WO2016159009A1 - 癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法 - Google Patents

癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法 Download PDF

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WO2016159009A1
WO2016159009A1 PCT/JP2016/060244 JP2016060244W WO2016159009A1 WO 2016159009 A1 WO2016159009 A1 WO 2016159009A1 JP 2016060244 W JP2016060244 W JP 2016060244W WO 2016159009 A1 WO2016159009 A1 WO 2016159009A1
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primer
seq
polynucleotide
base sequence
gene
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PCT/JP2016/060244
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美津子 小阪
伸彦 水野
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国立大学法人岡山大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a cancer detection kit and a data acquisition method for cancer diagnosis.
  • the protein encoded by the Oct4 gene (Octamer-binding transcription factor 4 (also known as POU5F1, Oct3, Oct3 / 4)) is a transcriptional regulator involved in maintaining undifferentiated totipotency, and the protein is a totipotent cell in the early embryo And ES cells are observed in reproductive stem cells in postnatal life.
  • the protein encoded by the Oct4A gene is also known as one of the factors essential for somatic cell reprogramming, and is used to establish iPS cells (induced pluripotent stem cells).
  • Oct4 gene may be an indicator of cancer cells, and many studies have been developed. In embryonic carcinoma cells and reproductive cancer cells, it has been suggested that the expression of Oct4 gene is related to undifferentiation and malignancy (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the expression of the Oct4 gene can be detected using a real-time RT-PCR method, a conventional RT-PCR method, an antibody staining method, or the like. (See, for example, Non-Patent Documents 4 to 13).
  • a method for detecting the expression of the Oct4 gene by PCR using a primer set called “Suo”, “Liedtke-1”, “Liedtke-2”, “Atlasi” has been conventionally known (for example, Non-patent documents 14 to 16).
  • the antibody used for detection binds to both the protein derived from Oct4 gene and the protein derived from Oct4 pseudogene, both proteins are detected and the two cannot be distinguished. I have a point.
  • the primers used for detection anneal to both the cDNA derived from the Oct4 gene and the cDNA derived from the Oct4 pseudogene. The problem is that the two cannot be distinguished.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and its object is to find a primer set that can accurately detect the expression of Oct4 gene, and to use the primer set for cancer (for example, cancer source cells, cancer stem cells). ) Detection kit and data acquisition method for cancer diagnosis (for example, diagnosis of malignancy, judgment of prognosis, early diagnosis of metastasis).
  • the present inventor paid attention to the base sequence of the untranslated region of the Oct4 gene mRNA in relation to the A-type transcript of the Oct4 gene.
  • the base of the untranslated region on the 5 ′ end side of the Oct4 gene mRNA An attempt was made to identify the sequence as long as possible.
  • the inventor determined the transcription start point of Oct4 gene mRNA and the untranslated region on the 5 'end side of Oct4 gene mRNA.
  • a specific region existing only in the untranslated region of the Oct4 gene was determined.
  • the present inventor found an unknown splicing variant in relation to the A4 and B type transcripts of the Oct4 gene, and determined the base sequence of the splicing variant.
  • the inventor has found the following (a) to (d) and completed the present invention. That means (A) The newly identified 5′-terminal untranslated region of Oct4 gene mRNA has no base sequence homology to the 5′-terminal untranslated region of Oct4 pseudogene mRNA. The area exists; (B) If a forward primer was set in the newly identified untranslated region on the 5 ′ end side, an arbitrary reverse primer (for example, a reverse primer having high homology to Oct4 pseudogene mRNA) was used.
  • the cancer detection kit of the present invention is characterized by including any one or more of the following primer sets ( ⁇ ) and ( ⁇ ) in order to solve the above-mentioned problems:
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26. It is preferably a part of a polynucleotide having a base sequence complementary to the indicated base sequence.
  • the cancer detection kit of the present invention further comprises (i) a primer set comprising a forward primer and a reverse primer for amplifying a transcription product of the osteopontin gene, (ii) a probe that hybridizes with the transcription product of the osteopontin gene, Alternatively, (iii) an anti-osteopontin antibody is preferably provided.
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis uses a sample collected from a living body as a template to solve the above-mentioned problems, and includes the following primer sets ( ⁇ ) and ( ⁇ ): Characterized in that it comprises performing a polymerase chain reaction using any one or more of: ( ⁇ ) A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying an A4 transcription product of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 A primer set, which is a primer including a polynucleotide comprising consecutive nucleotides of 17 bases or more; ( ⁇ ) A primer set comprising a forward primer and a reverse primer for amplifying a B-type transcript of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 , A primer comprising a polynucleotide comprising 17 or more consecutive nu
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or It is preferably a part of a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis of the present invention preferably further includes a step of detecting the expression of osteopontin gene or the expression of osteopontin protein in the sample collected from the living body.
  • the present invention has an effect that the expression of the Oct4 pseudogene (more specifically, the human Oct4 gene) can be accurately detected without detecting the expression of the Oct4 pseudogene.
  • the present invention specifically detects the expression of a desired splicing variant by designing the reverse primer and forward primer base sequences that are paired with the forward primer and reverse primer having a specific base sequence into the desired base sequences. There is an effect that can be done.
  • the present invention has an effect of obtaining accurate data for cancer diagnosis (for example, early diagnosis of cancer, diagnosis of malignancy of cancer, judgment of prognosis, diagnosis of metastasis).
  • the present invention has an effect of enabling development of an anticancer agent, a cancer radical treatment method, a cancer prevention method, and the like targeting the function of the Oct4 gene.
  • the present invention has the effect of being able to acquire accurate data for elucidating the unknown function of the Oct4 gene in somatic cells.
  • (A) And (b) is a figure which shows the design of each primer set used for the Example of this invention.
  • it is a figure which shows the result of the electrophoresis of the amplification product amplified using each primer set.
  • It is a figure which shows the structure of the splicing variant of A type of Oct4 gene.
  • It is a figure which shows the structure of the B type splicing variant of Oct4 gene.
  • it is a figure which shows the result of the electrophoresis which shows that the malignancy of cancer and the expression of Oct4 gene are correlated.
  • It is a figure which shows the result of Wound Healing Assay in the Example of this invention.
  • Example of this invention it is a figure which shows the result of the electrophoresis of the amplification product amplified using the primer set for osteopontin genes.
  • A is a figure which shows the result of the electrophoresis of the amplification product amplified using the primer set for osteopontin genes in the Example of this invention
  • (b) is the outline of the design of the said primer set.
  • the cancer that is the detection target of the cancer detection kit of the present embodiment is not particularly limited, and may be any cancer.
  • breast cancer, uterine cancer, lung cancer, ovarian cancer, testicular cancer, colon cancer, kidney cancer, or brain tumor can be mentioned.
  • the cancer detection kit of the present embodiment can detect cancer with high malignancy with high sensitivity.
  • the cancer detection kit of the present embodiment includes one or more of a primer set ( ⁇ ) and a primer set ( ⁇ ).
  • a primer set ( ⁇ ) and a primer set ( ⁇ ) are described.
  • the primer set ( ⁇ ) is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying the A4 transcription product of the Oct4 gene, and the forward primer is a poly-nucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • nucleotides having 17 or more consecutive bases for example, any continuous 17 bases (for example, a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or 37), 18 bases, 19 bases, 20 bases
  • the primer set ( ⁇ ) is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying the A4 transcription product of the Oct4 gene, and the forward primer is a poly-nucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • nucleotides having 17 or more consecutive bases for example, any continuous 17 bases (for example, a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or 37), 18 bases, 19 bases, 20 bases Primer consisting of a polynucleotide consisting of 21 bases, 22 bases, 23 bases, 24 bases, 25 bases, 26 bases, 27 bases (for example, SEQ ID NO: 1), 28 bases, 29 bases, 30 bases, or 31 bases) It may be.
  • the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 is a polynucleotide corresponding to the untranslated region on the 5 'end side of the mRNA of Oct4 gene.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 has no homology with the base sequence of the untranslated region of Oct4 pseudogene mRNA. Therefore, when the forward primer of the primer set ( ⁇ ) is used, even if any reverse primer is used, the expression of the Oct4 gene is detected without detecting the expression of the Oct4 pseudogene (in particular, the transcription of the Oct4 gene A type). Only product) can be detected accurately.
  • the forward primer of the primer set ( ⁇ ) may be a primer including a part of a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 (for example, 17 consecutive bases or more), or represented by SEQ ID NO: 41 It may be a primer comprising a part of a polynucleotide having a base sequence (for example, 17 or more consecutive bases), or a primer comprising as a part the entire polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41. Alternatively, it may be a primer composed of the entire polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • the forward primer includes nucleotides other than the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41
  • the number of the nucleotides is not particularly limited. From the viewpoint of more accurately detecting Oct4 gene expression, 5base The following is preferable, 4base or less is more preferable, 3base or less is more preferable, 2base or less is more preferable, and 1base or less is most preferable.
  • “C” may be linked to the 3 ′ end of the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41, or “T” may be further linked to the 3 ′ end of the “C”. Or “C” may be further linked to the 3 ′ end of the “T”, “A” may be further linked to the 3 ′ end of the “C”, “T” may be further linked to the 3 ′ end of “A”.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) only needs to be a pair of the forward primer described above and amplify the A4 transcription product of the Oct4 gene, and its specific configuration is not particularly limited.
  • a desired design for example, by making the base sequence of the reverse primer a base sequence corresponding to the desired exon
  • the base sequence of the reverse primer may be a base sequence that spans different exons. In this case, false positives due to contamination of genomic cDNA into the PCR reaction system can be eliminated, which is more preferable.
  • the reverse primer preferably has approximately the same length as the forward primer and / or approximately the same GC content as the forward primer.
  • the length of the reverse primer is X (base) and the length of the forward primer is Y (base)
  • these preferably satisfy the relational expression “Y-5 ⁇ X ⁇ Y + 5”
  • the relational expression of “Y-4 ⁇ X ⁇ Y + 4” more preferable to satisfy the relational expression of “Y-3 ⁇ X ⁇ Y + 3”, and “Y ⁇ 2 ⁇ X
  • the relational expression of ⁇ Y + 2 is satisfied, and it is more preferable that the relational expression of“ Y ⁇ 1 ⁇ X ⁇ Y + 1 ”is satisfied.
  • the GC content of the reverse primer is A (%) and the GC content of the forward primer is B (%)
  • these preferably satisfy the relational expression “B ⁇ 15 ⁇ A ⁇ B + 15”. It is more preferable to satisfy the relational expression “B ⁇ 10 ⁇ A ⁇ B + 10”, more preferable to satisfy the relational expression “B ⁇ 5 ⁇ A ⁇ B + 5”, and “B ⁇ 3 ⁇ A It is more preferable that the relational expression “ ⁇ B + 3” is satisfied, and it is more preferable that the relational expression “B ⁇ 1 ⁇ A ⁇ B + 1” is satisfied.
  • the reverse primer of the above primer set ( ⁇ ) is used for the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26. It may be a part of a polynucleotide having a complementary base sequence.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is within the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26, Exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or a base sequence corresponding to an insertion sequence inserted between specific exons or an insertion sequence inserted adjacent to a specific exon And part of a polynucleotide having a complementary base sequence.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is an adjacent desired sequence in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26.
  • SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26.
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23
  • SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25
  • SEQ ID NO: 26 Part of a polynucleotide having a base sequence complementary to an insertion sequence inserted between two specific exons; or an insertion sequence inserted adjacent to a specific exon.
  • false positives due to contamination of genomic cDNA into the PCR reaction system can be eliminated, which is more preferable.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) may be a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 36, or SEQ ID NO: 38
  • the polynucleotide may include a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 36, or SEQ ID NO: 38.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of 17 or more consecutive nucleotides among polynucleotides having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 34.
  • the primer may be included.
  • the present inventor as a type A transcription product of the Oct4 gene, in addition to the known splicing variant hOct4A, is a novel splicing variant, hOct4A1 (SEQ ID NO: 21), hOct4A2 (SEQ ID NO: 22), hOct4A3 (SEQ ID NO: 23), hOct4A4 (SEQ ID NO: 24), hOct4A5 (SEQ ID NO: 25), and hOct4A6 (SEQ ID NO: 26) were successfully found.
  • hOct4A1 SEQ ID NO: 21
  • hOct4A2 SEQ ID NO: 22
  • hOct4A3 SEQ ID NO: 23
  • hOct4A4 SEQ ID NO: 24
  • hOct4A5 SEQ ID NO: 25
  • hOct4A6 SEQ ID NO: 26
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 26
  • Specific splicing variants hOct4A1, hOct4A2, hOct4A3, hOct4A4, hOct4A5, or hOct4A6
  • a specific splicing variant can be detected more specifically based on the difference in mobility of the amplification product in the gel.
  • the primer set ( ⁇ ) is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying a B-type transcription product of the Oct4 gene, and the forward primer is a poly-nucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33.
  • the primer set ( ⁇ ) is a primer set composed of a forward primer and a reverse primer for amplifying a B-type transcription product of the Oct4 gene, and the forward primer is a poly-nucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33.
  • nucleotides it is a primer composed of a polynucleotide comprising 17 or more consecutive nucleotides (for example, any number of consecutive 17 to 135 nucleotides), and the reverse primer is represented by SEQ ID NO: 34 From a polynucleotide comprising a nucleotide having 17 or more consecutive nucleotides (for example, any number of consecutive 17 to 531 nucleotides) in a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown May be a primer.
  • the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 is a polynucleotide corresponding to a region upstream of the 5 'end of exon 2 of Oct4 gene mRNA.
  • the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 is a polynucleotide corresponding to exon 5 of Oct4 gene mRNA and a region further downstream of the 3 'end of exon 5.
  • the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 is not present in the Oct4 pseudogene transcription product or the Oct4 gene A-type transcription product. Therefore, by using a forward primer comprising a polynucleotide consisting of 17 or more consecutive nucleotides in the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 (or consisting of the polynucleotide), Oct4 It is possible to specifically detect the B-type transcript of the gene.
  • the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 is commonly present in various B-type splicing variants of the Oct4 gene. Therefore, a polynucleotide comprising a nucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 34 and comprising a nucleotide having 17 or more consecutive nucleotides (or consisting of the polynucleotide) is included.
  • the reverse primer various splicing variants of B type of Oct4 gene can be comprehensively detected.
  • the forward primer of the primer set ( ⁇ ) may be a primer including a part of a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 (for example, continuous, any number of bases of 17 to 135 bases).
  • it may be a primer composed of a part of a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 (any number of consecutive bases of 17 to 135 bases).
  • It may be a primer including the entire polynucleotide having the base sequence as a part, or a primer consisting of the entire polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33.
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is a portion of a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 (any number of consecutive bases of 17 to 531 bases). Or a part of a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 (continuous, any number of bases of 17 to 531 bases). It may be a primer, or may be a primer that includes the entire polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 as a part, or represented by SEQ ID NO: 34 It may be a primer comprising the whole polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence.
  • the forward primer of the primer set ( ⁇ ) is a nucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and having a nucleotide sequence of 17 or more nucleotides (for example, any arbitrary 17 nucleotides, A primer comprising a polynucleotide comprising 18 bases, 19 bases, 20 bases, 21 bases, 22 bases, 23 bases, 24 bases, 25 bases, 26 bases, or 27 bases).
  • nucleotides having 17 or more consecutive bases for example, any one of 17 bases, 18 bases, 19 bases, 20 bases, 21 bases, 22 bases, 23 bases, 24 bases
  • It may be a primer composed of a polynucleotide comprising a base, 25 bases, 26 bases, or 27 bases).
  • the reverse primer of the primer set ( ⁇ ) is a nucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and having a nucleotide sequence of 17 or more consecutive nucleotides (for example, any arbitrary 17 or 18 nucleotides, A primer comprising a polynucleotide comprising 19 bases, 20 bases, 21 bases, 22 bases, 23 bases, 24 bases, 25 bases, or 26 bases), or a base sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • a polynucleotide having 17 or more bases may be a primer comprising a polynucleotide.
  • the forward primer and the reverse primer have substantially the same length and / or approximately the same GC content.
  • the length of the forward primer is X (base) and the length of the reverse primer is Y (base)
  • these preferably satisfy the relational expression of “Y-5 ⁇ X ⁇ Y + 5”
  • the relational expression of “Y-4 ⁇ X ⁇ Y + 4” more preferable to satisfy the relational expression of “Y-3 ⁇ X ⁇ Y + 3”
  • “Y ⁇ 2 ⁇ X It is more preferable that the relational expression of ⁇ Y + 2 ”is satisfied, and it is more preferable that the relational expression of“ Y ⁇ 1 ⁇ X ⁇ Y + 1 ”is satisfied.
  • the GC content of the forward primer is A (%) and the GC content of the reverse primer is B (%)
  • these preferably satisfy the relational expression “B ⁇ 15 ⁇ A ⁇ B + 15”. It is more preferable to satisfy the relational expression “B ⁇ 10 ⁇ A ⁇ B + 10”, more preferable to satisfy the relational expression “B ⁇ 5 ⁇ A ⁇ B + 5”, and “B ⁇ 3 ⁇ A It is more preferable that the relational expression “ ⁇ B + 3” is satisfied, and it is more preferable that the relational expression “B ⁇ 1 ⁇ A ⁇ B + 1” is satisfied.
  • the present inventor as a B-type transcription product of the Oct4 gene, in addition to the known splicing variants hOct4B and hOct4B1, is a novel splicing variant, hOct4B2 (SEQ ID NO: 27). , HOct4B3 (SEQ ID NO: 28), hOct4B4 (SEQ ID NO: 29), hOct4B5 (SEQ ID NO: 30), hOct4B6 (SEQ ID NO: 31), and hOct4Bns (SEQ ID NO: 32) were successfully found.
  • splicing variants (hOct4B2, hOct4B3, hOct4B4, hOct4B5, hOct4B6, or hOct4Bns) can be comprehensively detected. If the PCR amplification product is further analyzed by a gel electrophoresis apparatus, a specific splicing variant can be specifically detected based on the difference in mobility of the amplification product in the gel.
  • the cancer detection kit of the present embodiment may have a configuration for detecting the expression of osteopontin gene or osteopontin protein.
  • either the expression of the splicing variant of type a, the expression of the splicing variant of type b, or the expression of the splicing variant of type c may be detected. From the viewpoint of realizing high cancer diagnosis, it is preferable to detect the expression of a c-type splicing variant.
  • the configuration for detecting the expression of the osteopontin gene or the osteopontin protein is not particularly limited.
  • a primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying a transcription product of the osteopontin gene,
  • anti-osteopontin antibodies If the cancer detection kit of the present embodiment includes the primer set (i), it is possible to detect the expression of the osteopontin gene based on, for example, the PCR method, and the probe (ii). For example, it is possible to detect the expression of the osteopontin gene based on, for example, Northern blotting.
  • the anti-osteopontin antibody of (iii) is provided, the osteopontin protein can be detected based on the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). It is possible to detect expression.
  • the primer set is not particularly limited as long as it can detect the expression of the osteopontin gene.
  • a polynucleotide consisting of a part of the sense strand of the osteopontin gene can be used as the forward primer
  • a polynucleotide consisting of a part of the antisense strand of the osteopontin gene can be used as the reverse primer.
  • the forward primer can be a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 42.
  • a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 can be used as the reverse primer.
  • a polynucleotide having a base sequence spanning between exon 3 and exon 5 is used as the forward primer.
  • the reverse primer is not particularly limited, and a polynucleotide comprising a part of the antisense strand of the osteopontin gene can be used. More specifically, a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 can be used as the forward primer, and a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 can be used as the reverse primer. It is.
  • the probe is not particularly limited as long as it can detect the expression of the osteopontin gene.
  • a polynucleotide having a base sequence complementary to mRNA derived from the osteopontin gene can be used as a probe.
  • the anti-osteopontin antibody is not particularly limited as long as it can detect osteopontin protein.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody produced by a well-known method can be used.
  • the epitope of these antibodies should just be a peptide contained in osteopontin protein,
  • the concrete amino acid sequence is not specifically limited.
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis uses a sample collected from a living body as a template, and a polymerase using any one or more of the following ( ⁇ ) and ( ⁇ ) primer sets: It is characterized by having a step of performing a chain reaction: ( ⁇ ) A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying an A4 transcription product of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 A primer set, which is a primer including a polynucleotide comprising consecutive nucleotides of 17 bases or more; ( ⁇ ) A primer set comprising a forward primer and a reverse primer for amplifying a B-type transcript of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 , A primer comprising a polynucleotide comprising 17 or more consecutive
  • the sample collected from the living body is not particularly limited, and a desired sample can be used as appropriate.
  • a sample collected from a living body may be blood, urine, skin, hair, cells, and tissue.
  • a sample collected from a living body may be cDNA obtained by purifying mRNA from a desired sample (for example, blood, urine, skin, hair, cells, tissues, etc.) and reverse-trancribing the mRNA. Good.
  • purification of mRNA and reverse transcription of mRNA can be performed using a commercially available kit.
  • a sample collected from a living body is obtained by purifying mRNA from a desired sample (eg, blood, urine, skin, hair, cells, tissue, etc.), reverse-trancribing the mRNA to obtain cDNA, It may be a cDNA library prepared by being incorporated into a vector. Incorporation of cDNA into a vector can be performed using a commercially available kit.
  • a desired sample eg, blood, urine, skin, hair, cells, tissue, etc.
  • cDNA library prepared by being incorporated into a vector.
  • Incorporation of cDNA into a vector can be performed using a commercially available kit.
  • reaction cycle of the polymerase chain reaction for example, a reaction cycle comprising an annealing reaction, an extension reaction, and a denaturation reaction
  • reaction cycle of the polymerase chain reaction for example, a reaction cycle comprising an annealing reaction, an extension reaction, and a denaturation reaction
  • forward used What is necessary is just to set suitably based on the base sequence of a primer and a reverse primer.
  • the data acquisition method for cancer diagnosis of the present embodiment may include a step of subjecting the amplification product of the polymerase chain reaction to electrophoresis. If it is the said structure, the detailed information (for example, the presence or absence of a splicing variant and the kind of splicing variant) regarding the splicing variant contained in the sample extract
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis according to the present embodiment may further include a step of detecting the expression of osteopontin gene or the expression of osteopontin protein in a sample collected from a living body.
  • the process is [1-3. It is possible to carry out based on the PCR method, the Northern blot method, or the ELISA method using the configuration described in “Other configuration”.
  • the data acquisition method for cancer diagnosis of the present embodiment may have the following ⁇ 1> or ⁇ 2> configuration, for example.
  • the osteopontin gene and the osteopontin protein may be any of a-type splicing variant, b-type splicing variant expression, or c-type splicing variant, but the viewpoint of obtaining higher effects Therefore, a c-type splicing variant is preferable.
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis is to first detect the expression of osteopontin gene or osteopontin protein in a sample collected from a living body, and then express the expression of osteopontin gene or osteopontin protein. It may be configured to detect the expression of Oct4 gene in a sample in which is positive. If it is the said structure, cancer diagnosis can be performed rapidly.
  • the method for acquiring data for cancer diagnosis includes simultaneously expressing the expression of osteopontin gene or osteopontin protein in a sample collected from a living body and the expression of Oct4 gene in a sample collected from the living body.
  • the structure to detect may be sufficient. If it is the said structure, a highly accurate cancer diagnosis can be performed.
  • the method for diagnosing cancer includes a step of performing a polymerase chain reaction using a sample as a template and using any one or more of the following primer sets ( ⁇ ) and ( ⁇ ): As: ( ⁇ ) A primer set consisting of a forward primer and a reverse primer for amplifying an A4 transcription product of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 A primer set, which is a primer including a polynucleotide comprising consecutive nucleotides of 17 bases or more; ( ⁇ ) A primer set comprising a forward primer and a reverse primer for amplifying a B-type transcript of the Oct4 gene, wherein the forward primer is one of the polynucleotides having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 , A primer comprising a polynucleotide comprising 17 or more consecutive nucleotides, wherein the reverse primer is a con
  • the sample is not particularly limited, and a desired sample can be used as appropriate.
  • the sample may be blood, urine, skin, hair, cells, and tissue.
  • the sample may also be a cDNA obtained by purifying mRNA from a desired sample (for example, blood, urine, skin, hair, cells, tissue, etc.) and reverse-trancribing the mRNA.
  • a desired sample for example, blood, urine, skin, hair, cells, tissue, etc.
  • purification of mRNA and reverse transcription of mRNA can be performed using a commercially available kit.
  • Samples are prepared by purifying mRNA from a desired sample (eg, blood, urine, skin, hair, cells, tissues, etc.), reverse-transcription of the mRNA to obtain cDNA, and incorporating the cDNA into a vector. It may be a prepared cDNA library. Incorporation of cDNA into a vector can be performed using a commercially available kit.
  • reaction cycle of the polymerase chain reaction for example, a reaction cycle comprising an annealing reaction, an extension reaction, and a denaturation reaction
  • reaction cycle of the polymerase chain reaction for example, a reaction cycle comprising an annealing reaction, an extension reaction, and a denaturation reaction
  • forward used What is necessary is just to set suitably based on the base sequence of a primer and a reverse primer.
  • the cancer diagnosis method of the present embodiment may include a step of subjecting the amplification product of the polymerase chain reaction to electrophoresis. If it is the said structure, the detailed information (for example, the presence or absence of a splicing variant and the kind of splicing variant) about the splicing variant contained in a sample can be obtained, and, thereby, more detailed data for cancer diagnosis Can be acquired.
  • the detailed information for example, the presence or absence of a splicing variant and the kind of splicing variant
  • the cancer diagnosis method of the present embodiment may include a step of determining a cancer risk based on a result obtained from the step of subjecting a reaction product of the polymerase chain reaction to electrophoresis.
  • the step of subjecting the reaction product of the polymerase chain reaction to electrophoresis if the presence of a splicing variant is confirmed in the sample, it can be determined that there is a risk of cancer. If it is confirmed that the splicing variant exists, it can be determined that “the risk of cancer is high”.
  • a specific splicing variant eg, Oct4A, Oct4A1, Oct4A2, Oct4A3, Oct4A4, Oct4A5, Oct4A6, or Oct4B5
  • a specific splicing variant eg, Oct4A, Oct4A1, Oct4A2, Oct4A3, Oct4A4, Oct4A5, Oct4A6, or Oct4B5
  • a plurality of types of splicing variants for example, Oct4A, Oct4A1, Oct4A2, Oct4A3, Oct4A4, Oct4A5, Oct4A6, or Oct4B5 included in the sample. If it is confirmed that the splicing variant exists, it can be determined that “the risk of cancer is high”.
  • the cancer diagnosis method of the present embodiment may further include a step of detecting the expression of osteopontin gene or the expression of osteopontin protein in a sample collected from a living body.
  • the process is [1-3. It is possible to carry out based on the PCR method, the Northern blot method, or the ELISA method using the configuration described in “Other configuration”.
  • the cancer diagnosis method of the present embodiment may have the following ⁇ 1> or ⁇ 2> configuration, for example.
  • the osteopontin gene and the osteopontin protein may be any of a-type splicing variant, b-type splicing variant expression, or c-type splicing variant, but the viewpoint of obtaining higher effects Therefore, a c-type splicing variant is preferable.
  • the expression of osteopontin gene or osteopontin protein in a sample collected from a living body was detected, and then the expression of osteopontin gene or osteopontin protein was positive. It may be configured to detect the expression of Oct4 gene in a sample. If it is the said structure, cancer diagnosis can be performed rapidly.
  • the cancer diagnosis method is configured to simultaneously detect the expression of osteopontin gene or osteopontin protein in a sample collected from a living body and the expression of Oct4 gene in a sample collected from the living body. May be. If it is the said structure, a highly accurate cancer diagnosis can be performed.
  • RNA was purified from human PA-1 cells using Trizol (Invitrogen). Using GeneRacer kit (Invitrogen), 1 ⁇ g of Total RNA was subjected to reverse transcription reaction. PCR reaction was performed using three types of reverse primers. The enzyme used for the PCR reaction was primestar (Takara).
  • Fig. 9 shows an electrophoresis image of the amplification product of the PCR reaction.
  • the amplification product of the PCR reaction was inserted into TA-vector (Invitrogen), the base sequence of the amplification product was confirmed with a sequencer.
  • the amplification product contained a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3).
  • Table 1 and FIG. 1 describe information on the base sequences of the forward primer and the reverse primer of each primer set, and information on DNA considered to be amplified by each primer set.
  • Set A1 and Set A2 are primer sets corresponding to the above-described primer set ( ⁇ )
  • Set B is a primer set corresponding to the above-described primer set ( ⁇ ).
  • Amplification specificity of primer set> PCR reaction is performed using each primer set described above and cDNA derived from the A type transcription product of Oct4A gene or Oct4 pseudogene (specifically, PG1, PG3 and PG4) as a template. The presence or absence of the amplified product was confirmed by electrophoresis.
  • PCR reaction was performed using a prime star or emerald amplifier manufactured by Takara Bio Inc., and a 20 ⁇ L reaction solution containing 250 ⁇ M forward primer, 250 ⁇ M reverse primer, 10 fg or 10 ag template, NTP as other components, and a buffer solution. Used.
  • PCR reaction apparatus As the PCR reaction apparatus, a GeneAmp PCR system 9700 apparatus manufactured by ABI Corporation was used.
  • PCR reaction was performed for each primer set in the same reaction cycle. That is, a reaction cycle was employed in which a cycle comprising annealing and extension reaction at 68 ° C. for 2 minutes and denaturation reaction at 96 ° C. for 30 seconds was performed 35 times.
  • splicing variants > Set A1 or Set B as a primer set and various cells (cancer cells (specifically, MCF7, HeLa, Ishikawa, HEC265, HEC1, HEC50B, TTA1, A549, S2, PA1, or HEK293T) as a template
  • PCR reaction was performed using cDNA obtained by reverse transcription of mRNA purified from normal cells (specifically, ARPE-19, HFF, HUVEC, or HAoSMC).
  • purification of mRNA and reverse transcription of mRNA were performed using a commercially available kit according to the protocol attached to the kit. The PCR reaction is performed as described in ⁇ 2.
  • the PCR reaction solution was subjected to electrophoresis, and the PCR amplification product was cut out from the gel used for electrophoresis.
  • the PCR amplification product was inserted into a commercially available vector according to a known method, and Escherichia coli was transformed with the vector. After culturing and growing E. coli transformants, the vector was purified from the E. coli, and the base sequence of the PCR amplification product inserted into the vector was analyzed using a commercially available sequencer.
  • hOct4A1 SEQ ID NO: 21
  • hOct4A2 SEQ ID NO: 22
  • hOct4A3 novel splicing variants in addition to the known splicing variant hOct4A (SEQ ID NO: 23), hOct4A4 (SEQ ID NO: 24), hOct4A5 (SEQ ID NO: 25), and hOct4A6 (SEQ ID NO: 26) were successfully found.
  • hOct4B2 SEQ ID NO: 27
  • hOct4B3 SEQ ID NO: 28
  • HOct4B4 SEQ ID NO: 29
  • hOct4B5 SEQ ID NO: 30
  • hOct4B6 SEQ ID NO: 31
  • hOct4Bns SEQ ID NO: 32
  • FIGS. 1-10 The outline of the structure of the splicing variant described above is shown in FIGS.
  • Tables 2 and 3 show the types of splicing variants detected in each cell and the number of detected clones.
  • the base sequence of the obtained clone was determined, it was found that all the transcripts were the Oct4 gene, and it was confirmed that no pseudogene was contained.
  • Tables 2 and 3 it was revealed that various splicing variants are expressed in cancer cells.
  • expression of the Oct4 gene other than the Oct4 Bns type was hardly observed.
  • PCR reaction using Set A1 or Set B as a primer set and cDNA obtained by reverse transcription of mRNA purified from MCF7 which is a breast cancer cell or MDA-MB-231 which is a high-grade breast cancer cell as a template went.
  • the purification of mRNA and the reverse transcription of mRNA were performed using a commercially available kit according to the protocol attached to the kit.
  • the PCR reaction is performed as described in ⁇ 2. Amplification specificity of primer set> Thereafter, the presence or absence of a PCR amplification product was confirmed by electrophoresis.
  • MCF7 which is a breast cancer cell
  • MDA-MB-231 which is a high-grade breast cancer cell
  • FIG. 6 shows the results of the Wound Healing Assay.
  • MDA-MB-231 which is a highly malignant breast cancer cell, was found to be It was revealed that MCF7, which has high migration ability but low malignancy, has almost no migration ability.
  • an expression vector into which the EGFP gene was inserted and an expression vector into which hOct4A was inserted were prepared.
  • an expression vector a pEGFP-N1 vector manufactured by Clontech was used.
  • MCF7 was plated on a petri dish at a cell concentration (6.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ) and cultured in DMEM medium (Invitrogen). Twenty-four hours after the start of the culture, gene introduction was performed according to a conventional method using lipofectamine 2000, and the culture was further continued. After culturing for 36 hours after gene introduction, the petri dish was injured and Wound Healing Assay was performed.
  • FIG. 7 shows the results of the Wound Healing Assay.
  • MCF7 into which the expression vector into which hOct4A had been introduced was significantly promoted in migration, but the EGFP gene was MCF7 into which the inserted expression vector was introduced was found to have almost no migration ability like wild-type MCF7.
  • MRNA was purified from the cultured COS7 cells using a commercially available kit, and the type of splicing variant contained in the mRNA was identified by 5'RACE method.
  • Oct4A When an expression vector inserted with cDNA of type A splicing variants (specifically, Oct4A, Oct4A1, Oct4A2) was introduced into COS7 cells, only one kind of transcript of only Oct4A was detected in both Oct4A and Oct4A2. On the other hand, in the case of Oct4A1, Oct4A1 and other small bands were confirmed.
  • the translation product of Oct4A is a known protein having 360 amino acids, and the translation product of Oct4A1 was found to have a possibility of producing a new protein having 168 amino acids with a large deletion of the carboxyl terminal region.
  • the Oct4B type protein may be mainly produced as a translation product of Oct4B5. It is done.
  • the codons considered as the translation start point and the codons considered as the translation end point are different, and the size of the protein that is the translation product predicted based on these codons Is different. Since the size of the actually observed protein is close to the size of the protein that is the translation product of Oct4B5, it is considered that the protein that is the translation product of Oct4B5 may be mainly produced.
  • PCR reaction was performed using a prime star or emerald amplifier manufactured by Takara Bio Inc., and a 20 ⁇ L reaction solution containing 250 ⁇ M forward primer, 250 ⁇ M reverse primer, 10 fg or 10 ag template, NTP as other components, and a buffer solution. Used.
  • the enzyme used for the PCR reaction was emerald amp (Takara).
  • PCR reaction apparatus As the PCR reaction apparatus, a GeneAmp PCR system 9700 apparatus manufactured by ABI Corporation was used.
  • reaction cycle a reaction cycle was adopted in which a cycle consisting of an annealing reaction at 55 ° C. for 15 seconds, an extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes, and a denaturation reaction at 96 ° C. for 30 seconds was performed 35 times.
  • PCR reaction apparatus As the PCR reaction apparatus, a GeneAmp PCR system 9700 apparatus manufactured by ABI Corporation was used.
  • reaction cycle a reaction cycle was adopted in which a cycle consisting of an annealing reaction at 55 ° C. for 15 seconds, an extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes, and a denaturation reaction at 96 ° C. for 30 seconds was performed 35 times.
  • each of lanes “1”, “2”, “3” and “4” represents PA1 cell-derived cDNA-1, PA1 cell-derived cDNA-2, Oct4B cDNA 10fg, and Oct4B cDNA 10ag.
  • the test result at the time of using each is shown.
  • Oct4 gene expression in various cell lines of carcinoma (MCF7, MDAMB231, PA1, A549), normal cell lines (ARPE-19, HFF, HUVEC, HAoSMC), and normal tissues (monocyte, bone marrow), and The expression of osteopontin gene was confirmed by PCR method.
  • the RNA extraction and cDNA synthesis from the cell lines and tissues described above were performed according to well-known methods using commercially available kits.
  • FO 5′-accatgagaattgcagtgatttgc-3 ′ (SEQ ID NO: 42); RV: 5′-tcagtgaccagttcatcagattca-3 ′ (SEQ ID NO: 43).
  • Osteopontin is known to have three splicing variants (for example, (a) J Gastrointest Surg (2015) 19, 639-650, (b) Cancer Res; 75 (6) March 15, 2015 , 963-973, (c) Mol Cancer Res; 9 (3) March 2011, 280-293, (d) Oncogene, 2006, 25, 2192-2202).
  • FIG. 12 shows an example of an image of agarose gel electrophoresis.
  • SPP1a represents an a-type splicing variant
  • SPP1b represents a b-type splicing variant
  • SPP1c represents a c-type splicing variant.
  • Table 5 shows the test results.
  • “ ⁇ ” indicates negative (no band detected by agarose gel electrophoresis), and “ ⁇ ” indicates weak positive (a thin band detected by agarose gel electrophoresis).
  • “+” Indicates positive (a dark band is detected by agarose gel electrophoresis).
  • “a” indicates that expression of a-type splicing variant was confirmed
  • “b” indicates that expression of b-type splicing variant was confirmed
  • “c” represents c-type splicing variant. It shows that the expression of the splicing variant was confirmed.
  • the expression of the osteopontin gene was also confirmed, but the expression of the c-type splicing variant was not confirmed.
  • This is highly correlated with the expression of the Oct4 gene and the expression of the a-type, b-type and c-type splicing variants, and is particularly high between the expression of the Oct4 gene and the expression of the c-type splicing variant. It shows that there is a correlation.
  • PCR reaction was performed using cDNA derived from PA-1 cells as a template and using forward primer (SSP1c-FO) and reverse primer (SSP1c-RV) described later as primers.
  • SSP1c-FO forward primer
  • SSP1c-RV reverse primer
  • a reaction cycle consisting of a denaturation reaction at 96 ° C. for 30 seconds, an annealing reaction at 60 ° C. for 15 seconds, and an extension reaction at 72 ° C. for 60 seconds was repeated 35 cycles.
  • SSP1c-FO 5′-AAGTTCTGAGGAAAAGCAGAATGCTGTGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 44);
  • SSP1c-RV 5′-TTTAATTGACCTCAGAAGATGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 45).
  • exon 4 does not exist in the c-type splicing variant of the osteopontin gene. Therefore, a base sequence spanning between exon 3 and exon 5 was used as the base sequence of SSP1c-FO (see FIG. 13 (b)).
  • RT + indicates a test result when reverse transcriptase (ReverseReTranscriptase) is used
  • RT ⁇ indicates a test result when reverse transcriptase is not used.
  • c-type can be specifically detected among the three splicing variants of the osteopontin gene. It was revealed.
  • the present invention can be used for detection of cancer.

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Abstract

　癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法を提供し、これらでは、特定のプライマーセットを用いて、Ｏｃｔ４遺伝子の転写産物を特異的に検出する。

Description

癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法
　本発明は、癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法に関する。
　Ｏｃｔ４遺伝子（Octamer-binding transcription factor 4（別名：ＰＯＵ５Ｆ１、Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ３／４））がコードするタンパク質は、未分化全能性維持に関わる転写調節因子であり、当該タンパク質は、初期胚における全能性細胞やＥＳ細胞、出生後の生体における生殖幹細胞の中に観察される。また、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子がコードするタンパク質は、体細胞の初期化に不可欠な因子の一つとしても知られ、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）の樹立に用いられている。
　近年、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が癌細胞の指標になるのではないかと考えられ、多くの研究が展開されている。そして、胚性癌腫細胞や生殖癌細胞においては、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が、未分化性や悪性度に関係することが示唆されている（例えば、非特許文献１～３参照）。
　上述した状況にあって、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を正確に検出することは重要であって、従来から、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、コンベンショナルＲＴ－ＰＣＲ法、または、抗体染色法などによって検出している（例えば、非特許文献４～１３参照）。
　例えば、「Ｓｕｏ」、「Ｌｉｅｄｔｋｅ－１」、「Ｌｉｅｄｔｋｅ－２」、「Ａｔｌａｓｉ」と呼ばれるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によってＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する方法が従来から知られている（例えば、非特許文献１４～１６参照）。
Gidekel S et al., Cancer Cell, 2003, 5, 361-70 Rijlaarsdam MA et al., Br J Cancer, 2011 Sep, 6, 105(6), 854-63 Bustamante-Marin X et al., Int J Dev Biol, 2013, 57(2-4), 201-10 Sotomayor P et al., Prostate, 2009, 69, 401-410 Schoenhals M et al., Biochem Biophys Res Commun, 2009, 383, 157-162 Atlasi Y et al., Stem Cells, 2008, 26, 3068-3074 Monsef N et al., Prostate, 2009, 69, 909-916 Looijenga LH et al., Cancer Res, 2003, 63, 2244-2250 Chen Z et al., J Surg Oncol, 2009, 99, 414-419 Cheng L et al., J Pathol, 2007, 211, 1-9 Atlasi Y et al., Int J Cancer, 2007, 120, 1598-1602 Du Z et al., Glia, 2009, 57, 724-733 Tai MK et al., Carcinogenesis, 2005, 26, 495-502 Suo G et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Dec 2; 337(4):1047-51 Liedtke S., Cell Stem Cell. 2007 Oct11; 1(4):364-6 Atlasi Y et al., Stem Cells. 2008 Dec; 26(12):3068-74
　近年の研究によって、ヒトゲノム上には、（ｉ）Ｏｃｔ４遺伝子と酷似した配列を有するＯｃｔ４偽遺伝子（pseudogene）が少なくとも６つ存在すること、（ｉｉ）Ｏｃｔ４偽遺伝子（pseudogene）の中にはＯｃｔ４遺伝子と、塩基配列の相同性が極めて高いものが存在すること（例えば、Ｏｃｔ４偽遺伝子であるＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４の塩基配列と、Ｏｃｔ４遺伝子の塩基配列との相同性は、略９７～９８％である）、（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４偽遺伝子も転写され、その後、転写産物が翻訳される可能性があること、が示唆されている。
　そして、研究が進むにつれて、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を検出するための従来の方法は、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現をも検出しており、正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出できていないという大きな問題点を抱えていることが明らかになった。
　例えば、従来の抗体染色法は、検出に用いている抗体がＯｃｔ４遺伝子由来のタンパク質およびＯｃｔ４偽遺伝子由来のタンパク質の両方に結合するので、両方のタンパク質を検出しており、両者を区別できないという問題点を抱えている。また、従来のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、および、コンベンショナルＲＴ－ＰＣＲ法は、検出に用いているプライマーがＯｃｔ４遺伝子由来のｃＤＮＡおよびＯｃｔ４偽遺伝子由来のｃＤＮＡの両方にアニーリングするので、両方の遺伝子の発現を検出しており、両者を区別できないという問題点を抱えている。
　なお、従来のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、および、コンベンショナルＲＴ－ＰＣＲ法でも、何れの遺伝子が発現しているか確認することは可能ではあるが、この場合、ＰＣＲの増幅産物をクローニングし、その後、当該増幅産物の塩基配列をシークエンサーにて解読するという膨大な作業を必要とするという、大きな問題点を抱えている。
　更に、ＰＣＲの増幅効率には、ＰＣＲ反応に供するサンプル中のテンプレート（換言すれば、遺伝子の転写産物）の量が反映されるため、サンプル中にＯｃｔ４偽遺伝子に由来する転写産物が存在すると、Ｏｃｔ４遺伝子に由来する転写産物が検出できない可能性があるという、大きな問題点を抱えている。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を正確に検出できるプライマーセットを見出し、当該プライマーセットを癌（例えば、癌源細胞、癌幹細胞）の検出キット、および、癌診断（例えば、悪性度の診断、予後の判断、転移の早期診断）のためのデータの取得方法に利用することにある。
　本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物に関連して、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの非翻訳領域の塩基配列に注目し、まず、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域の塩基配列をできるだけ長く同定することを試みた。そして、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始点を決定するとともに、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域を決定した。そして、Ｏｃｔ４遺伝子の非翻訳領域とＯｃｔ４偽遺伝子の非翻訳領域とを比較した結果、Ｏｃｔ４遺伝子の非翻訳領域にのみ存在する特異的な領域を決定した。
　また、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型およびＢ型の転写産物に関連して、未知のスプライシングバリアントを見出し、当該スプライシングバリアントの塩基配列を決定した。
　そして、本発明者は、以下の（ａ）～（ｄ）を見出し、本発明を完成させるに至った。つまり、
　（ａ）Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの、新たに同定された５’末端側の非翻訳領域には、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域に対して、塩基配列の相同性がない領域が存在すること；
　（ｂ）新たに同定された５’末端側の非翻訳領域内にフォワードプライマーを設定すれば、任意のリバースプライマー（例えば、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡに対して相同性が高いリバースプライマー）を用いたとしても、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せずに、Ｏｃｔ４遺伝子の発現（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物）のみを正確に検出できること；
　（ｃ）通常は転写開始点の直ぐ近くにプライマーを設定することはないが、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物の場合、転写開始点の直ぐ近くにプライマーを設定すれば、当該プライマーが効果的に機能すること。
　（ｄ）新たに同定されたスプライシングバリアントの塩基配列に基づいてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設定すれば、Ｏｃｔ４遺伝子バリアント（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物）のすべてのタイプを正確に検出できること；
　＜１＞本発明の癌検出キットは、上記課題を解決するために、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を備えていることを特徴としている：
　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
　＜２＞本発明の癌検出キットでは、上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることが好ましい。
　＜３＞本発明の癌検出キットは、更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることが好ましい。
　＜４＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法は、上記課題を解決するために、生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
　＜５＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法では、上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることが好ましい。
　＜６＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法は、更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することが好ましい。
　本発明は、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せず、正確にＯｃｔ４遺伝子（より具体的には、ヒトＯｃｔ４遺伝子）の発現のみを検出できるという効果を奏する。
　本発明は、特定の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーと対になる、リバースプライマーおよびフォワードプライマーの塩基配列を所望の塩基配列に設計することによって、所望のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出できるという効果を奏する。
　本発明は、癌診断（例えば、癌の早期診断、癌の悪性度の診断、予後の判断、転移の診断）のための正確なデータを取得できるという効果を奏する。
　本発明は、Ｏｃｔ４遺伝子の機能を標的とした、抗癌剤、癌の根治療法、および、癌の予防法、等の開発を可能にするという効果を奏する。
　本発明は、体細胞におけるＯｃｔ４遺伝子の未知の機能の解明のための正確なデータを取得できるという効果を奏する。
（ａ）および（ｂ）は、本発明の実施例に用いた各プライマーセットのデザインを示す図である。 本発明の実施例において、各プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型のスプライシングバリアントの構造を示す図である。 Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型のスプライシングバリアントの構造を示す図である。 本発明の実施例において、癌の悪性度とＯｃｔ４遺伝子の発現とが相関していることを示す、電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施例における、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙの結果を示す図である。 本発明の実施例における、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙの結果を示す図である。 本発明の実施例における、スプライシングバリアントを細胞内で強制発現したときに細胞内に実在するスプライシングバリアントを示す、電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施例における、５’ＲＡＣＥにて特異的に増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施例において、各プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施例において、プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 本発明の実施例において、オステオポンチン遺伝子用のプライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。 （ａ）は、本発明の実施例において、オステオポンチン遺伝子用のプライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図であり、（ｂ）は、当該プライマーセットの設計の概略を示す図である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
　〔１．癌検出キット〕
　本実施の形態の癌検出キットの検出対象である癌は、特に限定されず、あらゆる癌であり得る。例えば、乳癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、大腸癌、腎臓癌、または、脳腫瘍を挙げることができる。本実施の形態の癌検出キットは、悪性度の高い癌を、高感度にて検出することが可能である。
　本実施の形態の癌検出キットは、プライマーセット（α）およびプライマーセット（β）の何れか１つ以上を備えているものである。以下では、プライマーセット（α）およびプライマーセット（β）の各々について説明する。
　〔１－１．プライマーセット（α）〕
　プライマーセット（α）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基（例えば、配列番号３５または３７にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基（例えば、配列番号１）、２８塩基、２９塩基、３０塩基、または、３１塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーである。
　プライマーセット（α）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基（例えば、配列番号３５または３７にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基（例えば、配列番号１）、２８塩基、２９塩基、３０塩基、または、３１塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
　配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域に対応するポリヌクレオチドである。配列番号４１にて示される塩基配列は、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡの非翻訳領域の塩基配列に対して相同性がない。それ故に、プライマーセット（α）のフォワードプライマーを用いれば、任意のリバースプライマーを用いたとしても、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せずに、Ｏｃｔ４遺伝子の発現（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物）のみを正確に検出できる。
　プライマーセット（α）のフォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した１７塩基以上）を含むプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した１７塩基以上）からなるプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
　当該フォワードプライマーが、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む場合、当該ヌクレオチドの数は特に限定されないが、より正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出するという観点から、５ｂａｓｅ以下が好ましく、４ｂａｓｅ以下がより好ましく、３ｂａｓｅ以下がより好ましく、２ｂａｓｅ以下がより好ましく、１ｂａｓｅ以下が最も好ましい。例えば、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの３’末端側に、「Ｃ」を連結してもよいし、当該「Ｃ」の３'末端側に更に「Ｔ」を連結してもよいし、当該「Ｔ」の３'末端側に更に「Ｃ」を連結してもよいし、当該「Ｃ」の３'末端側に更に「Ａ」を連結してもよいし、当該「Ａ」の３'末端側に更に「Ｔ」を連結してもよい。
　プライマーセット（α）のリバースプライマーは、上述したフォワードプライマーと対になって、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。リバースプライマーの塩基配列を所望のデザインにすることによって（例えば、リバースプライマーの塩基配列を所望のエクソンに対応する塩基配列にすることによって）、Ａ型の複数のスプライシングバリアントの中から、特定のスプライシングバリアントのみを検出することができる。また、リバースプライマーの塩基配列は、異なるエクソン間をまたぐ塩基配列であってもよい。この場合、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡのＰＣＲ反応系への混入に起因する擬陽性を排除できるので、より好ましい。
　より正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出するという観点から、リバースプライマーは、フォワードプライマーと略同じ長さ、および／または、フォワードプライマーと略同じＧＣ含量を有するものであることが好ましい。
　例えば、リバースプライマーの長さをＸ（ｂａｓｅ）、フォワードプライマーの長さをＹ（ｂａｓｅ）とすると、これらは、「Ｙ－５≦Ｘ≦Ｙ＋５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｙ－４≦Ｘ≦Ｙ＋４」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－３≦Ｘ≦Ｙ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－２≦Ｘ≦Ｙ＋２」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－１≦Ｘ≦Ｙ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
　また、リバースプライマーのＧＣ含量をＡ（％）、フォワードプライマーのＧＣ含量をＢ（％）とすると、これらは、「Ｂ－１５≦Ａ≦Ｂ＋１５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｂ－１０≦Ａ≦Ｂ＋１０」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－５≦Ａ≦Ｂ＋５」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－３≦Ａ≦Ｂ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－１≦Ａ≦Ｂ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
　より具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。
　更に具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列内の、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、または、特定のエクソンの間に挿入される挿入配列、若しくは、特定のエクソンに隣接して挿入される挿入配列に対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。
　また、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列内の、隣接する所望の領域の間をまたぐ塩基配列（例えば、エクソン１とエクソン２の間、エクソン２とエクソン３との間、エクソン３とエクソン３との間、またはエクソン４とエクソン５との間をまたぐ塩基配列；特定の２つのエクソンの間に挿入される挿入配列；若しくは、特定のエクソンに隣接して挿入される挿入配列）に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。この場合、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡのＰＣＲ反応系への混入に起因する擬陽性を排除できるので、より好ましい。
　更に具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２、配列番号４、配列番号３６、または、配列番号３８にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよいし、配列番号２、配列番号４、配列番号３６、または、配列番号３８にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。
　また、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよい。
　後述する実施例にて示すように、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物として、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４Ａ以外に、新規なスプライシングバリアントである、ｈＯｃｔ４Ａ１（配列番号２１）、ｈＯｃｔ４Ａ２（配列番号２２）、ｈＯｃｔ４Ａ３（配列番号２３）、ｈＯｃｔ４Ａ４（配列番号２４）、ｈＯｃｔ４Ａ５（配列番号２５）、および、ｈＯｃｔ４Ａ６（配列番号２６）を見出すことに成功した。
　上記プライマーセット（α）のリバースプライマーが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であれば、各々、特定のスプライシングバリアント（ｈＯｃｔ４Ａ１、ｈＯｃｔ４Ａ２、ｈＯｃｔ４Ａ３、ｈＯｃｔ４Ａ４、ｈＯｃｔ４Ａ５、または、ｈＯｃｔ４Ａ６）を特異的に検出することができる。なお、ＰＣＲの増幅産物をゲル電気泳動装置にて更に解析すれば、ゲル中における増幅産物の移動度の差に基づいて、特定のスプライシングバリアントを更に特異的に検出することができる。
　〔１－２．プライマーセット（β）〕
　プライマーセット（β）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーである。
　プライマーセット（β）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
　配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡのエクソン２の５’末端よりも上流側の領域に対応するポリヌクレオチドである。一方、配列番号３４にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５、および、エクソン５の３’末端の更に下流側の領域に対応するポリヌクレオチドである。
　配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４偽遺伝子の転写産物や、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物の中には存在しない。それ故に、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む（または、当該ポリヌクレオチドからなる）フォワードプライマーを用いることによって、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を特異的に検出することができる。
　一方、配列番号３４にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の様々なスプライシングバリアントの中に、共通して存在する。それ故に、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む（または、当該ポリヌクレオチドからなる）リバースプライマーを用いることによって、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の様々なスプライシングバリアントを網羅的に検出することができる。
　プライマーセット（β）のフォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）を含むプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
　プライマーセット（β）のリバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）を含むプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
　より具体的に、プライマーセット（β）のフォワードプライマーは、配列番号５にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、または、２７塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよいし、配列番号５にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、または、２７塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
　一方、プライマーセット（β）のリバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、または、２６塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよいし、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、または、２６塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
　より正確にＯｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を検出するという観点から、フォワードプライマーとリバースプライマーとは、略同じ長さ、および／または、略同じＧＣ含量を有するものであることが好ましい。
　例えば、フォワードプライマーの長さをＸ（ｂａｓｅ）、リバースプライマーの長さをＹ（ｂａｓｅ）とすると、これらは、「Ｙ－５≦Ｘ≦Ｙ＋５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｙ－４≦Ｘ≦Ｙ＋４」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－３≦Ｘ≦Ｙ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－２≦Ｘ≦Ｙ＋２」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ－１≦Ｘ≦Ｙ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
　また、フォワードプライマーのＧＣ含量をＡ（％）、リバースプライマーのＧＣ含量をＢ（％）とすると、これらは、「Ｂ－１５≦Ａ≦Ｂ＋１５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｂ－１０≦Ａ≦Ｂ＋１０」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－５≦Ａ≦Ｂ＋５」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－３≦Ａ≦Ｂ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ－１≦Ａ≦Ｂ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
　後述する実施例にて示すように、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物として、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４ＢおよびｈＯｃｔ４Ｂ１以外に、新規なスプライシングバリアントである、ｈＯｃｔ４Ｂ２（配列番号２７）、ｈＯｃｔ４Ｂ３（配列番号２８）、ｈＯｃｔ４Ｂ４（配列番号２９）、ｈＯｃｔ４Ｂ５（配列番号３０）、ｈＯｃｔ４Ｂ６（配列番号３１）、および、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ（配列番号３２）を見出すことに成功した。
　上記プライマーセット（β）を用いれば、スプライシングバリアント（ｈＯｃｔ４Ｂ２、ｈＯｃｔ４Ｂ３、ｈＯｃｔ４Ｂ４、ｈＯｃｔ４Ｂ５、ｈＯｃｔ４Ｂ６、または、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ）を網羅的に検出することができる。なお、ＰＣＲの増幅産物をゲル電気泳動装置にて更に解析すれば、ゲル中における増幅産物の移動度の差に基づいて、特定のスプライシングバリアントを特異的に検出することができる。
　〔１－３．その他の構成〕
　本実施の形態の癌検出キットは、オステオポンチン（Osteopontin）遺伝子、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出するための構成を備えていてもよい。
　後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定して、試験対象のサンプルを絞り込み、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば（例えば、同時に両方の確認を行えば）、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
　オステオポンチン遺伝子の発現を検出する場合、オステオポンチンの、ａ型のスプライシングバリアントの発現、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの発現の何れを検出してもよいが、より精度の高い癌診断を実現するという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントの発現を検出することが好ましい。
　オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチンタンパク質の発現を検出するための構成は、特に限定されないが、当該構成として、例えば、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体を挙げることができる。本実施の形態の癌検出キットが、（ｉ）のプライマーセットを備えていれば、例えばＰＣＲ法に基づいてオステオポンチン遺伝子の発現を検出することが可能であり、（ｉｉ）のプローブを備えていれば、例えばノーザンブロット法に基づいてオステオポンチン遺伝子の発現を検出することが可能であり、（ｉｉｉ）の抗オステオポンチン抗体を備えていれば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法に基づいてオステオポンチンタンパク質の発現を検出することが可能である。
　（ｉ）のプライマーセットとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子の発現を検出することができるものであればよい。例えば、フォワードプライマーとしては、オステオポンチン遺伝子のセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、オステオポンチン遺伝子のアンチセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能である。更に具体的に、ａ型、ｂ型、およびｃ型のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出する観点から、フォワードプライマーとしては、配列番号４２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、配列番号４３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
　３つのスプライシングバリアントのうちｃ型のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出する観点から、フォワードプライマーとしては、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子のアンチセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能である。更に具体的に、フォワードプライマーとしては、配列番号４４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、配列番号４５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
　（ｉｉ）のプローブとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子の発現を検出することができるものであればよい。例えば、プローブとしては、オステオポンチン遺伝子由来のｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
　（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体としては、特に限定されず、オステオポンチンタンパク質を検出することができるものであればよい。例えば、周知の方法によって作製された、ポリクローナル抗体、または、モノクローナル抗体を用いることが可能である。なお、これら抗体のエピトープは、オステオポンチンタンパク質内に含まれるペプチドであればよく、その具体的なアミノ酸配列は、特に限定されない。
　〔２．癌診断のためのデータの取得方法〕
　本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
　プライマーセット（α）および（β）の構成については、〔１．癌検出キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
　生体から採取されたサンプルとしては、特に限定されず、適宜、所望のサンプルを用いることができる。
　例えば、生体から採取されたサンプルは、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織であってもよい。
　また、生体から採取されたサンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡであってもよい。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて行うことができる。
　また、生体から採取されたサンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、当該ｃＤＮＡをベクターに組み込んで作製されたｃＤＮＡライブラリーであってもよい。なお、ｃＤＮＡのベクターへの組み込みは、市販のキットを用いて行うことができる。
　ポリメラーゼ連鎖反応の反応サイクル（例えば、アニーリング反応、伸長反応、および、変性反応からなる、反応サイクル）の具体的な構成（例えば、反応温度、および、反応時間）は、特に限定されず、用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に基づいて、適宜、設定すればよい。
　本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を、電気泳動に供する工程を有していてもよい。当該構成であれば、生体から採取されたサンプル内に含まれるスプライシングバリアントに関する詳細な情報（例えば、スプライシングバリアントの有無、および、スプライシングバリアントの種類）を得ることができ、これによって、癌診断のためのより詳細なデータの取得が可能になる。
　本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、更に、生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有していてもよい。
　後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定し、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
　当該工程は、〔１－３．その他の構成〕にて説明した構成を用い、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、または、ＥＬＩＳＡ法に基づいて行うことが可能である。
　ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、および、ＥＬＩＳＡ法の具体的な方法は、周知の方法に従えばよい。
　本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、例えば、以下の＜１＞または＜２＞構成であってもよい。なお、以下の構成においてオステオポンチン遺伝子およびオステオポンチン蛋白質は、ａ型のスプライシングバリアント、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの何れであってもよいが、より高い効果を得るという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントであることが好ましい。
　＜１＞本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、最初に、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現を検出し、その後に、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現が陽性であったサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する構成であってもよい。当該構成であれば、迅速にが癌診断をすることができる。
　＜２＞本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現、および、当該生体から採取されたサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を同時に検出する構成であってもよい。当該構成であれば、精度の高い癌診断をすることができる。
　〔３．癌の診断方法〕
　本実施の形態の癌の診断方法は、サンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
　プライマーセット（α）および（β）の構成については、〔１．癌検出キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
　サンプルとしては、特に限定されず、適宜、所望のサンプルを用いることができる。
　例えば、サンプルは、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織であってもよい。
　また、サンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡであってもよい。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて行うことができる。
　また、サンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、当該ｃＤＮＡをベクターに組み込んで作製されたｃＤＮＡライブラリーであってもよい。なお、ｃＤＮＡのベクターへの組み込みは、市販のキットを用いて行うことができる。
　ポリメラーゼ連鎖反応の反応サイクル（例えば、アニーリング反応、伸長反応、および、変性反応からなる、反応サイクル）の具体的な構成（例えば、反応温度、および、反応時間）は、特に限定されず、用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に基づいて、適宜、設定すればよい。
　本実施の形態の癌の診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動に供する工程を有していてもよい。当該構成であれば、サンプル内に含まれるスプライシングバリアントに関する詳細な情報（例えば、スプライシングバリアントの有無、および、スプライシングバリアントの種類）を得ることができ、これによって、癌診断のためのより詳細なデータの取得が可能になる。
　本実施の形態の癌の診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程から得られた結果に基づき、癌のリスクを判定する工程を有していてもよい。
　例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程にて、サンプル内にスプライシングバリアントの存在が確認されれば「癌の危険性がある」と判定することができ、サンプル内に複数種類のスプライシングバリアントが存在することが確認されれば「癌の危険性が高い」と判定することができる。
　また、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程にて、サンプル内に特定のスプライシングバリアント（例えば、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ａ３、Ｏｃｔ４Ａ４、Ｏｃｔ４Ａ５、Ｏｃｔ４Ａ６、または、Ｏｃｔ４Ｂ５）の存在が確認されれば「癌の危険性がある」と判定することができ、サンプル内に特定のスプライシングバリアント（例えば、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ａ３、Ｏｃｔ４Ａ４、Ｏｃｔ４Ａ５、Ｏｃｔ４Ａ６、または、Ｏｃｔ４Ｂ５）を含む複数種類のスプライシングバリアントが存在することが確認されれば「癌の危険性が高い」と判定することができる。
　本実施の形態の癌の診断方法は、更に、生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有していてもよい。
　後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定し、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
　当該工程は、〔１－３．その他の構成〕にて説明した構成を用い、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、または、ＥＬＩＳＡ法に基づいて行うことが可能である。
　ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、および、ＥＬＩＳＡ法の具体的な方法は、周知の方法に従えばよい。
　本実施の形態の癌の診断方法は、例えば、以下の＜１＞または＜２＞の構成であってもよい。なお、以下の構成においてオステオポンチン遺伝子およびオステオポンチン蛋白質は、ａ型のスプライシングバリアント、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの何れであってもよいが、より高い効果を得るという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントであることが好ましい。
　＜１＞本実施の形態の癌の診断方法は、最初に、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現を検出し、その後に、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現が陽性であったサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する構成であってもよい。当該構成であれば、迅速に癌診断をすることができる。
　＜２＞本実施の形態の癌の診断方法は、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現、および、当該生体から採取されたサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を同時に検出する構成であってもよい。当該構成であれば、精度の高い癌診断をすることができる。
　＜１．Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始点の決定＞
　Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ヒトＰＡ－１細胞から、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１μｇのＴｏｔａｌ　ＲＮＡを、逆転写反応にかけた。３種類のリバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲ反応に用いた酵素は、ｐｒｉｍｅｓｔａｒ（Ｔａｋａｒａ社）であった。
　ＰＣＲ反応の増幅産物の電気泳動の像を図９に示す。
　ＰＣＲ反応の増幅産物をＴＡ－ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した後、当該増幅産物の塩基配列をシークエンサーにて確認した。その結果、当該増幅産物は、配列番号１（配列番号３）にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んでいた。
　＜２．プライマーセットの設計＞
　表１、および、図１に、各プライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に関する情報、および、各プライマーセットによって増幅されると考えられるＤＮＡの情報を記載する。
　下記プライマーセットのうち、Ｓｅｔ　Ａ１およびＳｅｔ　Ａ２は、上述したプライマーセット（α）に対応するプライマーセットであり、Ｓｅｔ　Ｂは、上述したプライマーセット（β）に対応するプライマーセットである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　＜３．プライマーセットの増幅特異性＞
　上述した各プライマーセットと、鋳型としてＯｃｔ４Ａ遺伝子のＡ型の転写産物に由来するｃＤＮＡ、または、Ｏｃｔ４偽遺伝子（具体的には、ＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４）と、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。
　ＰＣＲ反応は、タカラバイオ株式会社製のプライム・スターまたはエメラルドアンプを用い、フォワードプライマー２５０μＭ、リバースプライマー２５０μＭ、鋳型１０ｆｇまたは１０ａｇ、その他の成分として、ＮＴＰ、および緩衝液を含む、２０μＬの反応溶液を用いて行った。
　ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。
　本実施例では、各プライマーセットについて、同一の反応サイクルにて、ＰＣＲ反応を行った。つまり、６８℃にて２分間のアニーリングおよび伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。
　電気泳動の結果を図２に示す。
　プライマーセットとしてＳｅｔ　１を用いた場合、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子のみならず、Ｏｃｔ４偽遺伝子も検出（増幅）されることが明らかになった。
　プライマーセットとしてＳｅｔ　２、Ｓｅｔ　３、Ｌｉｅｄｔｋｅ－１、Ｌｉｅｄｔｋｅ－２、および、Ａｔｌａｓｉを用いた場合、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子のみならず、Ｏｃｔ４偽遺伝子も検出（増幅）されることが明らかになった。
　プライマーセットとしてＳｕｏを用いた場合、Ｏｃｔ４偽遺伝子を検出せずにＯｃｔ４Ａ遺伝子のみを検出できるが、Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡとｍＲＮＡとを区別できないことが明らかになった。更に、プライマーセットとしてＳｕｏを用いた場合、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型のスプライシングバリアント同士を区別できないことが明らかになった。
　プライマーセットとしてＳｅｔ　Ａ１、Ｓｅｔ　Ａ２、および、Ｓｅｔ　Ｂを用いた場合、Ｏｃｔ４偽遺伝子を検出せずにＯｃｔ４Ａ遺伝子のみを検出できること、および、Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡとｍＲＮＡとを区別できることが明らかになった。更に、これらのプライマーセットであれば、スプライシングバリアントを網羅的に検出できることが明らかになった。
　＜４．スプライシングバリアントの解析＞
　プライマーセットとしてＳｅｔ　Ａ１またはＳｅｔ　Ｂと、鋳型として、様々な細胞（癌細胞（具体的には、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＨＥＣ２６５、ＨＥＣ１、ＨＥＣ５０Ｂ、ＴＴＡ１、Ａ５４９、Ｓ２、ＰＡ１、または、ＨＥＫ２９３Ｔ）、正常細胞（具体的には、ＡＲＰＥ－１９、ＨＦＦ、ＨＵＶＥＣ、または、ＨＡｏＳＭＣ））から精製したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡと、を用いてＰＣＲ反応行った。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて、当該キットに添付のプロトコールにしたがって行った。また、ＰＣＲ反応は、上述した＜２．プライマーセットの増幅特異性＞に記載の条件にて行った。
　ＰＣＲ反応液を電気泳動に供し、電気泳動に用いたゲルからＰＣＲ増幅産物を切り出した。当該ＰＣＲ増幅産物を周知の方法にしたがって市販のベクターに挿入し、当該ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。大腸菌の形質転換体を培養および増殖させた後、当該大腸菌からベクターを精製し、当該ベクターに挿入されているＰＣＲ増幅産物の塩基配列を、市販のシークエンサーを用いて解析した。
　Ｓｅｔ　Ａ１を用いて増幅されたＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析した結果、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４Ａ以外に、新規なスプライシングバリアントとして、ｈＯｃｔ４Ａ１（配列番号２１）、ｈＯｃｔ４Ａ２（配列番号２２）、ｈＯｃｔ４Ａ３（配列番号２３）、ｈＯｃｔ４Ａ４（配列番号２４）、ｈＯｃｔ４Ａ５（配列番号２５）、および、ｈＯｃｔ４Ａ６（配列番号２６）を見出すことに成功した。
　Ｓｅｔ　Ｂを用いて増幅されたＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析した結果、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４ＢおよびｈＯｃｔ４Ｂ１以外に、新規なスプライシングバリアントとして、ｈＯｃｔ４Ｂ２（配列番号２７）、ｈＯｃｔ４Ｂ３（配列番号２８）、ｈＯｃｔ４Ｂ４（配列番号２９）、ｈＯｃｔ４Ｂ５（配列番号３０）、ｈＯｃｔ４Ｂ６（配列番号３１）、および、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ（配列番号３２）を見出すことに成功した。
　上述したスプライシングバリアントの構造の概略を、図３および４に示す。
　更に、表２および３に、各細胞で検出されたスプライシングバリアントの種類と検出されたクローンの数とを示す。得られたクローンの塩基配列を決定したところ、すべてＯｃｔ４遺伝子の転写産物であることが判明し、偽遺伝子は一つも含まれていないことを確認した。表２および３から明らかなように、癌細胞では、様々なスプライシングバリアントが発現していることが明らかになった。一方、正常細胞では、Ｏｃｔ４　Ｂｎｓタイプ以外のＯｃｔ４遺伝子の発現が、ほとんど観察されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　＜５．悪性度の高い癌細胞におけるＯｃｔ４遺伝子の発現＞
　プライマーセットとしてＳｅｔ　Ａ１またはＳｅｔ　Ｂと、鋳型として乳癌細胞であるＭＣＦ７または悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１から精製したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡと、を用いてＰＣＲ反応行った。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用い、当該キットに添付のプロトコールに従って行った。また、ＰＣＲ反応は、上述した＜２．プライマーセットの増幅特異性＞に記載の条件にて行った。その後、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。
　電気泳動の結果を図５に示す。なお、図５において、「Ｘ」は、Ｓｅｔ　Ａ１の試験結果を示しており、「Ｙ」は、Ｓｅｔ　Ｂの試験結果を示している。
　鋳型として乳癌細胞であるＭＣＦ７のｃＤＮＡを用いた場合、プライマーセットとしてＳｅｔ　Ａ１またはＳｅｔ　Ｂの何れを用いても、ＰＣＲ増幅産物の量が検出限界以下の量であった。一方、鋳型として悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１のｃＤＮＡを用いた場合、プライマーセットとしてＳｅｔ　Ａ１またはＳｅｔ　Ｂの何れを用いても、ＰＣＲ増幅産物が検出された（図５の１．４ｋｂｐのバンド（ｈＯｃｔ４Ａ）、および、１ｋｂｐのバンド（ｈＯｃｔ４Ｂ）を参照）。これらのことは、癌の悪性度と、Ｏｃｔ４遺伝子の発現強度とが、相関していることを示唆している。
　＜６．癌細胞の悪性度と癌細胞の遊走能との関係＞
　乳癌細胞であるＭＣＦ７と、悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１とを、別々に、シャーレ上に同じ細胞濃度（８×１０４個ｃｅｌｌ／ｃｍ２）にて捲き、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。培養を開始してから４８時間後に、シャーレ上に傷をつけ、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙを行った。
　図６に、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙの結果を示す。シャーレ上に傷をつけてから、１８時間後、４４時間後、６４時間後、および、８８時間後の癌細胞の様子を観察した結果、悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１は遊走能が高いが、悪性度の低い乳癌細胞であるＭＣＦ７は遊走能がほとんど無いことが明らかになった。
　＜７．Ｏｃｔ４遺伝子の発現が遊走能に及ぼす影響＞
　周知の方法にしたがって、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入した発現ベクターと、ｈＯｃｔ４Ａを挿入した発現ベクターとを作製した。なお、発現ベクターとしては、クローンテック株式会社製のｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターを用いた。
　ＭＣＦ７を、シャーレ上に細胞濃度（６．６×１０４個ｃｅｌｌ／ｃｍ２）にて捲き、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。培養を開始してから２４時間後に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて常法に従い遺伝子導入を行い、さらに培養を続けた。遺伝子導入後３６時間培養後にシャーレ上に傷をつけ、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙを行った。
　図７に、Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙの結果を示す。シャーレ上に傷をつけてから、２４時間後、および、１４４時間後の様子を観察した結果、ｈＯｃｔ４Ａを挿入した発現ベクターが導入されたＭＣＦ７は遊走能が有意に促進されたが、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入した発現ベクターが導入されたＭＣＦ７は、野生型ＭＣＦ７と同様に遊走能がほとんど無いことが明らかになった。
　＜８．発現するタンパク質に関する考察＞
　各スプライシングバリアント（具体的には、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ｂ、Ｏｃｔ４Ｂ１、Ｏｃｔ４Ｂ２、Ｏｃｔ４Ｂ３、Ｏｃｔ４Ｂｎｓ）のｃＤＮＡを市販の発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入し、当該ＣＯＳ７細胞を培養した。
　市販のキットを用いて培養後のＣＯＳ７細胞からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡに含まれているスプライシングバリアントのタイプを５’ＲＡＣＥ法により同定した。
　Ａ型スプライシングバリアント（具体的にはＯｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２）のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入した場合、Ｏｃｔ４ＡおよびＯｃｔ４Ａ２の場合はともにＯｃｔ４Ａのみの１種類の転写産物が検出されたのに対し、Ｏｃｔ４Ａ１の場合はＯｃｔ４Ａ１とその他サイズの小さいバンドが確認された。Ｏｃｔ４Ａの翻訳産物は３６０個のアミノ酸をもつ公知の蛋白質であり、Ｏｃｔ４Ａ１の翻訳産物はカルボキシル末端領域を大きく欠損した１６８個のアミノ酸を持つ新規蛋白質が生産されている可能性が明らかとなった。
　スプライシングバリアント（具体的には、Ｏｃｔ４Ｂ、Ｏｃｔ４Ｂ１、Ｏｃｔ４Ｂ２、Ｏｃｔ４Ｂ３、Ｏｃｔ４Ｂｎｓ）のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入した場合、いずれの発現ベクターにおいても、Ｏｃｔ４ＢおよびＯｃｔ４Ｂ５の２種類のスプライシングバリアントしか検出されなかった（図８のＢａｎｄ　１、および、Ｂａｎｄ　２参照）。
　このことから、細胞内では、スプライシングバリアントは細胞内で更なる構造変化を受け、その結果、Ｏｃｔ４Ｂ型のタンパク質としては、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質が主として生産されている可能性があると考えられる。
　Ｏｃｔ４ＢおよびＯｃｔ４Ｂ５の２種類のスプライシングバリアントでは、翻訳開始点と考えられるコドン、および、翻訳終了点と考えられるコドンが異なっており、これらのコドンに基づいて予測される翻訳産物であるタンパク質の大きさが異なっている。そして、実際に観察されるタンパク質の大きさは、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質の大きさに近いので、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質が主として生産されている可能性があると考えられる。
　＜９．短いプライマーに関する考察＞
　下記表４に記載の各プライマーセット（Ｓｅｔ　Ａ１－ｓｈｏｒｔ、Ｓｅｔ　Ａ２－ｓｈｏｒｔ）と、鋳型としてＯｃｔ４Ａ遺伝子のＡ型の転写産物に由来するｃＤＮＡ、または、Ｏｃｔ４偽遺伝子（具体的には、ＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４）と、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。
　ＰＣＲ反応は、タカラバイオ株式会社製のプライム・スターまたはエメラルドアンプを用い、フォワードプライマー２５０μＭ、リバースプライマー２５０μＭ、鋳型１０ｆｇまたは１０ａｇ、その他の成分として、ＮＴＰ、および緩衝液を含む、２０μＬの反応溶液を用いて行った。ＰＣＲ反応に用いた酵素は、ｅｍｅｒａｌｄ　ａｍｐ（Ｔａｋａｒａ社）であった。
　ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。
　反応サイクルとしては、５５℃にて１５秒間のアニーリング反応、７２℃にて２分間の伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。
　試験結果を図１０に示す。図１０に示すように、１７ｂａｓｅというプライマーの長さは、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を特異的に検出する上で、十分な長さであることが明らかになった。
　下記表４に記載の各プライマーセット（Ｓｅｔ　Ｂ－ｓｈｏｒｔ）と、鋳型として、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ－１、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ－２、Ｏｃｔ４Ｂ　ｃＤＮＡ　１０ｆｇ、または、Ｏｃｔ４Ｂ　ｃＤＮＡ　１０ａｇと、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。
　ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。
　反応サイクルとしては、５５℃にて１５秒間のアニーリング反応、７２℃にて２分間の伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。
　試験結果を図１１に示す。なお、図１１において、レーン「１」、「２」、「３」および「４」の各々は、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ－１、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ－２、Ｏｃｔ４Ｂ　ｃＤＮＡ　１０ｆｇ、および、Ｏｃｔ４Ｂ　ｃＤＮＡ　１０ａｇの各々を用いた場合の試験結果を示している。
　図１１に示すように、１７ｂａｓｅというプライマーの長さは、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を特異的に検出する上で、十分な長さであることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　＜１０．Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現との相関関係＞
　様々な、カルシノーマの細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＡ１、Ａ５４９）、正常な細胞株（ＡＲＰＥ－１９、ＨＦＦ、ＨＵＶＥＣ、ＨＡｏＳＭＣ）、および、正常な組織（monocyte、bone marrow）におけるＯｃｔ４遺伝子、および、オステオポンチン遺伝子の発現を、ＰＣＲ法によって確認した。なお、上述した細胞株および組織からのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、市販のキットを用いて、周知の方法にしたがって行った。
　Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認には、図１および表１に記載のプライマーセットのうちＳｅｔ　Ａ１（配列番号１、配列番号２）を用いた。
　一方、オステオポンチン遺伝子の発現の確認には、以下のフォワードプライマー（ＦＯ）およびリバースプライマー（ＲＶ）を用いた。
ＦＯ：5’－accatgagaattgcagtgatttgc－3’（配列番号４２）；
ＲＶ：5’－tcagtgaccagttcatcagattca－3’（配列番号４３）。
　オステオポンチンには、３種類のスプライシングバリアントが存在することが知られている（例えば、（ａ）J Gastrointest Surg（2015）19, 639－650、（ｂ）Cancer Res; 75（6） March 15, 2015, 963－973、（ｃ）Mol Cancer Res; 9（3） March 2011, 280－293、（ｄ）Oncogene, 2006, 25, 2192－2202、参照）。
　そこで、オステオポンチン遺伝子の発現の確認時には、ＰＣＲの増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して分離することにより、３つのスプライシングバリアントの何れが発現しているか確認した。なお、図１２にアガロースゲル電気泳動の像の一例を示す。図１２において、「ＳＰＰ１ａ」はａ型のスプライシングバリアントを示し、「ＳＰＰ１ｂ」はｂ型のスプライシングバリアントを示し、「ＳＰＰ１ｃ」はｃ型のスプライシングバリアントを示している。
　下記の表５に、試験結果を示す。なお、表５において、「－」は、陰性（アガロースゲル電気泳動にて、バンドが検出されない）であることを示し、「±」は、弱陽性（アガロースゲル電気泳動にて、薄いバンドが検出される）であることを示し、「＋」は、陽性（アガロースゲル電気泳動にて、濃いバンドが検出される）であることを示している。また、「ａ」は、ａ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示し、「ｂ」は、ｂ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示し、「ｃ」は、ｃ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示している。
　表５に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係があることが明らかになった。
　具体的に、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が確認されなかった細胞株および組織では、オステオポンチン遺伝子の発現もほとんど確認されなかった。
　Ｏｃｔ４遺伝子の発現が弱く確認されたＨＦＦでは、オステオポンチン遺伝子の発現も確認されたが、ｃ型のスプライシングバリアントの発現は確認されなかった。このことは、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、ａ型、ｂ型およびｃ型のスプライシングバリアントの発現とには高い相関関係があり、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、ｃ型のスプライシングバリアントの発現とには特に高い相関関係があることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　＜１１．オステオポンチン遺伝子のｃ型のスプライシングバリアントの発現の特異的な検出＞
　オステオポンチン遺伝子の３つのスプライシングバリアントのうち、ｃ型のみを特異的に検出することが可能であるか否か、検討した。
　ＰＡ－１細胞由来のｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマーとして後述するフォワードプライマー（ＳＳＰ１ｃ－ＦＯ）およびリバースプライマー（ＳＳＰ１ｃ－ＲＶ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。なお、当該ＰＣＲ反応では、９６℃にて３０秒間の変性反応、６０℃にて１５秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて６０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを３５サイクル繰り返した。
ＳＳＰ１ｃ－ＦＯ：5’－AAGTTCTGAGGAAAAGCAGAATGCTGTGTC－3’（配列番号４４）；
ＳＳＰ１ｃ－ＲＶ：5’－TTTAATTGACCTCAGAAGATGCAC－3’（配列番号４５）。
　なお、オステオポンチン遺伝子のｃ型のスプライシングバリアントには、エクソン４が存在しない。そこで、ＳＳＰ１ｃ－ＦＯの塩基配列として、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を用いた（図１３（ｂ）を参照）。
　試験結果を図１３（ａ）に示す。図１３（ａ）において、「ＲＴ＋」は、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いた場合の試験結果を示し、「ＲＴ－」は、逆転写酵素を用いない場合の試験結果を示している。
　図１３（ａ）に示すように、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を有するフォワードプライマーを用いれば、オステオポンチン遺伝子の３つのスプライシングバリアントのうちｃ型を特異的に検出し得ることが明らかになった。
　本発明は、癌の検出に利用することができる。

Claims (6)

  1. 　下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を備えていることを特徴とする癌検出キット：
    　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
    　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
  2. 　上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることを特徴とする請求項１に記載の癌検出キット。
  3. 　更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の癌検出キット。
  4. 　生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴とする、癌診断のためのデータの取得方法：
    　（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
    　（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
  5. 　上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることを特徴とする請求項４に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
  6. 　更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することを特徴とする請求項４または５に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
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