CN102653774A

CN102653774A - 山羊可诱导多能干细胞的制备方法

Info

Publication number: CN102653774A
Application number: CN2011100515856A
Authority: CN
Inventors: 肖磊; 任江涛; 朴永俊; 何丽夏子; 鲍磊; 崔春; 廖静
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Suzhou Zhongke Cell Transformation Research Institute
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: CN102653774B

Abstract

本发明涉及一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法，包括步骤：A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)采用步骤A)所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊可诱导多能干细胞。本发明有助于确立山羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；山羊可诱导多能干细胞是山羊基因打靶的良好载体，山羊可诱导多能干细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件。

Description

山羊可诱导多能干细胞的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种山羊由成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell，简称iPS细胞)的制备方法。

背景技术

山羊在畜牧、医药方面都有巨大的应用前景，通过对山羊胚胎干细胞(ESC)系进行操作可以产生克隆动物或者转基因动物，对建造人类疾病模型、器官移植、改良物种、增加经济效益等方面意义重大。

ESCs是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞呈圆形，核质比很大，自稳定性很好，具有无限增殖、自我更新的能力，能够在体外培养的环境中永久传代，并保持正常核型；ESCs还具有“全能性”，无论在体内还是体外环境，它们都能分化成成体生物所有的细胞类型。建立动物ESC细胞系对于生产转基因动物和克隆动物都具有非常重要的意义。基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、发育生物学、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推动作用。从25年前小鼠胚胎干细胞获得到现在，人们利用反向遗传学手段不断建立和完善各种小鼠模型(Demers，S.P.，et al.(2007)，Cloning and stem cells，9，512-522)。

经典的建立ESC细胞系的方法是从囊胚的内细胞团分离出ESCs.但是利用这个方法所建立的真正意义的胚胎干细胞系被报道的哺乳动物只有小鼠(Evans MJ，et al.(1981)，Nature，292，154-156)、恒河猴(Liu，et al.(2008)，Cell Stem Cell，3，587-590)、人(TakahashiK.，et al.(2007)，Cell，131，861-872)和大鼠(Li，et al.(2008)，Cell，135，1299-1310)。而其他多数哺乳动物，包括猪、牛、羊等，虽然也有科学家尝试建立相应胚胎干细胞系，但都没有获得一株被认可的细胞系，其中很重要的一个原因就是没有寻找到适合这些动物ESC全能性维持的培养基。此外，山羊的胚胎发育过程以及维持山羊ESCs全能性的通路研究都不够清楚，导致目前并没有产生山羊ESC细胞系，也就制约了转基因山羊及克隆羊的应用，由上，建立山羊ES细胞系迫在眉睫。

2006年8月，Yamanaka实验室利用外源表达Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4四个转录因子，成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的“可诱导的多能干细胞”(inducedpluripotent stem cells，iPS)，这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转录因子诱导，重编程到全能性的状态(Takahashi K.，et al.(2006).Cell，126，663-676)；2007年，人类iPS的建立，进一步验证了该方法的可行性(Takahashi K.，et al.(2007)，Cell，131，861-872；Yu，etal.(2007)，Science，318，1917-1920)，之后，恒河猴，大鼠，猪等物种的iPS细胞系相继建立。大鼠是iPS细胞系早于ES系建立的先例，尽管iPS细胞并非百分之百的ES细胞，但有理由相信，iPS细胞可以运用到那些使用传统方法无法建立ES细胞的物种上，比如山羊。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法。

根据本发明的山羊可诱导多能干细胞的制备方法，包括步骤：

A)构建tet-on可诱导慢病毒载体系统，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40large T、hTert；

B)采用步骤A)所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊iPS细胞。

根据本发明所述的方法，所述山羊成体细胞为山羊原代耳尖成纤维细胞。

根据本发明所述的方法，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40 largeT、hTert。

根据本发明所述的方法，所述步骤B)克隆的产生是在感染第12天消化为单细胞按1∶3的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上，继续培养14天，挑取克隆。

根据本发明所述的方法，所述步骤B)的传代培养是将山羊iPS克隆按1∶5～10的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。

根据本发明所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。

C)山羊iPS细胞的干细胞多能性鉴定

根据本发明所述的方法，所述步骤C)山羊iPS细胞的多能性鉴定包括：实时定量PCR对山羊iPSC细胞系内源多能性基因的检测，如Oct4、Sox2、nanog被诱导表达，此外CDH1、Dnmt3b、TDGF、Dax1、Rex1、Sall4等干细胞marker均被诱导表达；

指标为：

1)碱性磷酸酶表达呈阳性；

2)干细胞表面特异标记SSEA-1(+)、Rex1(+)、SSEA-3(-)、SSEA-4(-)、Tra-1-60(+)、Tra-1-81(+)、E-Cadherin(+)；

3)Nanog基因的启动子区域被去甲基化；

4)撤DOX后，山羊外源基因的表达检测，表明外源基因被有效关闭；

5)自然分化形成胚状体后，外胚层NeuroD(+)、Fibronectin(+)，中胚层Myf5(+)、Enolse3(+)、VEGFR2(+)和内胚层DCN1(+)、AFP(+)；

6)体外随机分化，免疫荧光检测到外胚层Tuj1(+)、GFAP(+)，中胚层a-SMA(+)、Myotube(+)，内胚层FoxA2(+)；

7)山羊iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。

根据本发明所述的方法，所述畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。

本发明有助于确立山羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；山羊iPS细胞是山羊基因打靶的良好载体，本发明的山羊iPS细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件；此外，山羊iPS是猪的iPS成功诱导后第一项其它大型偶蹄目物种的iPS，这对于其它动物iPS的诱导有着重大指导意义。

附图说明

图1是病毒载体Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cDNA和Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP结构图。

图2是山羊iPS细胞获得的实验流程图。

图3是不同转录因子组合情况下，山羊PEF被诱导所产生的克隆数与碱性磷酸酶检测阳性克隆数统计结果图。

图4是山羊iPS细胞形态荧光镜检结果图，其中A：山羊未完全重编程克隆形态B：低倍镜下山羊的ES-like克隆C：ES-like克隆形态D：高倍镜下的山羊iPS细胞。

图5是山羊iPS细胞表面及多能型marker检测图，其中A：碱性磷酸酶、B：SSEA-1、C：SSEA-3、D：SSEA-4、E：Rex1、F：Tra-1-60、G：Tra-1-81、H：E-Cadherin。

图6是Realtime PCR检测山羊iPS细胞多能性Marker表达情况电泳图，从左到右依次为：山羊耳尖成纤维细胞，山羊iPS细胞8-3，山羊iPS细胞8-4，山羊iPS细胞8-7，山羊iPS细胞8-9，阴性对照。其中，山羊iPS细胞8-3为8个病毒因子诱导出的山羊可诱导多能干细胞3号克隆，其余同理。

图7是绝对定量检测山羊iPS细胞基因表达情况电泳图，从左到右依次为：山羊耳尖成纤维细胞，人胚胎干细胞，山羊iPS细胞8-3，山羊iPS细胞8-4，山羊iPS细胞8-7，山羊iPS细胞8-9。

图8是Nanog启动子区去甲基化检测结果图，分别为：山羊耳尖成纤维细胞，山羊iPS细胞8-3，山羊iPS细胞8-4，山羊iPS细胞8-7，山羊iPS细胞8-9。

图9撤DOX后，山羊外源基因的表达检测结果图，分别为山羊iPS及撤DOX 2天、4天、6天、8天的外源基因表达检测。

图10是Realtime PCR检测山羊iPS细胞在体外向三个胚层的分化能力图，从左到右泳道依次是：山羊iPS细胞8-3，山羊iPS细胞8-4，山羊iPS细胞8-7，山羊iPS细胞8-9，山羊iPS细胞8-3的EB，山羊iPS细胞8-4的EB，山羊iPS细胞8-7的EB，山羊iPS细胞8-9的EB和阴性对照。

图11是山羊iPS细胞体外随机分化情况的免疫染色图。

图12是山羊iPS细胞畸胎瘤免疫组化图，其中A：角化上皮(外胚层)B：平滑肌(中胚层)C：脂肪组织(中胚层)D腺管(内胚层)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中，用到的培养基有：

山羊原代耳尖成纤维细胞的培养基，具体组成为：90％的D-MEM培养液(购自Invitrogen，12571)；10％的胎牛血清(购自HyClone，SH30396.03)。

山羊iPS细胞的培养基，具体组成为：79％的Knockout D-MEM/F12培养液(购自Invitrogen，12660)；20％的Knockout SR(购自Invitrogen，10828)；1mM L-谷氨酸(购自Invitrogen，25030)；1％的非必须氨基酸(购自Invitrogen，11140050)；0.1mMβ-巯基乙醇(购自Sigma，M7522)。

以下实施例中所使用的原始慢病毒载体Lenti-EFlα-IRES-EGFP购自Invitrogen公司，具有氨苄抗性。

以下实施例中，通用的细胞培养产品均购自Invitrogen公司。

实施例1、慢病毒载体的构建

1.1、从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询干细胞中特异表达或高表达的特定基因(Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4，Lin28，Nanog，hTert，SV40largeT antigen和rtTA)的编码区，根据编码区序列设计引物，并引入酶切位点，引物序列如表1所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。

表1引物序列表

注：引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。

1.2、PCR扩增

以人类总cDNA为模板，利用表1中各基因引物进行PCR扩增，具体如下：

反应体系(25μl)：10×pfxMix 2.5μl，AccuPrime pfx酶0.2μl，上下游引物(50μM)各0.25μl，模板0.25μl，ddH2O 21.55μl。

反应条件：95℃ 2min；95℃ 20sec，66℃ 20sec，68℃ 30sec，循环35次；68℃10min。

1.3、慢病毒载体的构建

将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用天根公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)回收各基因片段，分别利用各自酶切位点双酶切，用相应的酶双酶切慢病毒载体LV-EF1α-EGFP-tetO-cDNA和Lenti-EF1α-cDNA-IRES-EGFP，得到慢病毒载体的骨架片段，将慢病毒载体的骨架片段和各基因片段用T4DNA连接酶(Fermentas公司)于22℃连接3h。

将连接产物转化GBE180感受态细菌(制备方法见http://www.chem.uga.edu/scottgrp/ GrpProtocols/Competent_cell_preparation.htm)，在琼脂平板上(含氨苄抗生素)，于37℃培养12小时，从平板上挑取阳性单菌落，使用博大泰克B型质粒小量快速提取试剂盒提取质粒，经测序鉴定为正确方可使用，将所得载体分别命名为Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cMyc、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Klf4、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Lin28、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Nanog、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-hTert、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-SV40T和Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP。

实施例2、细胞培养

2.1、山羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)的培养

取山羊耳朵，75％酒精清洗后剃毛，浸泡于含双抗(青霉素、链霉素)的PBS中15min，再依次使用PBS，无血清培养基(D-MEM)清洗耳朵数次，然后将耳朵浸泡于少量含30％FBS的D-MEM中，同时使用无菌剪刀将其剪成小块，移至培养瓶中，小块之间保持较小的距离，培养瓶倒置。6-8小时后，补加含30％FBS的D-MEM，正置，此后每天补加少量该培养基，一般3、4天后可明显观察到成纤维细胞，约一周后传代，传代时使用PBS清洗细胞2次，37℃下0.25％胰酶消化5min，以10％FBS的D-MEM终止反应吹打。首次传代按1比1或2传(视细胞量而定)，此后每3至4天传代，按1比3或4传，山羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)传10代以上依然有较好的增殖能力。

2.2、其它细胞的培养

293T细胞(购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库)的培养：传代时37℃下0.25％胰酶消化5min，使用10％FBS的D-MEM终止反应，吹打后按1比8～10传代。

小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞根据文献(Thomson JA.，Itskovitz-Eldor J.，Shapiro SS.，etal.Science.Nov 61998；282(5391)：1145-1147及Xu，C.，et al.Nat Biotechnol.2001，19(10)：971-4)的方法制备，作为滋养层细胞铺于平板备用。

实施例3、病毒包装

3.1、包装质粒的扩增

将实施例1中得到的九种鉴定正确的载体转化感受态细菌以进行扩增，经AxygenAxyPrep^TM plasmid Maxiprep Kit试剂盒(Axygen公司)中抽后，在超净工作台中进行纯化，即用中抽后质粒的十分之一体积的3M NaAC和2倍体积的无水乙醇混匀后，13000rpm离心15min，去上清，使用75％乙醇漂洗，吸去上清，于超净工作台中吹干后，使用无菌去离子蒸馏水溶解质粒，最后使用分光光度计及凝胶电泳确定质粒的浓度。

3.2、转染

按照Invitrogen公司转染试剂盒(ViraPower^TM Lentiviral Expression Systems)的说明书，使用转染试剂Lipofectamine^TM 2000将步骤3.1中的六个慢病毒质粒分别与包装质粒ViraPower^TM Packaging Mix(Invitrogen公司)共同转染293T细胞。

具体步骤为：转染实验前一天铺293T细胞，使第二天细胞可生长至90％满，对于一个T75瓶，取9μg ViraPower^TM Packaging Mix和3μg病毒质粒于1.5mL opti-MEM中，轻轻混匀，另取已摇匀的Lipofectamine^TM 2000转染试剂36μl于另一份1.5mL opti-MEM中，轻轻混匀后，室温放置5min，将上述两份分别含DNA和转染试剂的opti-MEM轻轻混匀，室温放置20min后将上述混合液至于293T细胞90％满的T75培养瓶中。按相同的方法转染其它五种慢病毒质粒。

3.3、病毒滴度测定

将步骤3.2中转染获得的六种病毒分别在24h内更换培养基，此后收集转染48h，72h和96h的病毒上清，一般无需进行病毒浓缩，而直接取5μl和1μl上述六种病毒，分别于24孔板中悬浮感染15万293T细胞，同时加入polybrene，由感染48h后六种病毒感染的293T细胞的GFP情况来确定病毒滴度，可由视野中GFP阳性细胞所占比例估算15万细胞中GFP阳性总细胞数，继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数，即为相应病毒的滴度。

实施例4、病毒感染

将实施例3包装的慢病毒，以MOI 5感染5×10⁴个山羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)，所用病毒的滴度约为5～8×10⁶IU/mL，

实验分为10组：

a)实验组1：8个转录因子的全组合；

b)实验组2：8因子-SV40large T(8因子去掉SV40large T)；

c)实验组3：8因子-hTert(8因子去掉hTert)；

d)实验组4：8因子-Oct4(8因子去掉Oct4)；

e)实验组5：8因子-Sox2(8因子去掉Sox2)；

f)实验组6：8因子-cMyc(8因子去掉cMyc)；

g)实验组7：8因子-Klf4(8因子去掉Klf4)；

h)实验组8：8因子-Lin28(8因子去掉Lin28)；

i)实验组9：8因子-Nanog(8因子去掉Nanog)；

j)空白对照组：仅携带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒；

每组实验均有6个平行样，其中3个用于碱性磷酸酶(AP)染色，统计阳性克隆数，另3个样用于克隆挑选。

感染48小时后，将上述细胞用0.25％胰酶，37℃下消化5min，计数后传代转移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的6孔板中，传代后24h内改用加入10000X DOX的人胚胎干细胞(ES)培养基，隔天换液，待出现克隆后每天换液。

在克隆出现12天后，将上述细胞用0.25％胰酶，37℃下消化5min，计数后传代转移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的6孔板中，传代后24h内改用人胚胎干细胞(ES)培养基，持续天天换液，直至12天左右，形态好的克隆出现。

实施例5、转染后阳性细胞的筛选

5.1、感染细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶(AP)染色

用荧光显微镜观察实施例4感染后的细胞，发现感染后48小时有绿色荧光表达。感染7天后，仅第1组和第3组有明显的细胞聚集，克隆生长代谢很快，形成很大的团块，无法挑取克隆。在传代后12天，将克隆用胰酶消化，传代至新的辐照后的小鼠胚胎成纤维细胞上。继续培养，5到6天之后，圆形致密的克隆开始出现。显微镜观察的结果如图4所示，其形态主要有两种，一类是小鼠胚胎干细胞类(mES-like)克隆，其细胞致密，克隆表面光滑，边缘平滑，边界清晰光亮(见转染山羊PEF所得图4B)；另一类克隆中部明显突起，细胞相对松散，边缘不够平滑，边界相对模糊(图4A)，为非ES-like克隆。

传代第12天对10组实验下6个平行样中的3个进行碱性磷酸酶(AP)染色，统计阳性克隆数，结果如图3所示，由图3可知，仅第1组和第3组的病毒组合产生了AP阳性的克隆，两组的5×10⁴个山羊PEF传代后分别形成19±2个和2±0.4个AP阳性的iPS细胞集落。

由以上结果可知山羊要比小鼠、大鼠、人、恒河猴、和猪更难，需要更多的外源转录因子参与重编程的过程。SV40大T抗原对于山羊的重编程是必需的，没有SV40大T抗原的参与，甚至不会产生细胞聚集。传代对编程完善克隆的释放十分重要，没有经过传代的细胞产生不了好的克隆。

5.2、阳性细胞的筛选

在感染后26天随机挑选克隆，使用0.25％胰酶37℃下消化5min，吹打为单细胞后，用含10％SR(血清替代物)+10％FBS的D-MEM的Knock D-MEM/F12培养液终止反应，此后每天更换该培养基，此时细胞增殖很快，每三天可传一代，每三天按1∶5～10传代(视克隆总数而定)至辐照过的滋养层细胞MEF上，此后不断进行克隆挑选和AP检测。

山羊iPS细胞经多次挑克隆和传代，其形态逐渐类似于小鼠胚胎干细胞。

实施例6、干细胞特性检测

取传至15代的小鼠成纤维细胞形成的克隆8-3、8-4、8-7、8-9进行以下检测，以证明其具备干细胞特性。

6.1、碱性磷酸酶表达

使用Chemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit(Millipore公司)进行染色，具体步骤如下：

使用PBS清洗细胞两次，4％PFA(多聚甲醛)室温固定1-2min，TBST清洗一遍，AP染料(按试剂盒中注明的配制)避光染色15min，TBST再清洗一遍后使细胞浸泡于PBS中。显微镜检测，结果如图5所示。

由图5可以看出，细胞被染成紫红色，而紫红色表示细胞具有碱性磷酸酶活性，从而说明反复挑克隆后的山羊iPS细胞具有很强的碱性磷酸酶活性，进一步地说形成的山羊iPS克隆具有胚胎干细胞特性，即表达碱性磷酸酶。

6.2、山羊iPS细胞的未分化状态检测

用realtime PCR方法检测山羊iPS细胞与诱导前细胞山羊PEF进行对比，分析其未分化基因表达水平。

6.2.1、引物设计

由于未分化的细胞会特异性表达以下基因，包括Oct4、Sox2、Nanog、CDH1、Dnmt3b、TDGF、Dax1、Rex1、Sall4，所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的山羊iPS细胞的未分化状态。未分化marker引物序列设计如表2所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。

表2未分化marker引物序列设计表

基因	引物序列
		Oct4 3’UTR-f	GGGTTTGTACTAGGGCTTTGGG
Oct4 3’UTR-r	GCATCATTGAACTTCACCTTCCCT
		Sox2 3’UTR-f	GCACGGCCATTAACGGCACAC
Sox2 3’UTR-r	CTCCATGCTGTTTCTTGCTGTCCTC
		Nanog 3’UTR-f	TCTGTGTCAGTTTGAGGGACAGG
Nanog 3’UTR-r	AACAAGTAAAGCCTCCCTATCCCA
		CDH1-f	CACTGCCCCACCCTATGACTCTCT
CDH1-r	ATACATGTCCGCCAGCTTCTTGAAG
		Dnmt3b-f	TTGGAATAGGAGATCTTGTGTGGGGA
Dnmt3b-r	AGAACTTGCCATCACCAAACCACTG
		TDGF-f	GATATCTCAGCAAACAAGTTTGCCA
TDGF-r	GGCAGGTCACTCAGGTTATTGTTGC
		Dax1-f	AGTGCGTGAAGTACATCCAGGGACT
Dax1-r	CAGGGTGTTAGCGCTGATGAATCTC
		Rex1-f	CACTGTCCTTCGATTACAACCCCAG
Rex1-r	CCACGTACTTACTGCTGGAGATGGG
		Sall4-f	GGCTAGTTCAGAATCTCCCCTCGG
Sall4-r	GCGGTAGTGCATCTTGAGTGAGCTC
		GAPDH-f	ACGGGAAGCTCACTGGCATGG
GAPDH-r	GCCAGCCCCAGCATCGAAG

6.2.2、PCR扩增

使用Toyobo Syber green PCR Mix，反应体系(15μl)：模板0.3μl，引物(5μM)1μl，Syber green Mix 7.5μl，ddH₂O 6.2μl，其中模板为抽提iPS细胞的RNA反转得到的cDNA。

反应条件：94℃，5min；94℃ 15sec，66℃ 10sec，72℃ 15sec，循环40次；72℃，10min。

将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中阴性对照的模板为未进行反转的RNA。

由图6的结果可知，山羊iPS细胞与诱导前的山羊PEF相比，其干细胞相关的marker，即Oct4、Sox2、Nanog、CDH1、Dnmt3b、TDGF、Dax1、Rex1、Sall4均有高水平的表达。

6.2.3、通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关marker是否表达(包括SSEA-1和Nanog)

使用PBS清洗细胞两次，4％PFA室温固定30min，PBS洗三次，再用含0.2％BSA+0.1％Triton-100的PBS洗两次，接着使用含1％BSA+4％normalserum+0.1％Triton-100的PBS封闭细胞1h，再将一抗(SSEA-1和Nanog)稀释在含0.2％BSA+0.1％Triton-100的PBS中，然后加到样品上，室温2h或4℃过夜，然后用PBT(0.1％Triton-100的PBS)洗涤细胞3-5次，将二抗(anti-mouse IgM和anti-rabbit IgG)稀释在含0.2％BSA+0.1％Triton-100的PBS中，然后加到样品上，室温1h，再用PBT洗三次，将Hochest母液以1∶1000用PBS稀释，室温避光放置5min，然后PBS洗涤两次，每次5min，再用4％PFA室温固定30min，最后用PBS洗涤两次，每次5min。免疫荧光染色结果如图7所示。

由图7可以看出，荧光镜检检测到山羊iPS细胞表达干细胞相关marker SSEA-1和Rex1，Tra-1-60、Tra-1-81、E-Cadherin，但是为SSEA-3、SSEA-4阴性，类似于小鼠胚胎肝细胞，以上说明山羊iPS克隆持续传代后，仍能自我更新，维持未分化的状态，具有胚胎干细胞能自我更新的特性。

6.3、山羊iPS细胞内外源基因表达水平检测

6.3.1、引物设计

由于使用人源的基因诱导山羊PEF重编程为山羊iPS细胞，因此使用人源的引物检测外源基因的表达情况，使用山羊基因检测山羊iPS细胞内源基因的表达情况，引物序列如表3所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成合成(其中f表示正向引物，r表示反向引物)。

6.3.2、PCR扩增

使用Toyobo Syber green PCR Mix反应体系(15μl)：模板0.3μl，引物(5μM)1μl，Sybergreen Mix 7.5μl，ddH₂O 6.2μl，其中模板为抽提iPS细胞的RNA反转得到的cDNA。

反应条件：94℃，5min；94℃15sec，66℃10sec，72℃15sec，循环40次；72℃，10min。

根据定量PCR原理，利用绝对定量，未知样品的量(拷贝数)可以通过从已知量的标准品的范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板(模板即质粒载体Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cMyc、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Klf4、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Lin28、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Nanog、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-hTert、Lenti-EF1α-EGFP-tetO-SV40T)。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验中进行反应，用稀释的样品标准样品构建标准曲线，通过计算来确定未知样品中目的基因的量。

标准品基因PCR的ct值与起始量(拷贝数)的对数呈线性关系，据此可作一条ct值对log(拷贝数)的曲线，得到线性相关得方程式，样本基因的拷贝数可以通过对应的ct值利用方程式计算得出，将结果绘制成图7。由图7结果可知，得到的山羊iPS细胞，其内源的胚胎干细胞全能性相关marker Oct4，Nanog，Sox2均得到激活表达，绝对数量达到人胚胎肝细胞水平。

表3引物序列表

6.4、干细胞特异启动子去甲基化程度检测

为检测得到的山羊iPS细胞的Nanog基因的启动子区域是否被去甲基化，先使用Bisulphite处理DNA，具体步骤如下：

取每份样品DNA210ng，双蒸水稀释到21μl，每管加入新鲜配置的2M的NaOH 4μl，50℃反应15min，向该样品中加入50℃的50μl 2％的低熔点琼脂糖(该琼脂糖预先置于100℃ 5min)，混匀后取10μl于预冷的300μl液体石蜡中，冰上至少放置30min，使形成的beads坚硬。然后向beads中加入500μl新配的2.5M焦亚硫酸钠(Sodiummetabisulphite)摇匀，使beads位于分层上，离心甩一下，然后50℃避光反应4h-12h(不超过16-18h)。接着使用1ml TE(pH8.0)洗3次，每次10min，0.5ml 0.2M NaOH洗2次，每次15min，再用1ml TE，每次10min，然后每管加100μl TE，4℃保存。

在山羊目的基因(Nanog)Promoter区富含CpG区域的上下游设计引物，将各富含CpG区的PCR产物连接至T载体上，转化后抽提质粒酶切鉴定送测序，其中的CG区即为甲基化位点，而TG区为未甲基化位点，绘制图谱(Analysis of DNA methylation usingbisulphate sequencing，contributed by Dr.Alexei Gratchev)，结果见图8。

由图8的结果可见，诱导前的山羊PEF细胞，其Nanog基因的启动子区域被高度甲基化，而诱导重编程得到的山羊iPS细胞的Nanog基因的启动子区域被高度去甲基化，诱导后的细胞山羊PEF细胞得到有效的重编程。

6.5、撤DOX后外源基因的关闭情况监测

为了检测，撤DOX后外源基因的关闭情况，我们用实时定量PCR的方法检测，撤去DOX 2天、4天、6天和8天的iPS细胞外源基因表达。将所得结果进行处理，如图9所示。由图9可见，4个山羊iPS克隆外源基因在撤去DOX后，表达逐渐下降，到第8天的时候，基本为零。证明tet-on系统很好的关闭了外源基因的表达。

6.5、体外拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能

为了验证山羊iPS细胞的多能性，使之自然分化形成胚状体(EB)，使用实时定量PCR的方法，即在确保看家基因Gapdh表达水平基本一致的情况下，比较各个样品，其三个胚层不同标记基因的表达水平间的差异。

将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。由图10的结果可知，山羊iPS细胞能够表达外胚层NeuroD、Fibronectin，中胚层Myf5、Enolse3、VEGFR2和内胚层DCN1、AFP的分化基因，证明山羊iPS细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层。

6.6、体外随机分化能力检测

将自然分化的已培养8天的拟胚体传至已铺过明胶的六孔板上，用DMEM培养基培养，每天换液，8天后孔板中的细胞呈现各种不同的形态，随后进行免疫荧光染色。

免疫荧光检测结果如图11所示到外胚层Tuj1、GFAP，中胚层a-SMA、Myotube，内胚层FoxA2等因子阳性。

6.5和6.6的结果表明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有体外分化成不同的组织细胞的潜能。

6.6、体内畸胎瘤形成的检测

为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力，用畸胎瘤石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色显示三个胚层组织细胞。

6.6.1、畸胎瘤形成

将8-4号iPS细胞用0.25％胰酶消化为单细胞，将其铺于用于细胞培养的培养皿中，置于37℃培养箱静置45min，取上层未贴壁的细胞(feeder贴壁快，故可将feeder与iPS细胞分离)。计数，500万iPS细胞悬浮于300μl 10％D-MEM中，对先天性免疫缺陷小鼠NOD-SCID小鼠进行后腿肌肉注射。第20天观察到有瘤形成，于第25-30天将其取出。

6.6.2、石蜡切片及HE染色

畸胎瘤石蜡切片制作步骤：将畸胎瘤用4％PFA固定后，PBS洗三次，依次使用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇脱水1h，继续使用100％乙醇脱水1h后，使用100％乙醇脱水过夜，接着用氯仿处理1h，处理三次，之后浸没于石蜡中2h，随后包埋，5μm切片。

HE染色步骤：将石蜡切片用二甲苯(Xylene)洗四次，每次5min(在脱色摇床上进行)，无水乙醇洗两次，每次10min，95％、90％、80％、70％乙醇依次洗5min，再用蒸馏水洗三次，每次5min，苏木精染色10min后流水冲洗15-30min至适合的颜色，接着再用蒸馏水洗5min，伊红A液染1min，伊红B液染5min，再用蒸馏水洗，接着用70％乙醇涮洗，90％乙醇涮洗至适合颜色，再用无水乙醇洗两次，每次10min，最后用Xylene洗四次，每次5min后封片。

将玻片显微镜镜检，结果如图12所示。由图12可以看到，山羊iPS细胞能够在体内分化形成三个胚层细胞，包括，内胚层的腺管结构，中胚层的平滑肌和脂肪组织以及外胚层的角化上皮组织。

由以上结果进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性，具有在体内分化成不同的组织细胞的潜能。

综上所述，本发明山羊成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞，使用山羊原代耳尖成纤维细胞(PEF)，已获得数株山羊iPS细胞，并由碱性磷酸酶表达、干细胞表面特异标记(SSEA-1，Rex1)，干细胞特异启动子去甲基化程度、端粒酶活性、拟胚体向三个胚层分化的潜能、体外随机分化为三胚层细胞的潜能以及畸胎瘤形成，确认其干细胞特性。

本发明有助于确立山羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；山羊iPS细胞是山羊基因打靶的良好载体，山羊iPS细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件；此外，本发明的山羊iPS是继猪的iPS成功诱导后第一项其它大型偶蹄目哺乳动物的iPS，这对于其它大型动物iPS的诱导有着重大指导意义。

Claims

1.一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog、hTert、SV40 largeT antigen；

B)采用步骤A)所得慢病毒载体，将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊可诱导多能干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊成体细胞为原代耳尖成纤维细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子的组合形式为：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、hTert、SV40 largeT antigen。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的传代培养是将山羊iPS克隆按1∶5～10的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤C)山羊可诱导多能干细胞的干细胞多能性鉴定。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述干细胞多能性鉴定包括检测以下指标：

1)碱性磷酸酶表达呈阳性；

3)自然分化形成胚状体后，外胚层NeuroD(+)、Fibronectin(+)，中胚层Myf5(+)、Enolse3(+)、VEGFR2(+)和内胚层DCN1(+)、AFP(+)；

4)随机分化后，免疫荧光检测到外胚层Tuj1(+)、GFAP(+)，中胚层a-SMA(+)、Myotube(+)，内胚层FoxA2(+)；

5)山羊可诱导多能干细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述指标4)形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述山羊可诱导多能干细胞的干细胞多能性鉴定还包括检测指标6)Nanog基因的启动子区域被去甲基化。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊可诱导多能干细胞在撤去DOX后关闭外源基因表达。