KR100759288B1 - 비교유전자보합법을 이용한 폐암 및 폐암의 하부유형 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전체 게놈중 유전자 변이를 스크리닝하는 방법을 사용하여 폐암 및 폐암의 하부 유형을 진단하는 방법에 대한 것이다. 구체적으로는 게놈-와이드 어레이 CGH를 폐암 조직으로부터 추출된 DNA에 적용하여, 폐암 및 폐암의 하부유형에 특이한 유전 변이들을 확인하여 이를 폐암 및 폐암의 하부유형에 대한 정확한 진단을 하는데 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 폐암에 특이한 유전변이를 폐암 진행에 있어서의 예후적 표지자로 사용하는 방법에 관한 것이다.

폐암, 유전변이

Description

비교유전자보합법을 이용한 폐암 및 폐암의 하부유형 진단 방법 {Diagnostic Methods of Lung Cancer and Its Subtypes by CGH}

도 1은 비소세포성 폐암의 50 케이스에서 게놈-와이드 카피 숫자 변화를 나타낸다.

(A)는 29 SqCs (위) 및 21 AdCs (아래)의 게노믹 프로파일을 나타낸다. 50개의 비소세포성폐암 케이스들은 두 하부 유형에서 상응하는 샘플 숫자와 함께 개별적인 레인에 표시되어있다. 강도 비율은 참고 색깔 막대에 나타난 대로 게노믹 획득(빨강) 및 결실(초록)의 정도를 반영하여 다른 색깔 등급에 의하여 도식적으로 도표화되었다. 총 2987 BAC 클론이 지도상의 위치 및 1pter 로부터 Yqter까지의 염색체 순서에 따라 순서 지어졌다(x-축).

(B)는 각각의 클론에 대한 모든 유의한 획득 (강도 비율 > 0.2, 위) 및 결실(강도 비율 <-0.2, 아래)의 게놈-와이드 빈도는 각각 SqCs 의 29 케이스(검정, 중앙의 위) 및 AdCs의 21 케이스 (회색, 중앙의 아래)에 대하여 나타낸다. 개별적인 염색체의 경계 및 동원체(centromere)의 위치는 각각 도표 아래에 있는 수직의 막대 및 점선에 의하여 나타난다.

도 2는 높은 카피 숫자 변화의 개별적인 프로파일들을 나타낸다.

(A)는 염색체의 긴팔에서 92 BAC 클론들에 대한 강도 비율 프로파일을 AdCs-1에 대하여 나타낸다. x-축은 UCSC 인간 게놈(2004년 5월 동결)에 따른 상응하는 클론의 지도상 위치를 나타내며, 강도 비율은 y-축에 나타난다. 세포유전학적 밴드 및 지도상의 위치에 대한 도식적 표시가 도표 밑에 나타나 있다.

(B)는 염색체 17의 긴팔에서의 지역적인 높은 수준의 증폭을 나타낸다.

(C)는 SqCs9 및 SqCs22 에 대한 염색체 3의 긴팔의 강도 비율 프로파일이 3q21-q29에 대하여 보여 지는 것을 나타낸다.

(D)는 염색체 10q23.31 상의 동형접합 결실을 나타낸다.

도 3은 게노믹 획득 또는 결실의 미세한 지역들에 대한 예를 나타낸다. 반복 변이된 최소염색체 지역(minimally altered region, MAR)은 적어도 7개의 케이스에 대하여 흔하게 바뀌는 단편 반복에 의하여 한정하였다. 각각의 샘플은 개별적 레인으로 표시되고 있다. MAR은 세포유전학적 밴드 아래의 색깔로 표시된 상자로서 도식적으로 나타난다. 빨강, 게노믹 획득; 초록, 게노믹 결실; 검정, 변화 없음.

(A)는 16 샘플에서 다른 게노믹 크기의 2개의 반복 변이된 최소염색체 지역을 나타낸다. 연결부에 가까운 쪽의 것은 30Mb의 크기인 반면 말단의 것은 1Mb 보다 작다.

(B)는 염색체 5에서 7개의 비소세포성 폐암에 공통된 염색체 5 상의 반복 변이된 최소염색체 지역 결손을 나타낸다.

도 4는 카플란-마이어 생존곡선을 나타낸다. 특이한 게노믹 변화 있는 또는 없는 케이스들에 대한 생존곡선은 카플란-마이어 방법을 사용하여 도식화하였다. 상대적으로 나쁜예후와 관련된 염색체 변화는 유의성 수준과 함께 나타난다; 10p (A) 및 16q (B) 의 획득, 9p (C) 및 13q (D)의 결실, 6p21 (E) 및 19q31 (F) 상의 MAR-Gs.

본 발명은 전체 게놈중 유전자 변이를 스크리닝하는 방법을 사용하여 폐암 및 폐암의 하부유형을 진단하는 방법과 폐암에 특이한 유전 변이를 폐암 진행의 예후적 표지자로 사용하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 가장 흔한 형태의 악성질환이고 또한 세계적으로 암에 의한 사망의 주요한 원인이다(1, 2). 원발성 폐암은 네 개의 중요한 조직학적 하부 유형; 비늘모양 세포 악성종양(squamous cell carcinomas, SqCs; 이하 SqCs이라한다. ), 선암(adenocarcinomas, AdCs;이하 AdCs라 한다), 큰 세포 폐암과 소세포성 폐암으로 구분된다. 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)으로 묶여지는 전반부의 세 유형은 폐암 전체 발생의 거의 80%를 차지한다. 비소세포성 폐암에서 SqCs 및 AdCs는 두 중요한 하부 유형이다. 조직학적으로 다른 하부 유형은 임상 단계에서 다른 양상으로 진행하는 것으로 알려져 있으며, 개별적인 치료법으로의 접근이 필요하다. 종양에서 몇몇의 게노믹 이상은 치료 또는 예방을 위한 타깃의 예후적 표지자 또는 유전자들의 식별자로 제안되었다 (3, 4). 다른 고형 종양에서와 마찬가지로, 염색체 이상은 폐암 병발생에 있어서의 매우 중요한 분자적 현상으로 생각된다(5, 6). 그러나 임상적으로 적용 가능한 스크리닝 도구 또는 예후적 표지자는 아직 개발되어 있지 않다. 효과적인 스크리닝 방법 및 치료의 부족 때문에 폐암의 치료 실적이 저조하므로 유전 이상의 게놈-와이드 연구가 더욱 정확한 진단 및 치료 전략을 개발하는데 도움을 줄 것으로 기대되고 있다. 이러한 이유 때문에, 전통적인 비교유전자보합법(comparative genomic hybridization, CGH) 또는 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)을 사용하는 기존의 세포유전학적 연구들은 비소세포성 폐암과 관련된 염색체 이상을 밝혀내는데 초점을 맞춰왔다. 3p, 6q, 8p, 9p, 13q, 및 17p 상에서의 결실과 병행하여 1q, 3q, 5p, 및 8q 상에서 부분적인 또는 전체 염색체팔의 획득을 포함하는 반복적인 유전변이가 비소세포성 폐암에서 관찰되었다(7-11).

그러나 약 10Mb의 해상도인 전통적인 비교유전자보합법(CGH)은 초현미경적인 변화의 정밀한 확인을 위해서는 충분히 높지 않다(12).

게노믹 용량 변화가 암 관련 유전자들의 변화된 발현정도에 의하여 암 발생에 기여한다는 것을 축적된 증거들이 제안하고 있으므로(13, 14), 충분한 해상도를 갖는 보다 상세한 분석이 요구된다.

게놈-와이드 어레이 CGH를 폐암 조직으로부터 추출된 DNA에 적용하여, 폐암에 특이한 유전 변이들을 확인하여 이러한 변이를 폐암 및 폐암의 하부유현 진단, 스크리닝과 폐암의 진행에 대한 예후적 표지자로 사용하는 것이다.

본 발명은 암 및 종양발생과 관련된 핵산의 새로운 부분의 게놈 지도작성 및 동정에 관련된다.

본 발명은 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 획득이 관찰되는 것을 특징으로 하는 폐암을 진단을 위한 인간의 염색체 10번 p암 부분 및 염색체 16번의 q암 부분; 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 결실이 관찰되는 것을 특징으로 하는 폐암을 진단을 위한 인간의 염색체 13번의 q암 부분; 및 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 MAR-G 유전자 변이가 관찰되는 것을 특징으로 하는 폐암을 진단을 위한 인간의 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분을 제공한다.

본 발명은 상기 염색체 부분을 포함하는 폐암진단 키트를 제공한다. 상기 진단키트는 DNA 칩일 수 있다.

본 발명은 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 결실되는 것이 관찰되는, 폐암의 하부유형인 편평세포암종(squamous cell carcinomas)을 진단하기 위한 염색체 3번 p암부분 및 Y 염색체 부분; 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 획득되는 것이 관찰되는, 폐암의 하부유형인 편평세포암종(squamous cell carcinomas)을 진단하기 위한 염색체 12번 부분; 및 인간의 전체 게놈중 CGH를 통해 획득되는 것이 관찰되는, 폐암의 하부유형인 선암종(adenocarcinomas)을 진단하기 위한 염색체 6번 q암 부분을 제공한다.

본 발명은 상기 염색체 부분을 포함하는 폐암 하부유형 진단 키트를 제공한다. 상기 진단키트는 DNA 칩일 수 있다.

발명의 또 다른 태양으로서, 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분를 포함하는 핵산서열의 전부 또는 일부를 증폭할 수 있는 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 프라이머 쌍을 포함한다. 상기 검출 시스템은 중합효소 연쇄반응이 일어나는 지를 검출하는 것을 포함한다. PCR 프라이머 쌍은 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분에서 선택되어질 수 있다.

본 발명은 사람의 핵산의 시료에서 앰플리콘(amplicon)의 존재를 스크리닝하기 위한 신규의 방법을 제공한다. 상기 방법의 첫 번째 단계는 인간의 세포로부터 얻어진 핵산의 시료 및 프로브를 제공한다. 두 번째 단계는 인간의 핵산을 상기 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 여기에서 상기 프로브는, 엄격한 조건(stringent condition)으로 인간의 핵산서열과 선택적으로 결합하여 교잡 복합체를 형성하는 조건에서, 인간의 게놈 핵산과 접촉한다. 세 번째 단계로 교잡복합체의 형성을 검출하는 것이다. 하나의 실시예로서 상기 인간의 핵산은 게놈 DNA일 수 있으며, 이것은 폐암세포로부터 분리되어질 수 있다. 검출 단계는 앰플리콘의 복제수를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 상기 프로브는 단단한 표면에 부착되어질 수 있으며, 상기 단단히 부착된 프로브는 핵산 어레이의 한 구성원일 수 있다. 인간의 핵산 서열은 검출가능한 물질로 레이블되어질 수 있고, 상기 검출가능한 성분은 플루레세린(fluorescein) 또는 텍사스 레드(Texas red)일 수 있다. 다른 방법으로 프로브가 검출가능한 성분으로 레이블 되어질 수 있다. 본 발명에 따른 상기 방법은 참조세포(reference cell)로부터의 핵산이 얻어지고, 상기 프로브가 인간의 게놈 핵산과 접촉하기 전 또는 동시에 상기 프로브와 상기 참조세포 핵산과 접촉되도록 하는 방법을 제공한다. 더욱더 본 발명에 따른 상기 방법은 인간 지놈 핵산과 상기 프로브와 인간 게놈 핵산이 접촉되어지기 전에 코트-원(Cot-1) DNA가 인간 게놈 DNA에 결합하는 방법을 제공한다.

본 발명은 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분까지의 공간에 내재하는 서열에 특이적으로 결합하는 핵산을 포함하는, 인간 게놈 핵산의 시료안에서 앰플리콘의 존재 유무를 탐색하기 위한 핵산 프로브를 제공한다.

본 발명의 또다른 태양은 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분까지의 공간에 내재하는 서열에 특이적으로 결합하는 핵산을 포함하는, 인간 게놈 핵산의 시료안에서 앰플리콘의 존재 유무를 탐색하기 위한 핵산 프로브를 제공한다.

본 발명의 또다른 태양은 상기 프로브가인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분를 포함하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 제공한다.

본 발명은 인간 핵산 시료에서 앰플리콘의 존재유무를 탐색하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 프로브를 포함하는 부속공간을 포함하며, 상기 프로브는 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분을 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 교잡하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양은 인간 핵산 시료에서 앰플리콘의 존재유무를 탐색하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 프로브를 포함하는 부속공간을 가지며, 상기 프로브 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분대해 상보적인 서열들를 포함하는 핵산 서열에 특이적으로 교잡하는 핵산 서열을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 인간 핵산 시료에서 앰플리콘의 존재유무를 탐색하기 위한 키트에 있어서, 상기 장치의 프로브가 인간의 염색체 10번 p암 부분, 염색체 16번의 q암 부분, 염색체 13번의 q암 부분, 염색체 6번의 p21 부분 및 인간의 염색체 19번의 q31 부분으로 이루어진 그룹에서 선택되는 염색체 부분의 핵산 서열의 일부 또는 전부를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치를 제공한다. 상기 프로브는 클론된 인간의 핵산 서열일 수 있으며, 상기 클론된 인간의 핵산 서열은 고체 표면에 접착되어질 수 있다. 상기 장치는 더욱더 세포내에서 2배의 앰플리콘 복제수보다 많은 관찰은 암 또는 종양의 진단 또는 예후인 것을 알려주는 지시적인 물체를 포함한다.

본 발명은 전체 게놈 중 유전자 변이를 스크리닝하는 방법을 사용하여 폐암 및 폐암의 하부유형을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 유전자 변이를 스크리닝 하는 방법에 관하여, 어레이 CGH를 사용한다.

보다 구체적으로는 1Mb 의 해상도를 갖는 어레이 CGH를 폐암에 적용한다. 이 때에 암 및 정상조직으로부터 추출된 DNA를 게노믹 증폭 없이 직접 사용한 후, 반복적인 유전 변이를 통계학적으로 분석하여 그 결과를 폐암 및 폐암의 하부유형 진단에 이용한다. 어레이 CGH의 방법 및 유전변이의 통계학적 분석 방법은 실시예에 구체적으로 기재되어 있다.

유전자 변이에 의한 폐암 하부유형에 의한 구체적 진단에 있어서, 비소세포성 폐암의 두 하부 유형인 SqCs 및 AdCs 는 그들의 위치, 성장 유형 또는 예후에 따라서 다르게 행동하는 것으로 알려져 있다.본 발명에서는 비소세포성 폐암의 두 하부 유형간의 염색체 이상의 비교로서 각 하부 유형에 특이한 게노믹 불균형의 숫자가 확인된다. 즉 3p 및 Y의 결실 뿐만 아니라 3q 및 12p의 획득은 SqCs에 특이적인 반면, 6p의 획득은 AdCs에 특이적이다. 따라서 본 발명에서 확인된 특이한 게노믹 변이를 이용하여 비소세포성 폐암의 하부유형을 정확하게 진단한다.

본 발명은 또한 폐암에 특이한 유전 변이를 폐암 진행의 예후적 표지자로 사용하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명의 게놈 변이를 배열함으로써, 다양한 게놈 크기의 17개의 MAR가 특징 지워진다. 5q 및 20q 상의 MAR-L 과 함께 1p, 2p, 6p, 8p, 19p 및 20p 상의 9개의 MAR-G는 폐암에서의 독특한 양상으로 판단되고 폐암의 정확한 진단에 사용될 수 있다. 또한 비소세포성 폐암의 암 발생에 있어서 그들의 가능한 협력적 역할을 암시하는 3쌍의 MAR 간의 유의한 상관관계가 확인된다. 이러한 게노믹 변이 중에서, 1p32.3 상의 MAR-G 및 13q21.1 상의 MAR-L은 임상적 양상들과 유의한 상관관계를 보인다(표 5). 예를 들어, 13q21.1 상의 MAR-L은 초기발병 (60세 이하) 및 후기단계(III단계 및 IV 단계)와 상관관계가 있는데, 이것은 이러한 변화가 암 진행의 후기 단계에서 획득된 것이라는 것을 제안한다. 1p32.3 상의 MAR-G 은 임파 결절 음성 케이스와의 연관을 보이며, 이것은 폐암의 전이에 대한 그것의 의의를 보여준다. 따라서 이러한 인자들을 이용하여 폐암의 진행상황에 대한 예후적 표지자로 상기의 변이를 이용할 수 있다.

본 출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "앰플리콘(amplicon)"이라는 용어는 변화된 복제수로 존재하면 암과 관련되어진 게놈 핵산의 지역을 말한다. 예를 들어서 본 발명은

본 출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "비소세포성 폐암(NSCLC)"라는 용어는 원발성 폐암중 소세포성 폐암을 제외한 페암을 의미한다. 구체적으로는

원발성 폐암은 SqCs, 선암(adenocarcinomas, AdCs;이하 AdCs라 한다), 큰 세포 폐암과 소세포성 폐암과 같이 크게 4개의 하부유형으로 구분되는 데 그 중 소세포성 폐암을 제외한 전반부의 세 유형은 폐암 전체 발생의 거의 80%를 차지하는데 이를 비소세포성 폐암이라고 한다.

본 출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "SqCs"라는 용어는 원발성 폐암의 하부 유형으로서 비늘모양 세포 악성종양(squamous cell carcinomas, SqCs; 이하 SqCs이라한다)을 의미하며 비소세포성 폐암의 두 중요한 하부 유형중 하나이다.

본 출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "AdCs"라는 용어는 원발성 폐암의 하부 유형으로서 선암(adenocarcinomas, AdCs;이하 AdCs라 한다)을 의미하며 비소세포성 폐암의 두 중요한 하부유형중 하나이다.

본 출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "어레이 CGH" 라는 용어는 지도가 만들어진 박테리아 또는 P1 인공염색체(BAC/PAC)를 사용하는 어레이 비교유전자보합법(array comparative genomic hybridization, array CGH; 이하 어레이 CGH라 한다)을 의미한다.

출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "MAR"라는 용어는 반복 변이된 최소염색체 지역(minimally altered region, MAR, 이하 MAR 이라한다)을 의미한다. 구체적으로는 본 발명에서의 게노믹 변이 중 단일 카피 숫자변화가 본 발명에서 분석된 케이스들에서 널리 분포 하는데 상기의 변화들 중 높게 반복되는 것들을 선별하기 위하여 7개의 케이스들에 대하여 빈번하게 바뀌는 단편반복을 MAR로 정의하였다.

출원의 명세서 및 청구항에 기재된 "MAR-G 및 MAR-L"이라는 용어는 각각 MAR의 염색체 획득(MAR-Gain) 및 결손(MAR-Loss)을 의미한다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있도록 실시예를 들어 설명한다. 그러나 다음의 실시예로써 본 발명의 취지를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1>

(1) 재료 및 방법

실험의 재료

단국대학병원(천안, 한국)에서 외과수술을 받은, 비소세포성 폐암을 갖는 50명의 환자들로부터 동결조직을 획득하였다. 조직 수집 및 유전분석의 모든 과정은 강남성모병원(카톨릭 대학교, 한국) 연구심의위원회의 승인 아래 진행하였다.

50 비소세포성폐암 케이스는 조직학적으로 SqCs (29 케이스) 및 AdCs (21 케이스)로 분류되었고 암의 진행단계는 암 가이드라인 미국 연합 위원회의 표준 TNM 분류에 따라 수행하였다(첨부 데이터 1 참조).

SqCs 및 AdCs 의 두 조직학적 하부 유형을 수술 후 이어지는 컴퓨터 단층촬영(CT)에 의하여 성, 나이, 암의 크기, 결절 상태 및 병의 재발 같은 일반적 특성에 대하여 비교하였다. 피어슨의 χ테스트 및 독립 t-테스트를 사용하였을 때, 성별(p=0.029)을 제외하고 비소세포성폐암의 두 하부 유형간의 중요한 차이점은 발견되지 않았다.

조직 준비 및 미세절개

동결 박편을 2800 프리고컷(2800 FRIGOCUT, Reighert-Jung, Germany)을 사용하여 젤라틴이 코팅된 슬라이드 위에 10μm 두께로 준비하였다. 상기 박편을 100% 에탄올에 고정하고 H&E 염색 전에 탈수하였다. H&E 염색 후에, 짝지어진 암 조직 부분(암세포 60%이상) 및 정상 조직 부분을 동일한 환자로부터 현미경적으로 선별하였고 손으로 절개하였다. 미세 절개된 조직들을 세포 용해 버퍼(TE 버퍼 내의 1% 프로티나제-K)에 옮겼고 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 DNA 정화 키트(솔젠트, 한국)를 사용하여 정화하고 염색 라벨링 반응을 위하여 사용하였다.

어레이 CGH(Comparative genomic hybridization, CGH) 및 이미지 분석

큰 삽입 클론의 구축 및 보합은 피에글러 등[Fiegler et al(19)]에 의해 묘사된 방법으로 몇몇의 변경을 가하여 수행하였다. 인간 큰 삽입 클론 어레이를 1Mb 해상도로, 생어 인스터튜트 마이크로어레이 장치(the Sanger Institute Microarray Facility)에 의해 프린트된 전체 게놈에 걸쳐서 사용하였다. 각 염색체에 대한 사용되어진 1Mb 클론 번호(Clone ID)를 표 1에 나타내었다. 각각 클론 번호에 서열 및 관련정보는 URL:http://www.ensemble.org/index.html에서 확인할 수 있다.

[표 1] 마이크로 어레이를 위해 사용되어진 각 염색체의 클론 번호

각각의 암 DNA 600 ng을 Cy3-dCTP로 표지하고 정상 폐 조직으로부터의 대조군 DNA의 같은 양을 무작위 프라이밍(BioPrime Array CGH Genomic Labeling System, Invitrogen, USA)에 의하여 Cy5-dCTP로 표지하였다. 37°C에서 4시간동안 배양한 후에, 표지된 게노믹 DNA를 상기 키트에 포함된 DNA 정화 칼럼을 사용하여 정화하였다.

칼럼을 통과하여 유출된 DNA를 140 μg 의 인간 Cot-1 DNA (Roche, Germany)를 사용하여 침전시켰다. DNA 펠렛을 600 μg 의 효모 t-RNA를 함유한 50 μl의 보합 버퍼 (50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% Tween 20, 2X SSC, 및 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)에 용해시켰다. 72℃에서 10분간 변성(denaturation) 후,

전-보합된 BAC 어레이 슬라이드에 적용하기 전에 프로브 DNA를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

BAC 어레이 슬라이드는 540 μg 의 청어 정자 DNA 및 90 μg 의 인간 Cot-1 DNA를 함유한 90 μl 의 보합 버퍼에서 37℃에서 2시간동안 전-보합 처리하였다. 전-보합 및 보합 처리는 기존에 묘사된 방법으로 수행하였다(19).

간단히 설명하면, 고무 시멘트 링을 어레이 가장자리에 반응 공간을 만들기 위하여 설치하였다. 프로브 용액을 상기 어레이 위에 주입한 후에, 상기 슬라이드를 진동기위의 햇빛이 차단된 습한 챔버(chamber)에서 37℃에서 2일 동안 배양하였다.

슬라이드를 용액 1 (2X SSC, 0.1% SDS) 으로 37℃에서 10분 동안, 용액 2(0.1X SSC, 0.1% SDS)로 상온에서 10분 동안, 용액 3(0.1X SSC)으로 상온에서 1분 동안 세 번, 그리고 증류수로 상온에서 10초 동안 한번 차례대로 세척하였다. 최종적으로 슬라이드를 1000 rpm에서 3분 동안 회전 건조하였다. 어레이들은 진픽스 4100A 스캐너(GenePix 4100A scanner, Axon Instruments, USA)를 사용하여 스캔하였고 이미지들을 진픽스 프로 6.0(GenePix Pro 6.0)을 사용하여 가공하였다.

데이터 가공, 표준화 및 BAC 클론의 맵핑(Mapping)

미가공된 어레이 CGH 데이터의 표준화 및 재배열은 웹에 기반한 어레이 CGH 분석 인터페이스, ArrayCyGHt(http://genomics.catholic.ac.kr/arrayCGH/)를 사용하여 수행하였다(20). 간단히 설명하면, 모든 개별적인 데이터 포인트의 미가공된 신호 강도 및 관련된 염색체 맵핑 정보를 ArrayCyGHt 에 업로드 하였고 프린트-팁 로에스 방법(Print-tip Loess method)으로 표준화 하였다.

로그2 스케일의 표준화된 형광 강도 비율은 선형의 염색체 순서에 따라서 자동적으로 재배열되었다.

큰 삽입 클론의 맵핑은 UCSC 게놈 브라우져( 2004년 5월 동결)에서의 게노믹 위치에 따라서 수행하였다. 전체적으로, 초기 3014 클론 중 2987 BAC 클론은 UCSC 게놈 브라우져 및 생어 인스터튜트 게놈 브라우져 상 둘 다에서 성공적으로 지도화되었고 그 뒤에 가공되었다.

본 발명에서의 세포유전학적 밴드 또는 유전자 위치 같은 모든 게노믹 좌표들은 UCSC 게놈 브라우져에서의 동일한 버전 인간 게놈에 기초를 두고 있다.

염색체 변이에 대한 데이터 분석

개별적인 큰 삽입 클론의 염색체 변이에 대한 절단 값(cutoff value )을 정하기 위하여 대조구로서 4번의 독립적인 일련의 표준 보합[3번의 성별 및 한번의 남성 대 여성 보합]을 수행하였다.

대조구 일군의 평균 표준편차(SD) 값은 0.081이었고, 따라서 이상 카피 숫자 변화에 대한 절단값은 대조구 표준편차보다 2배 높은, 로그2 스케일에서 ± 0.2로 맞추어 졌다. 전체 염색체 팔 획득 또는 결실은 기존에 기재된 방법대로 결정하였다(21).지역적인 카피 숫자 변화는 염색체의 부분에 제한된 DNA 카피 숫자 변이로 정의되었다. 클론들의 높은 수준의 증폭은 그들의 강도 비율이 로그2 스케일에서 1.0보다 높을 때로 정의되었고, 동형접합(homozygous) 결실에서도 마찬가지이다. 카피 숫자 변화의 경계는 두 이웃하는 클론간의 중간으로 할당하였다.

반복 변이된 최소염색체 지역의 한정

염색체 획득 또는 결실의 반복 변이된 최소염색체 지역을 한정하기 위하여, 미가공된 강도 비율을 매끄럽게 하고 염색체 변이의 구획점을 확인하는 CGH-Miner (http://www-stat.stanford.edu/~wp57/CGH-Miner/)를 사용하였다.

4번의 연속된 표준 보합은 대조구로서 결합시켰고 본 발명의 분석은 추천된 프로그램 파라미터로 수행하였다.

본 프로그램에 의해 보고된 중요한 획득 또는 결실은 다음의 배열 과정을 위하여 직접적으로 이용되었다. 염색체의 획득 및 결실의 반복 변이된 최소염색체 지역은 적어도 7개의 샘플에서 변이된 부분 반복에 의하여 결정하였다.

통계분석

SqCs 및 AdCs간의 염색체팔 변화에 있어서 차이점의 유의성은 피셔의 양측 정확검정 (two-sided Fisher's exact test)에 의하여 검정하였다. 반복 변이된 최소염색체 지역에서의 본 발명의 반복되는 유전적 변화간의 상관관계는 단일변량 이원 피어슨의 상관관계(univariate pair-wise Pearson's correlation)를 사용하여 평가하였다.

다중 비교 때문에, 스텝다운 시닥 방법(stepdown Sidak method)이 본 발명의 전체 수준의 유의성을 조정하기 위하여 사용되었다. 이 경우에 있어서, 동일한 염색체팔 상의 유전적 변화의 쌍은 부합성 분석을 위하여 제거하였다. 유전적 변이 및 임상병리학적 파라미터간의 상관관계는 피셔의 양측정확검정(two-sided Fisher's exact test)을 사용하여 분석하였다. 이러한 목적을 위하여, 염색체 팔의 변화 뿐 만아니라 반복 변이된 최소염색체 지역상의 변화도 상기 분석에 포함시켰다.

본 발명의 비교를 위하여, 4종류의 임상병리학적 파라미터는 조기발병(60세 이전에 진단) 대 만발성(60세 이상), 초기단계(I 단계 및 II 단계) 대 후기단계( III 단계 및 IV 단계), 임파 결절 음성 대 양성, 및 병 재발의 존재 대 부존재 같은 범주형 변수(categorical variables)로 취급하였다.

카플란-마이어 방법(Kaplan-Meier method)을 생존분석을 위하여 사용하였고, 생존 곡선들 간의 차이는 단일변량 모델(univariate model)에서 로그순위검정을 사용하여 비교하였다. 본 발명의 변수들 간의 유의한 인자들은 콕스의 비례 위험 모형(Cox proportional hazard model)을 사용한 다변량 분석에서 더 평가되었다.

모든 통계적 분석들에서 0.05보다 작은 p 값은 유의한 것으로 간주하였다.

(2) 결과

비소세포성 폐암에서 게노믹 변이의 종합적인 프로파일링

비소세포성 폐암 50 케이스(29 SqCs 및 21 AdCs)에서 관찰된 전체 게노믹 변이는 도 1A에 나타나있다. 본 발명의 50 비세포성 폐암의 어레이-CGH 신호 강도 비율(로그2 스케일) 데이터는 하기한 웹 사이트에서 다운로드 할 수 있다(http://lib.cuk.ac.kr/micro/CGH/lung.htm)

게노믹 변이는 오직 작은 숫자의 클론이 관련된 지역적이거나 전체 염색체 팔을 포함하는 광범위한 부분이다. 게노믹 변이의 상당한 양을 대부분의 비소세포성 폐암 케이스에서 관찰하였다.

샘플당 획득하거나 결실한 클론의 평균 숫자는 각각 415.8 (13.9%) 및 364.8 (12.2%)이었고, 상대적으로 이것은 적어도 본 발명의 비소세포성 폐암 케이스에서 게노믹 획득이 게노믹 결실을 조금 초과한 것을 보여준다.

비록 게놈-와이드 염색체 프로파일이 본 발명의 비소세포성 폐암 케이스가 유전적 이상의 위치 및 범위의 면에서 이질적이라는 것을 보여주기는 하지만, 염색체 획득 및 결실의 빈도 도표들은 염색체 변화가 무작위하게 분포되지 않는다는 것을 보여준다. 사실, 그들의 많은 수는 본 발명의 50개의 비소세포성 폐암 케이스 전체에 걸쳐서 여러 부분들에서 밀집하여 나타난다(도 1B).

본 발명의 개별적인 염색체 수준에서 반복되는 게노믹 변화를 확인하기 위하여, 우리는 먼저 본 발명의 50개의 비소세포성 폐암 샘플들에서 빈번하게 관찰되는 전체 염색체 팔의 변화들을 먼저 조사하였다.

8개의 염색체 팔 즉, 19q (본 발명의 50개의 비소세포성 폐암 케이스의 40%), 20q (26%), 22q (24%), 3q (22%), 19p (22%), 1q (20%), 5p (20%) 및 17q (20%)는 빈번하게 획득하였다(표 2). 유사하게, 6개의 염색체 팔 즉, Yp (52%), Yq (46%), 9p (42%), 3p (26%), 17p (24%) 및 4q (20%)는 빈번하게 결실하였다. 이러한 염색체 변이의 몇몇은 SqCs 및 AdCs에서 다르게 분포하였다.

이상이 있는 클론들의 평균 숫자는 SqCs의 경우 437.7 (14.7%; 획득) 및 405.0 (13.6%; 결실) 이었고, 반면에 AdCs는 85.6 (12.9%; 획득) 및 309.2 (10.4%; 결실)로 적은 빈도의 카피 숫자 변이를 보였으나, 그 차이는 중요하지 않았다.

두 하부 유형간의 특이한 염색체 변화들을 확인하기 위하여 통계적 분석을 수행하였다.

결과로서 6개의 염색체 변화가 SqCs 및 AdCs간에 특이하게 분포된다는 것을 발견하였다; 다시 말하면 3q, 6p 및 12p의 획득에 따른 3p, Yp 및 Yq 의 결실(표 2)

3p, Yp 및 Yq 의 결실 뿐 만 아니라 3q 및 12p의 획득이 SqCs에 특이적인 반면, 6p의 획득은 AdCs에 특이적이다.

높은 수준 증폭 및 동질접합 결실(Homozygous Deletion)

전체적으로 98개의 큰 삽입 클론이 적어도 한 케이스에서 높은 수준 증폭을 보였고 그 증폭은 36개의 다양한 게노믹 절편에서 밀집되어 있었다.

본 발명의 확인된 앰플리콘은 표 3에 요약되어 있다. 앰플리콘들의 게노믹 크기는 로그2 스케일에서 최대 강도 비율 2.56으로서 0.31부터 14.78 Mb 까지의 범위이다. 비록 대부분의 앰플리콘들은 작았으나, 5 Mb 보다 큰 앰플리콘들도 1q, 3q, 7p 및 19q에서 관찰하였다. 그들 중 하나는 6.8 Mb 크기로서 높은 카피 숫자 획득의 좋은 예이다(도 2A). 폐암의 잠재적 종양 표지자인 CTSS 뿐만 아니라 추정적 암유전자 AF1Q 및 TPM3 가 상기의 앰플리콘에 위치하고 있다.

작은 앰플리콘들은 보통 높은 수준 증폭과 함께 클론의 작은 숫자에 의하여 잘 한정되었다. 예를 들어, 강도 비율 2.49(로그2)의 높은 카피 숫자 변화를 17q에서 관찰하였다(도 2B). 세 개의 인접한 클론들로 구성된, 이 1Mb 크기의 앰플리콘은 추정적 암유전자 MLLT6을 포함하고 있다.

다양한 염색체들을 아우르는 다른 높게 증폭된 지역들은 표 3에 나열된 추정적 암 관련 유전자들을 포함한다. 상기 앰플리콘들의 대부분(30/36 케이스들 83.3%)은 하나 또는 둘의 비소세포성 폐암 케이스에서 관찰하였다.

예외적으로 두개의 큰 앰플리콘들이 있었는데, 하나는 8개의 SqCs 케이스들에서 3q26에 있었고 다른 하나는 6개의 SqCs 케이스들에서 q27-q29에 있었다. 도 2C는 3q26 (SqCs22) 및 i3q27-q29 (SqCs9)에 있어서의 가장 큰 앰플리콘들을 나타내고 있다. 첫 번째 것은 크기가 14.78 Mb로서 EVI1, SKIL, ECT2, 및 PIK3CA 같은 여럿의 추정적 암유전자를 숨기고 있다. 10.31Mb 크기인 다른 하나는 추정적 암유전자 BCL6 및 HES를 포함하고 있다.

본 발명의 총 50개의 비소세포성 폐암 케이스들에서, 오직 3개의 동형접합 결실을 확인하였다(표 3). 그중에서, RP11-765C10 (10q23.31)의 동형접합 결실은 암 억제 유전자 PTEN을 숨기고 있다(도 2D).

반복 변이된 최소염색체 지역 획득 및 결실

비록 높은 카피 숫자 변화들은 상대적으로 적지만, 단일 카피 숫자 변화는 본 발명에서 분석된 케이스들에 널리 분포하였다. 상기의 변화들 중 높게 반복되는 것들을 선별하기 위하여, 반복 변이된 최소염색체 지역(minimally altered region, MAR, 이하 MAR 이라한다)은 적어도 7개의 케이스들에 대하여 빈번하게 바뀌는 단편 반복으로 정의하였다.

MAR-G 및 MAR-L은 각각 MAR의 염색체 획득 및 결실을 나타낸다. 전체적으로 우리는 13개의 MAR-G 및 4개의 MAR-L을 확인하였다(표 4).

MAR-G 및 MAR-L의 예들은 도 3에 나타나있다. 12 케이스가 관찰된 1p36-p34 상의 MAR-G는 PAX7, FGR, LCK, 및 MYCL1 같은 추정적 암 관련유전자들을 여럿 포함하고 있다. 또한, 9개의 케이스에서 1p32.3 상의 다른 MAR-G는 추정적 암 관련 유전자인 TTC4를 포함하고 있다(도 3A).

7개의 샘플에서 5q 상의 MAR-L은 IRF1, CDKL1 및 RAD50 같은 여럿의 추정적 암 억제 유전자를 포함하고 있다.

반복 변이된 최소염색체 지역들(MAR)간의 상관관계

이러한 게노믹 변화들이 비소세포성 폐암 케이스들의 세트에서 일치하여 나타나는지 보기 위하여 MAR 사이의 쌍별 상관관계 분석(pairwise correlation analysis)을 수행하였다.

본 발명의 비교를 위하여, 동일한 염색체팔 위의 쌍을 제외한 17개의 MAR간의 모든 가능한 조합을 고려하였다. 유의적으로 긍정적인 관계가 MAR의 3쌍에서 관찰되었다(첨부 데이터 2 참조). 19q13.1 상의 MAR-G는 각각 6p21.3-p21.1 (r=0.549, p=0.0482) 및 19p13.2-p13.1 (r=0.672, p=0.0016) 상의 MAR-G와 관련되는 것으로 발견되었다. 다른 유의한 관련이 8p12.2-p12.1 및 8q11.2-12.1 (r=0.610, p=0.0370) 상의 두 MAR-G 간에 발견되었다.

게노믹 이상 및 임상병리학적 특징 사이의 관련

4종류의 임상병리학적 변수들(나이, 암의 단계, 임파 결절 및 재발)을 본 발명의 확인된 모든 게노믹 변이와의 관련을 알아보기 위하여 분석하였다(표 5).

유의한 관련성이 초기 발병(60 세 이하 발병; p=0.0345) 및 후기 단계(III 단계 및 IV 단계:p=0.0451)와 관련하여 13q21 상의 MAR-L에 대하여 관찰되었다.

본 발명의 염색체 팔 Xq의 획득은 후기단계(p= 0.0461) 및 병 재발(p=0.0210)과 또한 유의적으로 관련되는 것으로 발견되었다. 1p32상의 MAR-G 및 Yp의 염색체 획득 또한 임파 결절 음성(각각 p=0.00454 및 p=0.03468)과 유의적으로 관련되었다.

확인된 유전자 이상의 예후적 효과들을 평가하기 위하여 생존분석을 수행하였다. 카플란-마이어 방법을 사용해서, 상대적으로 나쁜예후와 유의적으로 관련된 6개의 유전적 이상을 확인하였다(도 4); 10p(p=0.0091; 6%) 및 16q (p=0.0262; 6%)의 염색체 획득, 9p (p=0.0082; 42%) 및 13q (p=0.0019; 18%)의 염색체 결실, 6p21 및 19q13 (각각 p=0.0265 및 0.0295) 상의 MAR-Gs.

다변량 분석에서, 오직 세 인자가 나쁜예후 남성[위험률 (HR) =16.67, 95% 신뢰 구간(CI) = 1.12-131.32, p=0.0075], 6p21상의 MAR-G (HR = 4.376, 95% CI = 1.55-12.35, p=0.0053) 및 9p의 염색체 결실 (HR = 3.851, 95% CI = 1.17-8.65, p=0.0011)과 유의하게 관련되어 있었다.

표 2. 비소세포성 폐암에서 염색체 변화의 빈도

주 : 비소세포성 폐암 50 케이스의 전체에 걸쳐 상응하는 염색체 팔들의 전체 변화의 빈도(%)는 괄호안의 29 SqCs 및 21 AdCs의 빈도와 함께 각각 나타나 있다. SqCs 및 AdCs 간의 빈도 차이는 피셔의 양측 정확검정에 의하여 통계학적으로 분석하였고 유의 했을 때(p<0.05) 회색으로 칸을 표시하였다. *, p-값은 유의하였을 경우에만 표시하였다.

표 3. 비소세포성 폐암에서 높은 카피 숫자 변화를 나타내는 게노믹 단편

주: 각각의 높은 카피 숫자 변화의 경계는 상응하는 인서트 클론에 의해 한정된다. 세포유전학적 밴드 및 클론들의 위치는 공공 게놈 데이터베이스(UCSC 게놈 2004년 5월 동결)에 기초하고 있다. ^a Amp, 증폭; HD, 동협접합 결실. ^b 둘 이상의 관찰된 케이스에 있어서, 높은 카피 숫자 변화의 경계는 클론들의 가장 확장된 세트로 한정되었고, 따라서 그들은 반드시 겹칠 필요는 없다.

표 4. DNA 카피 숫자 변화의 미세한 지역

주: 첫 번째 세로행 에서의 획득 및 결실은 각각 MAR-G 및 MAR-L을 나타낸다. ^*빈도는 비소세포성 폐암 하부 유형의 두 종류에서 상응하는 게놈 변화에 대한 샘플들의 숫자를 나타낸다.

표 5. 게노믹 변화 및 임상병리학적 양상 사이의 상관관계

(2) 결과해석

비소세포성 폐암에서 복잡한 게노믹 이상의 종합적인 분석을 위하여 고해상도 어레이 CGH를 29 SqCs 및 21 AdCs에 적용하였다. 비종양세포를 제거하기 위하여 미세절개를 하였고 대조구로서 짝을 이룬 정상 조직을 사용하여 비소세포성폐암에 특이적인 높게 반복되는 또는 독특한 게노믹 이상을 발견하였다.

미세절개된 DNA를 전체 게놈 증폭을 하지 않고 어레이들과 보합하였고, 이것은 무작위 증폭의 가능한 편향을 피할 수 있게 하였다.

본 발명에서 확인된 빈번하게 획득하거나 결실한 염색체 변화는 남성 환자들에서 Y 염색체의 결실(5,6)을 포함하여 기존의 결과들(7-11)과 일치한다.

19, 20 및 22 같은 작은 염색체 상의 카피 숫자 변화는 우리의 결과에서 훨신 더 빈번하였다. 이것은 아마도 연구들간에 사용된 분석 방법에 있어서의 차이에 기인할 수도 있다. 그러나 이것은 최근의 연구에 기재된 것처럼 전통적인 CGH의 낮은 해상도를 개선하기 위한 어레이 CGH 의 잠재력을 반영한다고 보는 것이 더 타당할 것이다. 게다가, 비소세포성 폐암의 두 하부 유형간의 염색체 이상의 비교로서 각 하부 유형에 특이한 게노믹 불균형의 숫자를 확인하였다; 3p 및 Y의 결실 뿐만 아니라 3q 및 12p의 획득은 SqCs에 특이적인 반면, 6p의 획득은 AdCs에 특이적이다. SqCs 및 AdCs 는 그들의 위치, 성장 유형 또는 예후에 따라서 다르게 행동하는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명에서 확인된 특이한 게노믹 변경은 하부유형에 특이한 병 발생을 명백하게 하는데 유용할 것이다(9, 24).

본 발명에서의 개별적인 비소세포성 폐암 케이스의 게노믹 프로파일들은 다른 고형 암들에서의 전형적인 게노믹 변화들과는 이질적으로 보일 것이다.

우리는 카피 숫자 획득 또는 결실의 반복적인 변화 뿐 만 아니라 높은 수준 증폭 또는 동형접합 결실 같은, 폐암에서 그럴듯한 생물학적 암시처럼 보이는 게노믹 변화에 초점을 맞추었다.

비록 게놈 용량 변화가 상응하는 유전자들의 발현 수준과 일관되게 연관 되는지에 대하여는 논란이 있으나, 용량 변화 및 발현 수준간의 일치가 동물 삼체성 모델(28)을 포함한 최근의 연구에서 관찰되었다(26, 27). 따라서 이러한 게놈 변화가 결정적인 암 관련 유전자들의 발현 프로파일을 변화시킴으로써 암의 병 발생에 기여할 것이라는 가정이 이유가 있다.

높은 카피 숫자 변화에 의한 본 발명의 게놈 크기는 0.31부터 14.78 Mb 까지의 범위이며, 대부분은 5Mb 크기보다 작았다. 5Mb 보다 작은 게놈 변화는 전통적인 CGH에 연구(12)에 의해 탐지되지 않는 신규한 것으로 생각된다. 3q 상의 증폭은 본 발명에서 가장 흔한 높은 카피 변화였다.

기존의 연구에서, 이러한 변화의 역할은 침윤성 암종 (29)의 병 발생에 관계되었고 이 지역에 있는 유전자, 포스포이노시티드-3-OH 키나제(PI-3K) 신호전달 경로에 관련된 PIK3CA, 의 활성화는 SqCs의 암 발생에 기여할 것이다. 우리는 PIK3CA를 숨기고 있는 3q26 주위의 앰플리콘들을 확인하였다.

흥미롭게도 PI-3K 신호전달 또한 관련된 PIK3CG를 포함하는 7q22 상의 높은 수준 증폭이 한 SqCs 케이스 (SqCs25)에서 관찰되었다. 상기 유전자는 추정적인 암 억제 유전자로 전에 제안되었지만(30), 활성화된 형태의 PIK3CG는 악성종양의 발달에 기여할 것으로 최근의 증거는 표시하고 있다.

3q의 증폭을 제외하고, 대부분의 높은 수준 증폭들은 하나 또는 두개의 케이스에서 관찰되었다. 그것들은 본 발명의 각각의 비소세포성 폐암 케이스에 대한 게놈 진화의 개별적인 성질을 반영할 것이다. 높은 수준 발현 및 폐암의 임상적 성과 간의 상관관계를 보여주는 PTPRF (32), NUDT1 (33) 및 TYMS (34) 같은 유전자들 뿐 만 아니라 REL, EGFR, MLL, DDX6, YES1, JUND, 및 HKR1 같은 원형 종양유전자들이 본 발명에서 확인된 앰플리콘들에 위치한다. 진단 또는 치료를 위한 분자적 타깃으로서의 이러한 유전자들에 대한 임상적 의의가 제안되어왔지만 그들은 미래의 연구에서 확인되어질 필요가 있다.

하나의 SqCs 케이스에서 관찰된 10q23.31 상의 동형접합 결실은 잘 알려진 암 억제유전자 PTEN을 포함하고 있다. 이것은 프로틴 키나제 B/Akt 같은, PI-3K 경로에서 활성화되는 신호전달 단백질들을 음성적으로 통제하는 리피드 포스파타제를 코드하는 것으로 알려져 있다. 이러한 데이터는 비소세포성 폐암 병 발생에 있어서 PI-3K 신호전달 경로의 잠재적인 역할을 암시한다. 최근의 연구들은 PTEN의 비활성화가 부분적으로 메틸화변화에 기인한다는 것을 제안하는데, 이것은 다른 샘플들에서 이 유전자 자리의 반복적인 결실의 부족을 설명할 수 있을 것이다.

명백하게도 반복 변이된 최소염색체 지역들에 한정된 반복적인 획득 및 결실은 본 발명에서 고해상도 어레이 CGH를 사용하여 성공적으로 확인되었다.

본 발명의 게놈 변화를 배열함으로써, 다양한 게놈 크기의 17개의 MAR가 특징 지워졌다. 5q 및 20q 상의 MAR-L 과 함께 1p, 2p, 6p, 8p, 19p 및 20p 상의 9개의 MAR-G는 폐암에서의 독특한 양상으로 생각되고, 이것은 게놈 변화의 고해상도 맵핑의 장점을 나타낸다.

주로 몇몇의 샘플에 제한되는 높은 카피 숫자의 변화들과는 대조적으로, 단일 카피 변화들이 훨씬 더 많은 세포에서 발견되었는데, 이것은 비소세포성 폐암의 초기 단계에 흔한 공동 메카니즘을 나타낼 것이다.

또한 비소세포성 폐암의 암 발생에 있어서 그들의 가능한 협력적 역할을 암시하는 3쌍의 MAR 간의 유의한 상관관계를 확인하였다. 그러나 유전자 발현의 면에서, 단일 카피 숫자 변화의 기능적 중요성은 이러한 이상의 복잡한 성질 때문에 예측하기 어렵다. 이러한 게노믹 변화 중에서, 1p32.3 상의 MAR-G 및 13q21.1 상의 MAR-L은 임상적 양상들과 유의한 상관관계를 보였다(표 5).

예를 들어, 13q21.1 상의 MAR-L은 초기발병 (60세 이하) 및 후기단계(III단계 및 IV 단계)와 상관관계가 있었고, 이것은 이러한 변화가 암 진행의 후기 단계에서 획득된 것이라는 것을 제안한다. 1p32.3 상의 MAR-G 은 임파 결절 음성 케이스와의 연관을 보였고, 이것은 폐암의 전이에 대한 그것의 의의를 보여준다.

생존 분석은 단일변량 모델에서 6개의 유전적 변화가 나쁜예후와 유의하게 관련된다는 것을 보여주었다.

상기의 6개의 변이 중에서, 9p의 결실은 폐암에 대한 기존의 연구(37)에서 나쁜예후와 연관된다고 제안되어 왔다.

그러나 다른 5개의 염색체 변이는 폐암과의 관련성이 아직 연구되지 않았다.

따라서, 이러한 염색체 변이들은 비소세포성 폐암의 진단을 위한 신규한 유전적 지표로서 사용될 수 있다.

6개의 게노믹 변화 중에서, 6p21 및 19q13 상의 2개의 MAR-G는 PIM1, CCND3 (둘 다 6p21에서) 및 HKR1 같은 암 관련 유전자를 포함하고 있고, 이들 모두는 폐암 뿐 만 아니라 다양한 종류의 종양에서 조사되었다.

예를 들어, 백금착물 약제 주입후의 HKR1 의 높은 발현은 폐암의 화학적치료법에 대한 저항성의 획득을 표시하는 것이었다. 흥미롭게도, 이러한 두개의 MAR가 위에서 묘사된 것과 일치하게 (p=0.0482) 나타난다. 이것은 폐암의 예후에 대한 그들의 협력적인 역할을 암시한다.

콕스 회귀 모형을 이용한 이에 따른 다변량 분석에서, 오직 세 가지 인자, 즉 6p21 상의 MAR-G, 9p의 염색체 결실 및 남성 인자만이 나쁜예후의 독립적 지표로 남았다.

그러나 치료 요인도 생존에 영향을 끼칠 수 있다는 것이 고려되어져야 한다. 50개의 모든 케이스에 대한 치료요법을 재검토 하였다.

비록 제한된 숫자의 샘플들 때문에 수술 후 치료요법에 대한 하부 그룹 분석을 할 수는 없었지만, 모든 수술은 동일한 외과의사에 의해여 시행되었고 화학치료법은 어떠한 환자에게도 시행되지 않았다.

전체 게놈 어레이 CGH 전략을 사용하여, 우리는 성공적으로 기존에 확인된 것 뿐 만 아니라 비소세포성 폐암에 특이적인 신규한 MAR, 높은 수준 증폭 또는 결실을 포함하는 염색체 이상을 확인하였다.

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비소세포성 폐암의 두 하부 유형인 SqCs 및 AdCs 는 그들의 위치, 성장 유형 또는 예후에 따라서 다르게 행동하는 것으로 알려져 있다.본 발명에서는 비소세포성 폐암의 두 하부 유형간의 염색체 이상의 비교로서 각 하부 유형에 특이한 게노믹 불균형의 숫자를 확인하였다; 3p 및 Y의 결실 뿐만 아니라 3q 및 12p의 획득은 SqCs에 특이적인 반면, 6p의 획득은 AdCs에 특이적이다.

따라서 본 발명에서 확인된 특이한 게노믹 변이는 비소세포성 폐암의 하부유형에 특이한 병 발생기작을 밝히는데 유용하며, 그 하부유형을 정확하게 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 생존 분석은 단일변량 모델에서 6개의 유전적 변이가 나쁜예후와 유의하게 관련된다는 것을 보여주었다. 상기의 6개의 변이 중에서, 9p의 결실은 폐암에 대한 기존의 연구에서 나쁜예후와 연관된다고 제안되어 왔다(37). 그러나 다른 5개의 염색체 변화는 폐암과의 관련성이 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 이러한 염색체 변이들은 비소세포성 폐암의 예후의 판단을 위한 신규한 유전적 표지자로서 사용가능하다.

본 발명의 게놈 변이를 배열함으로써, 다양한 게놈 크기의 17개의 MAR가 특징 지워졌다. 5q 및 20q 상의 MAR-L 과 함께 1p, 2p, 6p, 8p, 19p 및 20p 상의 9개의 MAR-G는 폐암에서의 독특한 양상으로 생각되고 폐암의 정확한 진단에 사용될 수 있다. 또한 비소세포성 폐암의 암 발생에 있어서 그들의 가능한 협력적 역할을 암시하는 3쌍의 MAR 간의 유의한 상관관계를 확인하였다. 이러한 게노믹 변이 중에서, 1p32.3 상의 MAR-G 및 13q21.1 상의 MAR-L은 임상적 양상들과 유의한 상관관계를 보였다(표 5). 예를 들어, 13q21.1 상의 MAR-L은 초기발병 (60세 이하) 및 후기단계(III단계 및 IV 단계)와 상관관계가 있었고, 이것은 이러한 변화가 암 진행의 후기 단계에서 획득된 것이라는 것을 제안한다. 1p32.3 상의 MAR-G 은 임파 결절 음성 케이스와의 연관을 보였고, 이것은 폐암의 전이에 대한 그것의 의의를 보여준다. 따라서 이러한 인자들을 이용하여 폐암의 진행상황에 대한 예후적 표지자로 상기의 변이를 이용할 수 있다.

결론적으로 본 발명에서는 전체 게놈 어레이 CGH 전략을 사용하여, 비소세포성 폐암에 특이적인 신규한 MAR, 높은 수준 증폭 또는 결실을 포함하는 염색체 이상을 확인하였는바, 본 발명에서 확인된 신규한 유전 변이는 폐암 및 이의 하부유형에 대한 정확한 진단, 스크리닝 및 폐암의 진행에 대한 예후적 표지자로서 사용할 수 있다.

Claims (1)

1. 인간의 전체 게놈중 염색체 13번의 q암부분, 염색체 6번 p21부분 및 염색체 19번의 q31부분; 및 선택적으로 염색체 10번 p암 또는 염색체 16의 q암의 비교유전자보합법(Comparative Genomic Hybridization; CGH) 마커를 포함하고; 및 염색체 13번의 q암부분의 결실, 염색체 6번 p21부분의 반복 변이된 최소염색체 지역 획득(Minimally Altered Region Genomic Gain; MAR-G)의 유전자변이 및 염색체 19번의 q31부분의 반복 변이된 최소염색체 지역 획득(Minimally Altered Region Genomic Gain; MAR-G)의 유전자변이, 및 선택적으로 염색체 10번 p암의 획득 또는 염색체 16의 q암의 획득을 확인하는 이미지 분석 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암진단 키트.

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