因此应在切除后用辅助化学疗法或在切除前使用新辅助化学疗法进行治疗。本发明方法提供了通过测定患者样品中的染色体拷贝数对处于更高危险的那些早期患者的预后鉴定。
因此，在一个方面，该方法包含预测就肺癌治疗的患者中的疾病后果的方法。提供了其为来自患者的生物学样品的测试样品，并且测定测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数。来自测试样品的拷贝数针对基线拷贝数2进行比较，从而测定关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在。基于测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在，当与在不具有细胞周期蛋白E1基因中的拷贝数增益的患者中疾病后果的基线测量比较时，将患者鉴定为具有不良疾病后果的增加危险。细胞周期蛋白E1基因中的拷贝数增益的存在，即扩增，预测不良疾病后果。不良疾病后果是当与关于细胞周期蛋白E1基因不具有拷贝数增益的患者的总体存活时间比较时减少的总体存活时间、和当与关于细胞周期蛋白E1基因不具有拷贝数增益的患者的复发时间比较时更短的复发时间中的至少一个。该方法还包含预测就肺癌治疗的患者中的治疗后果的方法，其中基于关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在，当与关于细胞周期蛋白E1基因不具有拷贝数增益的患者的总体存活时间比较时，做出关于患者是具有减少的总体存活时间还是更短的复发时间的更高危险的测定。
该方法还可以应用于选择用于患有肺癌的患者的治疗的问题。例如，该方法可以包括：提供来自患者的测试样品，其中化学治疗剂是用于患者的至少一个治疗选项；测定样品中是否存在关于细胞周期蛋白E1的拷贝数增益；和基于是否存在拷贝数增益来确定患者是否应当用化学治疗剂治疗。可选地，该方法可以包括基于步骤c)中的比较确定化学疗法治疗方案。基于步骤c)中的比较确定治疗方案的步骤包括例如，当对于Chr19, 34.7 Mb-35.6 Mb (具体地，Chr 19，起始位置：34722418；终止位置：35643933，在人基因组装配物hg18中(NCBI Build 36))的M1序列中的CCNE1存在拷贝数增益时，选择化学治疗剂且测定化学疗法治疗的频率。例如，当对于CCNE1存在拷贝数增益时，可以选择更攻击性的化学治疗方案，包括更强的化学治疗剂和/或更频繁的治疗。该方法还可以用于将患者分类为具有对于治疗是抗性的肺癌。例如，考虑到拷贝数增益存在于来自患者的样品中的测定，将患者分类为具有对于进一步治疗是抗性的肺癌。患者可以目前用化学疗法、放射、手术或其任何组合治疗，或可以就化学疗法、放射、手术治疗或其任何组合中的任何一种考虑。
测定步骤(b)例如使用原位杂交执行，且更优选地，用荧光标记的核酸探针或包含核酸类似物的荧光标记的探针的荧光原位杂交(FISH)。优选地，使用至少2种核酸探针。可以使用肽核酸探针。测定步骤(b)还可以通过如本领域已知的聚合酶链反应、核酸测序测定或核酸微阵列测定执行。
早期NSCLC的测试优选对得自患者的合适生物学样品通过原位杂交完成。一般而言，原位杂交包括固定生物学样品、使一种或多种染色体探针与固定样品内含有的靶DNA杂交、洗涤以去除非特异性结合的探针、且检测杂交的探针的步骤。原位杂交还可以在液体悬液中用来自生物学样品的样品细胞执行，随后为通过流式细胞术检测。该方法优选使用具有2个探针组的FISH测定，所述探针组包含对于Chr19, 34.7 Mb-35.6 Mb特异性的探针，以评价来自患者的生物学样品中的染色体拷贝数异常。用于在本方法中使用的优选FISH探针包含对于Chr19, 34.7 Mb-35.6 Mb特异性的一对探针，其可以包括编码CCNE1的序列的任何部分。
根据本公开方法的NSCLC预后的鉴定还可以与其他预后体外诊断测定一起使用，例如评价在患者样品中已知在M1标记区域中编码的合适蛋白质CCNE1和其它蛋白质的表达。其样品发现具有与异常染色体拷贝数模式(其与不利后果(预后不良)相关)结合的此类蛋白质表达的患者对于更攻击性的手术后治疗例如化学治疗可以是合格的。
一般地，对于肺癌患者，生物学样品是组织样品，例如含有循环肿瘤细胞的外周血样品、或肺肿瘤组织活组织检查或切除。其他合适的组织样品包括例如薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、肺洗涤样品、胸腔积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品或由外周血样品中的任何产生的提取物或加工的样品。优选地，应用TNM分期系统，已将样品分类为早期癌症，例如IA期、IB期、IIA期或IIB期中的任何。
根据本文描述的癌症后果标记M1：(Chr 19，起始位置：34722418；终止位置：35643933，在人基因组装配物hg18中(NCBI Build 36))的多核苷酸序列构建的探针可以用于多种测定方法中，以提供多个类型的分析。例如，此类探针可以用于荧光原位杂交(FISH)技术中，以执行染色体分析，包括拷贝数概况分析，并且用于鉴定癌症后果标记中的癌症特异性拷贝数变化。探针还可以用放射性同位素、可直接或间接检测的半抗原或荧光分子进行标记，并且用于原位杂交研究，以评价组织样品或细胞中癌症后果标记的拷贝数。
探针与靶多核苷酸序列选择性结合，其是如本文描述的M1的序列的至少一部分，即在特定个体中扩增的染色体区域。本文提供的癌症后果标记的核苷酸序列或其任何部分可以用于产生探针，其可以用于多个测定中用于测试样品中的拷贝数概况分析。可以由M1的保守核苷酸区域、或由M1的非保守核苷酸区域或其任何部分包括其中含有的基因及其部分设计探针。用于在测定中最佳化的此类探针的设计容易由本领域普通技术人员完成。一般地，当需要最大限度特异性时，核酸探针由非保守或独特区域发展，并且当测定与例如多基因家族或相关物种如小鼠和人中的不同成员紧密相关的核苷酸区域时，核酸探针由保守区域发展。
聚合酶链反应(PCR)是用于扩增核酸或其混合物中含有的所需核酸序列(靶)的技术。在PCR中，一对引物以过量采用，以与靶核酸的互补链杂交。引物各自使用靶核酸作为模板通过聚合酶延伸。在从原始靶链解离后，延伸产物变成靶序列自身。新引物随后杂交且通过聚合酶延伸，并且重复该循环以几何增加靶序列分子的数目。PCR公开于引入本文作为参考的美国专利号4,683,195和4,683,202中。
连接酶链反应(LCR)是用于核酸扩增的可替代方法。在LCR中，使用包括2种初级(第一种和第二种)和2种次级(第三种和第四种)探针的探针对，其全部以对于靶的摩尔过量采用。第一种探针与靶链的第一个区段杂交，并且第二种探针与靶链的第二个区段杂交，第一个和第二个区段这样邻接，从而使得初级探针以5'磷酸-3'羟基关系彼此毗邻，并且从而使得连接酶可以将2种探针共价融合或连接成融合产物。此外，第三种(次级)探针可以与第一种探针的部分杂交，并且第四种(次级)探针可以以相似毗邻方式与第二种探针的部分杂交。当然，如果靶最初是双链的，那么次级探针还将与第一种情况下的靶互补体杂交。一旦初级探针的连接链与靶链分开，它就与第三种和第四种探针杂交，其可以连接以形成互补的次级连接产物。重要的是认识到连接的产物在功能上等价于靶或其互补体。通过杂交和连接的反复循环，达到靶序列的扩增。这种技术在1989年6月16日公开的给予K. Backman的EP-A-320 308和1991年7月31日公开的给予K. Backman等人的EP-A-439 182中更全面地描述，所述2个专利引入本文作为参考。
对于mRNAs的扩增，在本公开内容的范围内的是：将mRNA逆转录成cDNA，随后为聚合酶链反应(RT-PCR)；或使用单一酶用于2个步骤，如引入本文作为参考的美国专利号5,322,770中描述的；或将mRNA逆转录成cDNA，随后为不对称缺口连接酶链反应(RT-AGLCR)，如由同样引入本文作为参考的R. L. Marshall等人，PCR Methods and Applications 4:80-84(1994)中描述的。
染色体探针。用于原位杂交技术的合适探针落入下列3个宽泛组：染色体计数探针，其与染色体区域杂交且指示染色体的存在或不存在；染色体臂探针，其与染色体区域杂交且指示染色体的臂的存在或不存在；和基因座特异性探针，其与染色体上的特异性基因座杂交且检测特异性基因座的存在或不存在。当在该方法中使用时，就灵敏度和/或特异性选择染色体探针及其组合。探针组可以包括任何数目的探针，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种探针。个别探针和探针组的选择可以根据本领域常规执行，例如如其完整公开内容引入作为参考的US 20060063194中所述。此类选择方法利用区分和/或组合分析，以选择对于癌症后果标记的拷贝数概况分析有用的探针和探针组。
根据本公开内容用于检测异常拷贝数模式(非整倍体性(aneusomy)或多体性)的用于在原位杂交方法中使用的合适探针是可与M1序列的至少部分杂交的染色体计数探针和染色体基因座特异性探针的组合，其中每种探针进行标记以彼此区分。如本领域众所周知的，染色体计数探针可以与重复序列杂交，其定位接近着丝粒或从着丝粒中迁移，或可以与定位于染色体上的任何位置上的独特序列杂交。例如，染色体计数探针可以与重复DNA杂交，所述重复DNA与染色体的着丝粒结合。灵长类动物染色体的着丝粒含有DNA的长串联重复的复杂家族，所述DNA包含约171个碱基对的单体重复长度，其称为α-卫星DNA。特异性染色体计数探针的非限制性例子是Vysis CEP® 10 SpectrumGreen探针(Abbott Molecular，Inc.，Des Plaines，Illinois)。例如，染色体19计数探针与基因座特异性探针一起用于检测在Chr19，34.7 Mb-35.6 Mb上的拷贝数异常，例如以测定其中含有的基因座的缺失和/或多体性状态。基因座特异性探针与染色体上的特异性、非重复基因座杂交，并且因此合适的基因座特异性探针包括例如M1中包含的任何基因的至少部分，例如CCNE1基因的任何部分。基因座特异性探针在例如与Vysis CEP® 10 SpectrumGreen探针混合的探针组中从Abbott Molecular Inc.商购可得。
与着丝粒DNA杂交的探针从Abbott Molecular Inc.(Des Plaines，IL)和Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)商购可得。可替代地，探针可以使用众所周知的技术非商业制备。用于在构建DNA探针中使用的DNA的来源包括基因组DNA、克隆的DNA序列例如细菌人工染色体(BAC)、含有人染色体的一个或部分连同宿主的正常染色体互补体的体细胞杂交物、和通过流式细胞术或显微解剖纯化的染色体。目的区域可以通过克隆或通过位点特异性扩增经由聚合酶链反应(PCR)进行分离。参见例如，Nath等人，Biotechnic Histochem，1998，73(1)：6-22；Wheeless等人，Cytometry，1994，17:319-327；和美国专利号5,491,224。用于制造有用的基因座特异性探针的起始人DNA可以这样获得，从人基因组数据库例如由University of California Santa Cruz维持的那种中获得关于基因座的核酸序列，并且随后使用那个序列在计算机芯片上筛选BAC人DNA文库，例如由Roswell Park Cancer Center或Invitrogen维持的那种，以鉴定有用的BAC克隆。还可以使用合成的寡聚DNA探针或由核酸类似物制备的探针，例如肽核酸(PNA)探针。
通过根据本方法应用的探针检测的染色体区域的大小可以在大小方面不同，例如从短的数百个碱基对探针序列到900,000个碱基的大区段。直接标记的基因座特异性探针在复杂性中优选是至少100,000个碱基，并且如引入本文作为参考的美国专利号5,756,696中公开的，使用未标记的封闭核酸，以避免探针的非特异性结合。还可以使用未标记的、合成的寡聚核酸或未标记的核酸类似物，例如肽核酸作为封闭核酸。
染色体探针可以含有任何检测部分，当与染色体杂交时，其促进探针的检测。有效的检测部分包括如本文描述的直接和间接标记。可检测标记的例子包括荧光团(即在吸收光后发荧光的有机分子)、放射性同位素(例如32P和3H)和生色团(例如产生可视觉检测的标记的酶促标记)。荧光团是优选的，并且可以通过用标准技术例如切口平移、随机引发和PCR标记将标记的核苷酸掺入探针内，在与核苷酸共价附着后直接标记。可替代地，在探针内的脱氧胞苷核苷酸可以用接头进行转氨基。荧光团随后可以与转氨基的脱氧胞苷核苷酸共价附着。参见例如，引入本文作为参考的给予Bittner等人的美国专利号5,491,224。有用的探针标记技术在引入本文作为参考的Molecular Cytogenetics：Protocols and Applications，Y.-S. Fan，编辑，第2章，"Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets"，L. Morrison等人，第21-40页，Humana Press，© 2002中描述。
可以在本文描述的方法中使用的荧光团的例子是：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，Texas Red™(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)；5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B，5-(和-6)-羧基荧光素；5-异硫氰酸荧光素(FITC)；7-二乙氨基香豆素-3-羧酸，四甲基罗丹明-5-(和-6-)异硫氰酸；5-(和-6-)羧基四甲基罗丹明；7-羟基香豆素-3-羧酸；6-[荧光素5-(和-6-)甲酰胺]己酸；N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-bora-3a，4a二氮杂-3-茚烯丙酸；5-异硫氰酸曙红；5-异硫氰酸赤藓红；5-(和-6-)羧基罗丹明6G；和Cascade™蓝色乙酰叠氮化物(acetylazide)(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。在优选探针组中，使用不同颜色的荧光团，从而使得组中的每种染色体探针可以清楚显现。
在杂交后，探针可以用荧光显微镜和用于每种荧光团的合适滤波器，或通过使用双重或三重带通滤波器组进行显现，以观察多重荧光团。参见例如，引入本文作为参考的给予Bittner等人的美国专利号5,776,688。任何合适的显微镜成像方法可以用于显现杂交的探针，包括自动化数字成像系统，例如从MetaSystems或Applied Imaging可获得的那些。可替代地，技术例如流式细胞术可以用于检查染色体探针的杂交模式。
探针还可以例如通过本领域众所周知的方法用生物素或地高辛进行间接标记。然而，随后需要次级检测分子或进一步加工以显现标记的探针。例如，用生物素标记的探针可以通过与可检测标记例如荧光团缀合的抗生物素蛋白(例如链霉抗生物素蛋白)进行检测。另外，抗生物素蛋白可以与酶促标记例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。此类酶促标记可以在标准比色反应中使用用于酶的底物进行检测。用于碱性磷酸酶的底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和硝基蓝四唑。二氨基联苯胺可以用作用于辣根过氧化物酶的底物。
对于该方法有用的探针和探针组可以与其他试剂一起包装到在执行如本文公开的方法中使用的试剂盒内。
优选的探针组。示例性探针组合物包含直接标记的DNA FISH探针的混合物。例如，此类探针组将包括Vysis SpectrumOrange探针和Vysis SpectrumGreen探针。合适的探针组在合适的杂交缓冲液中预混合商购可得。
样品的制备。生物学样品是含有细胞或细胞材料的样品，包括来自患者样品的含细胞提取物。例如，肺样品一般是衍生自肺结构的细胞或细胞材料，所述肺结构包括但不限于肺实质、细支气管、小支气管、支气管和气管。对于检测肺癌有用的生物学样品的非限制性例子包括支气管样品、切除的肺组织、肺活组织检查和唾液样品。支气管样品的例子包括支气管分泌物、洗涤液、灌洗液、抽吸物和刷洗物。肺活组织检查可以通过包括手术、支气管镜检查、细针抽吸(FNA)和经胸针吸活组织检查的方法获得。在一个例子中，触摸制备物可以由肺活组织检查进行制备。本发明测定还可以对衍生自来自早期NSCLC患者的血液样品的循环肿瘤细胞样品执行。循环肿瘤细胞样品可以使用可从Immunicon获得的免疫磁性分离技术进行制备。
组织可以用固定剂例如甲醛进行固定且随后包埋在石蜡中。随后使用切片机切割切片并且应用于显微镜载玻片。细胞学样品可以由衍生自FNA的细胞悬液、支气管洗涤液、支气管灌洗液或唾液或散布的组织细胞进行制备。细胞学样品可以通过下述进行制备：与细胞离心组合的在乙醇或甲醇:乙酸中固定细胞、薄层沉积方法(例如ThinPrep，Cytyc Corp.)、涂片或吸取到显微镜载玻片上。此外，生物学样品可以包括渗出液例如胸腔积液、心包积液或腹膜积液。
杂交方法。可以使用任何合适的原位杂交方法。在原位杂交前，使染色体探针和细胞内含有的染色体DNA各自变性。如果染色体探针制备为单链核酸，那么不需要探针的变性。变性一般在高pH、热(例如约70℃ - 约95℃的温度)、有机溶剂例如甲酰胺和卤化四烷基铵或其组合的存在下通过温育执行。例如，染色体DNA可以通过超过70℃的温度(例如约73℃)和含有70％甲酰胺和2X SSC(0.3M氯化钠和0.03 M柠檬酸钠)的变性缓冲液的组合进行变性。变性条件一般这样建立，从而使得细胞形态得到保存。例如，染色体探针可以通过热例如通过使探针加热至约73℃约5分钟进行变性。
在变性化学制品或条件去除后，在杂交条件下使探针对染色体DNA退火。“杂交条件”是促进探针和靶染色体DNA之间的退火的条件。取决于探针的浓度、碱基组成、复杂性和长度，以及盐浓度、温度和温育时长，杂交条件不同。例如，原位杂交一般在含有1-2.X.SSC、50-55％甲酰胺、杂交加速剂(例如10％硫酸葡聚糖)和未标记的封闭DNA以抑制非特异性杂交的杂交缓冲液中执行。一般而言，如上所述，杂交条件包括约25℃ - 约55℃的温度，和约0.5小时-约96小时的温育时长。更具体而言，杂交可以在约32℃ - 约45℃执行约2-约16小时。
染色体探针与靶区域外的DNA的非特异性结合可以通过用盐溶液的一系列洗涤得到去除。在每次洗涤中的温度和盐浓度取决于所需严格性。例如，对于高严格性条件，洗涤可以在约65℃ - 约80℃执行，使用0.2.X - 约2.X.SSC，和约0.1％- 约1％非离子型去垢剂例如Nonidet P-40(NP40)。严格性可以通过降低洗涤温度或通过增加洗涤中的盐浓度得到降低。
探针与组织样品的杂交可以手动或借助于仪器执行，例如ThermoBrite杂交炉、VP 2000 Processor或XMatrixTM加工仪器(都从Abbott Molecular，Inc.商购可得)。
细胞的预选择。细胞样品可以通过多种方法和使用多种标准进行初步评价。本文描述的探针和方法并不限于关于特定筛选方法的使用。一个例子是“筛选方法”，其中观察者就细胞学异常扫描数百到数千个细胞，例如如用DAPI滤波器显现的。评估的细胞数目将取决于样品的细胞性，其从患者到患者不等。与发育不良和瘤性细胞通常但不总是相关的细胞学异常包括核扩大、核不规则和异常DAPI染色(通常在颜色中是杂色且更亮的)。在扫描步骤中，观察者优选将就染色体异常(如通过FISH证实的)的细胞评价集中于同样显示出细胞学异常的那些细胞。此外，可以评价不具有明显细胞学异常的细胞比例，因为染色体异常也在不存在细胞学异常的情况下出现。这种扫描方法在引入本文作为参考的给予Halling等人的美国专利号6,174,681进一步详细描述。使用引入本文作为参考的Morrison等人的美国专利公开2003/0087248 A1中所述的方法，可以选择肺癌细胞用于评价。
还可以使用常规染料例如含有苏木精和曙红的染料选择样品的区域用于评价。例如，病理学家可以用苏木精/曙红染料染色石蜡包埋样品的切片，通过组织形态和染色模式将区域鉴定为可能癌性的，且用毡尖墨水笔或玻璃划线描绘那个区域的轮廓。标记的区域随后用玻璃划线转移至在石蜡包埋样品的连续切片上的相应位置，并且在那个载玻片上执行FISH。在划线区域内的细胞随后就FISH信号进行评价。
染色体异常的分类模式的检测。异常细胞特征在于染色体拷贝数异常的一个或多个模式的存在。通过检查细胞中染色体探针的杂交模式(例如关于每种探针的信号数目)，且记录信号数目，评估在患者样品中的细胞中的拷贝数异常模式的存在。非整倍体性一般意指完整染色体或染色体上的基因座的异常拷贝数。异常拷贝数包括常染色体的单体性(一个拷贝)和缺对性(零拷贝)，也称为缺失，和大于2个拷贝，其对于特定染色体基因座有时称为基因扩增(可替代地，扩增保留用于其中基因拷贝数超过它在其中含有的染色体的拷贝数的情况)。然而，石蜡包埋的样品的切片(一般4-6 μm)可以导致细胞核的平截，从而使得对于某些细胞的FISH信号数目/细胞将略微低于完整核中的实际拷贝数。测定关于每种探针的特定FISH探针杂交信号的绝对数，并且随后用于多种比率比较中。
测试样品可以包含对于临床诊断足够的任何数目的细胞，并且在优选的石蜡包埋的组织样品中，杂交模式一般在约20-约200个细胞中进行评估。优选在约40-约120个细胞/样品中评估杂交模式。
本公开内容因此描述了可以解决公认的治疗困境的新发现(含细胞周期蛋白E的标记区域M1的DNA拷贝数增益)，其通过提供测定具有早期疾病的哪些患者处于疾病复发或转移的最高危险中并且谁应由药物(或可替代方案如放射)治疗进行决定性治疗的方法，以使其长期存活的机率达到最大。进而，本公开内容描述了致使特异性DNA测试成为可能的发现，所述特异性DNA测试检测包含编码细胞周期蛋白E的核苷酸序列的区域的染色体拷贝数增益，所述细胞周期蛋白E是其表达信号先前已关联于不良癌症患者后果的基因。因此，当关于细胞周期蛋白E拷贝数增益的测试是阴性的或存在正常拷贝数时，这鉴定具有疾病复发或转移的低危险或无危险的患者，其在其最初肿瘤切除后不需要随访治疗。这些测试策略可以显著影响具有早期NSCLC的患者中的发病率和死亡率。本文使用的方法还暗示对于其他癌症的应用，以类似地检测与疾病进展的时间和/或总体存活显著相关的细胞周期蛋白E的DNA拷贝数增益。像这样，本文公开的方法具有解决哪些早期NSCLC患者应在手术后接受药物治疗的问题的潜力，并且可以广泛影响癌症治疗决定和患者后果。
试剂盒。在一个方面，本公开内容也提供了试剂盒，其包含：a)用于测定关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂；和b)用于执行测试的说明书。在试剂盒的一个示例性实施方案中，测定拷贝数增益的存在或不存在的试剂包括与至少部分M1(Chr 19，起始位置：34722418；终止位置：35643933，在人基因组装配物hg18中(NCBI Build 36))杂交的可检测标记的多核苷酸，其可以包含或可以不包含编码CCNE1的区域的该部分的任何部分。例如，合适的试剂盒包含能够与M1杂交的上述探针中的任一种。
本公开内容的细节在下述实施例中进一步列出，所述实施例不预期限制如请求保护的本发明的范围。本领域技术人员应认识到在审阅本说明书后，本方法的变化和修饰可以是显而易见的。因此目的是提供本文描述的实施方案的此类修饰和变化，而不背离本发明的范围或精神。
实施例
实验方法：样品。使用高密度SNP基因分型微阵列(Affymetrix 100K阵列组)，总共178个NSCLC临床注解的样品就基因拷贝数改变进行概况分析。将所有样品小心分开，以使肿瘤/正常组织比达到最大，且验证组织病理学类型和分期。仅分析来自具有I和II期疾病的患者的样品。所有这些来自用手术切除治疗而无任何新辅助化学疗法的患者。对于每个患者收集的临床信息包括种族、年龄、出生日期、性别、临床分期、病理期、位置、手术操作(SP)日期、组织学、分化、诊断日期、结节阳性、吸烟状态、化学疗法状态、放射状态、复发状态、复发日期、复发位置、复发时间、末次随访日期、在末次随访时的状态、活的/死的、总体存活和死因。选择复发时间(TTR)和总体存活(OS)作为后果参数。其他临床参数(结节状态、分期等)视为混杂变量。肺癌的复发时间得自病例表(patient chart)。
表2和3分别提供了关于研究的患者群组的总体存活和总复发时间的数字。
表2： OS
表3： TTR
拷贝数概况分析：来自每个肿瘤的约30 mg组织用于提取高分子量、基因组DNA，其使用Qiagen DNAeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，遵循通过制造商的说明书进行。通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA的质量。将250纳克DNA加工用于与2个微阵列各自杂交，包含Genechip Human Mapping 100K组(Matsuzaki H，Dong S，Loi H,等人 Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays. Nat Methods 2004；1:109-11)阵列(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)，其涵盖人基因组中的116,204个单核苷酸多态性(SNP)基因座，具有23.6 kb的平均标记间距离。微阵列根据制造商(www.affymetrix.com)的建议进行加工。拷贝数通过比较芯片信号与48个正常女性样品的平均值进行计算。通过QC去除具有正常组织污染的样品。
统计方法。单变量分析用于测试作为潜在混杂因素的下述参数：病理期、临床分期、吸烟状态、年龄、性别、结节状态、组织学(腺癌与鳞状细胞癌比较)。未检测到显著效应。在存活分析中，测试临床分期和标记区域的相互作用。无拷贝数异常与分期具有显著相互作用(FDR <0.05)。
结果：图1是显示对于78个样品，在含和不含M1(Chr 19，起始位置：34722418；终止位置：35643933)，在人基因组装配物hg18中(NCBI Build 36)的扩增(即至少一个的拷贝数增益))的患者之间在OS中的差异的Kaplan-Meier曲线图。在Kaplan-Meier曲线图中，x轴代表以天表示的(存活)时间，并且y轴代表患者存活的概率。无论何时出现死亡，曲线都下降。关于具有扩增即标记拷贝数增益的患者的数据由下(较深)线在曲线图上显示。关于具有正常基线互补体2的患者的数据显示在曲线图的上(较浅)线中。(FDR调整的p值= 0.0299)。在该78个样品中，总共27个显示标记扩增的证据：17个具有3个拷贝，3个样品具有4个拷贝并且7个样品具有5个或更多个拷贝。扩增的区段是大约0.9 Mb长，并且包含含有细胞周期蛋白E1基因(CCNE1)的核苷酸序列，加上：C19orf12染色体19可读框12，C19orf2染色体19可读框2，PLEKHF1 (含普列克底物蛋白同源结构域，家族F(具有FYVE结构域)成员1)，POP4前体4的加工，核糖核酸酶P/MRP亚基(酿酒酵母(S. cerevisiae))和ZNF536锌指蛋白536。如由图1中的Kaplan-Meier曲线图可见的，扩增即包含CCNE1的标记中的拷贝数增益与NSCLC I-II期患者中的更短的OS相关。表4列出了关于几种标记、包括Chr19上的M1的总体存活数据。(关于其数据在表4的后2行显示的Chr6上的标记在不同临床分期之间共享)。
表4：关于包含Chr19, 34.7Mb-35.6 Mb的标记的总体存活
与先前鉴定的预测物(表达标记)不同，本文描述的生物标记M1代表DNA增益(可通过FISH测量的稳定事件)。FISH探针可以用于致使标记的验证/使用成为可能，并且标记是关于在临床试验中用作分层生物标记的强候选物。它可以用于例如限定具有不同后果的疾病的分子亚组。像这样，它可能与药物应答相关。
这些数据指示，使用通过FISH测量的包含细胞周期蛋白E1基因座的M1的基因组拷贝数评价和利用合适的分类器在早期NSCLC中具有预测重要性。分类器能够产生患者进入有利和不利的复发范畴内的统计上显著分类，所述患者已用手术治疗而无新辅助或随访化学疗法。目前的临床体外诊断测定未提供这个能力。因此，对早期NSCLC活组织检查样品或切除的肿瘤执行的关于Chr 19, 34.7 Mb-35.6 Mb、包括关于细胞周期蛋白E1的基因组序列的FISH测定在与手术和辅助治疗相关的决定中看起来是有价值的。
应当理解前述说明书预期举例说明且不限制本发明的范围。本发明的其他方面、优点和修饰在下文阐述的权利要求的预期范围内。

Claims (12)

1.测定关于细胞周期蛋白E1和ZNF536基因的拷贝数增益的存在或不存在的试剂在制备选择用于患有肺癌的患者的治疗的方法中使用的试剂盒中的用途，所述方法包括步骤：
a) 提供来自患者的测试样品，其中用化学治疗剂的治疗是用于所述患者的至少一个治疗选项；
b) 测定所述测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数和关于ZNF536基因的拷贝数；
c) 针对细胞周期蛋白E1基因的正常拷贝数比较所述测试样品中所述细胞周期蛋白E1基因的拷贝数，其中所述细胞周期蛋白E1基因的正常拷贝数是2，从而测定所述测试样品中关于细胞周期蛋白E1基因的拷贝数增益的存在或不存在；
d) 针对ZNF536基因的正常拷贝数比较所述测试样品中所述ZNF536基因的拷贝数，其中所述ZNF536基因的正常拷贝数是2，从而测定所述测试样品中关于ZNF536基因的拷贝数增益的存在或不存在；
e) 基于步骤c)和d)中的比较，选择化学疗法治疗方案；和
f) 当对于Chr19，34.7 Mb-35.6 Mb中的细胞周期蛋白E1和ZNF536基因存在拷贝数增益时，选择手术后辅助化学疗法；
其中所述肺癌是I-II期非小细胞肺癌，且
其中和与不存在关于细胞周期蛋白E1和ZNF536基因的拷贝数增益相关的总体存活时间相比，关于细胞周期蛋白E1和ZNF536基因的拷贝数增益的存在与减少的总体存活时间相关。
2.权利要求1的用途，其中所述测试样品包含组织样品。
3.权利要求2的用途，其中所述组织样品包含血液样品、肿瘤组织或可疑肿瘤组织、薄层细胞学样品、细针抽吸物样品、肺洗涤样品、胸腔积液样品、新鲜冷冻组织样品、石蜡包埋的组织样品或由外周血样品中任何一种产生的提取物或加工的样品。
4.权利要求2的用途，其中所述组织样品包括肺组织样品或包含循环肿瘤细胞的外周血样品。
5.权利要求1的用途，其中步骤b)所述的测定通过原位杂交执行。
6.权利要求5的用途，其中所述原位杂交用荧光标记的核酸探针执行。
7.权利要求5的用途，其中所述原位杂交用至少2种核酸探针执行。
8.权利要求5的用途，其中所述原位杂交用肽核酸探针执行。
9.权利要求1的用途，其中步骤b)所述的测定通过聚合酶链反应执行。
10.权利要求1的用途，其中步骤b)所述的测定通过核酸测序测定执行。
11.权利要求1的用途，其中步骤b)所述的测定通过核酸微阵列测定执行。
12.权利要求1的用途，其中所述患者还用放射或手术或其组合进行治疗。
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