CN102648389B - 用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于确定目标样品的空间取向的装置和方法，该装置和方法可以用于自动对焦系统。该装置和方法通过将(a)从样品反射的辐射在辐射检测器上的辐射位置与(b)样品的位置关联来起作用，并且在一些实施例中，根据样品反射的辐射在检测器上的位置调节样品的位置、光学装置的位置、或其二者，以保持样品聚焦。

Description

用于动态确定样品空间取向并动态重新定位的装置和方法
本申请要求提交于2009年5月19日的美国申请No.61/179,498的权益，其整体为所有目的并入本文。
技术领域
本发明涉及光学分析领域并涉及自动对焦系统。
背景技术
诸如宽场荧光显微镜的自动成像系统通常用于不同领域中的灵敏检测。这些系统通常使用高数值孔径值和高倍放大光学器件来实现用户期望的分辨率和检测级别。
现有自动对焦系统通常包括执行初级聚焦并针对包括加载和样品扫描的各种操作保持对焦距离的装置。对焦距离通常被保持为约0.1-0.2微米的精度。这一级别的精度需要直接测量系统光学器件和样品平面之间的距离。
传统位置灵敏检测器利用来自两相或象限光电二极管的差分信号作为反馈，然后比较这些信号的相对强度以调节焦点。然而，这些差分信号无法用于确定物镜和样品之间距离，并且还会难以对具有某些视觉轮廓(例如，区域之间缺乏鲜明对比的轮廓)的某些样品保持自动对焦。
因此，本领域需要这样的系统和方法，其能够保持对象聚焦，而不会经受基于比较差分信号强度的现有自动对焦方法的缺点。如果这样的系统和方法能够在延长的时间段内保持这样的焦点，则这样的系统和方法的价值将进一步提高。
发明内容
为了满足所述挑战，本发明首先提供确定目标样品的空间取向的方法，包括：用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射目标样品的至少一部分；在辐射检测器上收集从样品反射的任何辐射的至少一部分；将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与目标样品的空间取向关联。
本发明还提供仪器，该仪器包括：样品台；辐射源，其能够用入射角为至少约5度的辐射光束照射设置在样品台上的目标；辐射检测器，其与设置在台上的目标光学通信，该辐射检测器能够收集从设置在样品台上的目标反射的任何辐射的至少一部分；能够将从设置在样品台上的目标反射的任何辐射在辐射检测器上的位置与目标的空间取向关联的装置。
还提供保持在目标样品上的自动光学聚焦的方法，包括：指定放大镜内的光学平面与目标样品之间的空间关系；用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射目标样品的至少一部分；在辐射检测器上收集从目标样品反射的任何辐射的至少一部分；将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与目标样品相对于放大镜光学平面的空间取向关联；改变放大镜的光学平面、样品或其二者的空间取向或其二者，以保持放大镜的光学平面与目标样品之间的该程式化的(programmed)空间关系。
本发明还包括自动对焦装置，其适当地包括：放大镜；样品台，该放大镜和该样品台中的至少一个能够倾斜、旋转、升高、降低或其任何组合；辐射源，其能够用以至少约5度的入射角倾斜的辐射光束照射设置在样品台上的样品；辐射检测器，其与设置在该台上的样品光学通信，该辐射检测器能够收集从设置在样品台上的该样品反射的任何辐射的至少一部分；能够将从设置在样品台上的该样品反射的任何辐射在辐射检测器上的位置与样品相对于放大镜的空间取向关联的装置。
附图说明
当结合附图阅读时，发明内容以及下面的具体实施方式将更好理解。为了解释发明的目的，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明不限于所公开的具体方法、组成和装置。另外，附图没有必要按比例绘制。在附图中：
图1示出根据本发明的示例性自动对焦单元；
图2示出本发明系统的长期稳定性，证明当系统开启时，物镜和样品之间的距离被很好的保持；
图3示出根据本发明制成的系统对所施加力的响应，其中由箭头指示的位置示出当100g负载被置于目标物体定位台上以及从其上取下时，本发明系统的动态响应——当“自动对焦”打开(即，激活)时，系统沿z方向调节物镜和/或高精度台的位置，以保持物镜和样品之间的预设距离，从而自动补偿由负载的放置引起的焦点偏移；
图4示出包括根据本发明的自动对焦系统的显微镜光路的框图；
图5示出距离测量的基于光学的方案，其中激光束相对于显微镜的物镜离轴传播，并从样品表面反射，物镜和样品平面之间的距离的改变引起激光束的偏转，投射的光斑位置通过辐射检测器(例如，CCD、CMOS或光电二极管装置)来跟踪，并且然后利用预定相关性直接转换为距离；
图6示出一个传感器校准方法，其中显微镜物镜和样品表面的位置相对于彼此的偏移引起传感器区域上反射光斑的位移，光斑位置的改变与物镜和样品之间的距离成线性比例，光斑位置用于自动对焦反馈控制回路；
图7示出根据本发明准备的聚焦图像的示例，其中图像荧光标记的DNA片段位于硅蚀刻纳米沟道中，自动对焦系统在实验持续时间(大约30分钟)内保持图像的焦点；
图8示出本发明的过程流程图，其示出了如下步骤：校准样品台，在辐射检测器上读取从样品反射的光束的位置，以及响应于阵列检测器上从样品反射的一个或多个激光束的位置，调节台、物镜或其二者的空间取向；
图9示出利用双光斑跟踪过程的本发明的示例性实施例。
具体实施方式
通过结合形成本公开一部分的附图和示例，参照以下具体实施方式，可以更容易理解本发明。应该理解，本发明不限于本文所描述和/或示出的具体装置、方法、应用、条件或参数，本文所用术语仅是出于以示例方式描述特定实施例的目的，而并非意在限制本发明。
如包括所附权利要求的说明书中所用，单数形式包括复数形式，提及特定数值至少包括该特定值，除非上下文明确另外指出。如本文所用，术语“多个”表示不止一个。当表达值的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当利用先行词“约”近似地表达值时，应该理解该特定值形成另一实施例。所有范围均为含端点且可组合的。
应该理解，为了清晰起见，在本文中分开的实施例的背景中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的背景下描述的本发明的各种特征也可以分开提供或以任何子组合的形式提供。另外，提及规定在范围中的值包括该范围内的各个和每一个值。
如本文所用，术语“空间取向”是指物体的物理位置以及该物体的角度、倾斜或其它特性。例如，目标相对于透镜的空间取向涉及目标和平面之间的距离、以及物体相对于透镜的倾斜。
如本文所用，术语“辐射检测器”是指能够检测电磁辐射的装置。这样的装置能够适合地检测激光辐射、光子、微波、可见光或其任何组合。电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、光电二极管、光子计数器、光电倍增管等等均为适合的辐射检测器。
在一些实施例中，辐射检测器能够检测两个或更多个单独的辐射光斑(光束)的位置，并且检测器可能能够检测三个或甚至四个单独的辐射光斑(光束)可能撞击在检测器上的位置。辐射检测器适当地能够确定撞击检测器的辐射的X-Y位置(例如，图5)。在一些实施例中，检测器能够辨析撞击检测器的一个或多个光斑(即，反射的辐射光束)的强度。
在一个实施例中，本发明提供确定目标样品的空间取向的方法。这些方法适当地包括利用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射目标样品的至少一部分。通常使用非零入射角。10、20、30、40、50、60或甚至更大度数的入射角也是适合的。最佳入射角将取决于用户的需要和被分析的目标的特性。
所述方法还包括：在辐射检测器上收集从样品反射的任何辐射的至少一部分，将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与目标样品的空间取向关联。所述收集可以通过例如CCD、CMOS、光电二极管或其它辐射检测器装置来完成。检测器适当地具有辐射检测元件的二维阵列，但检测器也可以具有一维的检测器元件集。图9示出了一个示例性系统，本文中将更详细地进一步描述该图。
辐射光束适当地为准直光束。激光束是尤其适合的辐射形式，但微波辐射和可见光也可以用于本发明。辐射的波长可以变化；如本文别处描述的，波长可以被选择为使得光束基本上不会干扰样品的视觉检查。
将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与目标样品的位置关联可以通过若干方式来完成。在一个实施例中，所述关联包括将(a)检测器上收集的反射辐射的位置与(b)当目标样品处于已知(或预设)的空间取向时从目标样品反射的辐射已知的照射在辐射检测器上的位置进行比较。
这种关联适当地通过例如选取目标样品并以各种取向或位置辐照该样品，并且针对每一个取向收集(在辐射检测器上的)该样品所反射的辐射来实现。这样，用户可以创建辐射检测器上与从各种空间取向的目标样品反射的辐射所撞击的位置对应的位置的库(也可以看作“映射图”)。用户也可以仅针对所有可能取向和位置的子集来收集数据，并且基于此子集数据，使用预测算法来使库数据集完整。
作为一个非限制性示例，可以发现用激光照射距显微镜物镜25mm的平坦样品会导致反射激光辐射在检测器的中心处撞击辐射检测器。然后，用户还会发现用激光照射距显微镜物镜15mm的相同样品会导致反射激光辐射在检测器的左上象限中撞击检测器。因此，如果用户随后将样品置于目标台上，辐照样品并发现反射激光辐射在检测器的中心撞击光电检测器，则用户将知道样品距显微镜物镜约25mm。
替代地，如果用户用激光照射样品并发现反射辐射在检测器的左上象限中撞击检测器，则将知道样品距显微镜物镜约15mm。然后，用户可以——手动或利用控制器——改变样品、显微镜物镜或其二者的取向，以将样品保持在正确的焦点中。在上述示例中，如果从样品到物镜的最佳焦距为13.5mm，则用户(或系统控制器)可以调节样品位置使得样品距物镜13.5mm。
图6示出根据本发明的一个示例性方法。该图示出反射辐射在激光传感器上撞击的位置(图中x轴所示)与显微镜物镜的偏移(图中y轴所示)之间的相关性。如非限制性图6所示，检测器上的光斑位置是物镜内平面与样品之间距离的线性函数。
将显而易见的是，利用本发明的方法，用户可以开发辐射检测器上与从一个或多个空间取向的目标样品反射的辐射对应的光斑位置的库(或映射图)。因此，用户可以通过以宽范围的空间取向(例如，距显微镜物镜的距离、样品相对于显微镜物镜的倾斜等等)中的每一个辐照样品来构建这样的库或映射图。在主动实验期间，用户可以将从目标反射并且然后撞击辐射检测器的辐射的位置与库或映射图中的数据进行比较，以估计目标的空间取向。然后，用户可以采取额外的调节目标空间取向的步骤，以回复目标的取向。
图5示出本发明的非限制性实施例。在该图中，在样品移动经过位置d1、d2和d3时，光束被样品(位于图顶部)反射，每一个位置距系统的物镜不同的距离。
在这三个位置中的每一个处，光束被样品反射并(分别)在位置(X1，Y1)、(X2，Y2)和(X3，Y3)处碰撞检测器。通过将这三个检测器位置列成表并将其与对应样品位置(d1、d2和d3)关联，用户可以构建数据库或表，即映射图，其将样品位置与在每一个位置处反射的辐射光束在检测器上的位置关联。通过利用该库，用户可以基于后续样品反射的光束的位置确定样品的位置，并可以相应调节焦点。
图5中的实施例可以如下操作。样品位置d1(和检测器反射点X1和Y1)对应于物镜上方10mm的位置。然后，将知道将入射光束反射到位置X1和Y1的稍后分析的样品在物镜上方10mm处。尽管图5示出单个光束，如本文别处所述，系统可使用多个光束。
在一些实施例中，辐射光束具有不会干扰对目标样品的视觉检查的波长。这种配置特别有用，因为其允许在观察目标的同时确定目标的空间取向。
本发明还包括用多个辐射光束照射样品的至少一部分，如图9所示。这甚至可以包括用两个、三个或甚至四个准直辐射光束照射样品，这继而为用户产生有关目标空间取向的额外信息。辐射可以经由波导、经由光纤、或通过其他类似手段传输。作为一个非限制性示例(本文中将进一步更详细地描述)，用多个光束辐照目标为用户提供有关位移、倾斜的信息或有关样品空间取向的其他信息。
所述方法还可以包括构建数据集(或映射图)，其涉及目标样品处于特定空间取向时，从目标样品反射的辐射已知照射在辐射检测器上的位置，该目标样品用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射。可以针对样品的两个或更多个空间取向如此处理数据。然后，用户可以将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与所述数据集进行比较，以估计样品的空间取向。
作为一个非限制性示例，用户可确定用激光照射距显微镜物镜25mm并相对于该物镜的法线倾斜45°的样品会导致反射辐射在该检测器的右下象限中撞击辐射检测器。用户还可确定用激光辐照距显微镜物镜35mm并相对于该物镜的法线转动55°的样品会导致反射辐射在该检测器的右上象限中撞击检测器。基于此信息，反射入射辐射以在右上象限撞击检测器的稍后分析的样品可能距显微镜物镜35mm，并且相对于该物镜的法线转动55°。然后，用户可以利用此信息来调节物镜、样品或其二者的位置或取向，以将样品保持在正确的焦点中。
尽管本文中的若干实施例描述了响应于检测器所接收的信号移动样品，应该理解，本发明系统的物镜或其它成像设备也可以响应于检测器所收集的信息而移动。
在一些实施例中，所述方法可以包括：指定光学分析装置内的平面与目标样品之间的空间关系。这是为了例如指定样品和显微镜物镜之间的最佳距离以保持该样品在焦点中。在其它实施例中，出于其它原因选择光学分析装置和样品之间的关系，诸如保持样品和分析装置之间的最小余隙。
所述方法还包括：响应于辐射检测器上收集的反射辐射的位置变化样品的空间取向，以保持光学分析装置内的平面与目标样品之间的程式化的空间关系。这样，用户可以保持在样品上的最佳聚焦。
作为非限制性示例，用户可以(为了成像目的)确定样品和显微镜物镜之间的最佳距离为25mm。然后，用户将此距离作为设定点设置到控制样品、显微镜物镜或其二者的空间取向的控制器中。随着样品分析的进行，激光或其它准直辐射被样品反射，反射的辐射撞击辐射检测器。然后，控制器将辐射在辐射检测器上撞击的位置与从各种已知空间取向的目标样品反射的辐射已知地撞击在辐射检测器上的数据集位置进行比较。基于此比较，控制器可以有效地(1)确定正被分析的样品的空间取向；(2)改变样品目标、显微镜物镜或其二者的空间取向，以保持将样品保持在最佳焦点中所需的25mm分开距离。
该过程示出于图8中，该图示出了本发明方法的阶梯式过程。如该图所示，用户可以调节台位置(沿z轴)，以使得台处于检测器的工作范围内。然后，用户可以用一个或多个光束辐照样品(例如，用激光)，然后在检测器上读取反射束斑的x-y位置。如果束斑尺寸在范围之外，则用户可以(手动或自动)调节光束功率，以使得光斑尺寸在工作范围内。
然后，用户可以使台准备运动。然后，可以通过调控台的移动和取向的控制器来使台运动，该控制器诸如PI或PID控制器。然后，检测器读取反射光束的位置，然后重新开始过程，使得台到达期望的位置以保持样品聚焦。所述过程可以实时“运行”，以调节(在台上的)样品位置以保持样品聚焦。
改变目标样品——或显微镜物镜——的空间取向可以包括升高、降低、倾斜、旋转等等。这样，系统能够在观察和分析期间实时调节样品(或分析装置)的位置。所述方法的额外的优点在于，主要依赖于从样品反射的辐射撞击在辐射检测器内的位置。这样，所述方法基于辐射撞击的位置，而没有必要基于该辐射的强度。
本发明还包括仪器。本发明所公开的仪器适当地包括：样品台；辐射源，其能够用入射角为至少约5度的辐射光束照射设置在样品台上的目标；辐射检测器，其与设置在台上的目标光学通信，该辐射检测器能够收集从设置在样品台上的目标反射的任何辐射的至少一部分；以及能够将从设置在样品台上的目标反射的任何辐射在辐射检测器上的位置与目标的空间取向关联的装置。
适合的样品台将是本领域技术人员已知的，可以包括能够调节空间取向市售台。在一些实施例中，台为电动的，并且可以沿Z轴方向平移。在其他实施例中，台能够沿X、Y或Z方向做受控运动。台还能够可控地倾斜。
适合的检测器包括例如CMOS、CCD、光电二极管、PMT等等。
本发明装置的辐射源包括激光、可见光、IR和UV辐射。其他辐射源也是可用的，但特别优选的是准直激光束。
本发明仪器还适当地包括光学分析装置，其能够与设置在样品台上的目标、与辐射源、或其二者光学通信。这样的装置包括(例如)显微镜、CCD等等。
能够控制光学分析装置、样品台或其二者的空间取向的控制器也适当地包括在本发明的仪器中。如本文别处所述，所述控制器适当地控制样品台的空间取向、光学分析装置的空间取向、或其二者。所述控制器适当地将被从辐射照射的样品反射的辐射撞击在辐射检测器上的位置与辐射检测器上的位置的数据集关联，所述辐射检测器上的位置与被处于一个或多个已知空间取向的从辐射照射的样品反射的辐射撞击在辐射检测器上的位置对应。
本发明还提供保持在目标样上的自动光学聚焦的方法。这些方法包括：指定(例如，通过程式化)放大镜内的光学平面与目标样品之间的空间关系；用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射目标样品的至少一部分；在辐射检测器上收集从目标样品反射的任何辐射的至少一部分；将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与目标样品相对于放大镜的光学平面的空间取向关联；改变放大镜的光学平面、样品或其二者的空间取向或其二者，以保持放大镜的光学平面与目标样品之间的程式化的空间关系。在一些实施例中，本发明能够支持约200nm的聚焦范围。本发明可以适当地将对焦距离保持在微米范围内。
如本文别处所述，所述照射适当地包括将目标样品曝露于激光或其它辐射。激光辐射的频率适当地不干扰对样品的光学分析或检查，并且其功率适当地不损坏样品，但也足以使得从样品反射的辐射的大小能够被辐射检测器检测到。在一些实施例中，激光功率在几十或几百μW范围内。特定应用的最佳激光功率将容易地由本领域技术人员确定，并将取决于所使用的辐射(光子)传感器、样品的特性和其它条件。
在一些实施例中，诸如在例如图5中所示的，所述照射和收集可以通过放大镜的光学平面执行。激光辐射适当地相对于放大镜离轴，但在一些实施例中，激光辐射可以相对于放大镜同轴。
该方法还包括：通过将(a)辐射检测器上收集的反射辐射的位置与(b)样品相对于放大镜处于特定空间取向时从样品反射的辐射已知照射在辐射检测器上的位置进行比较，来将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与样品相对于放大镜的位置关联。这一程序在本文别处额外有详细的描述，例如在图5和图6中。
在一些实施例中，该方法包括：构建数据集(或“位置映射图”)，其包括对于目标样品的两个或更多个空间取向，当目标样品相对于放大镜的光学平面处于特定空间取向时，从目标样品反射的辐射已知照射在辐射检测器上的位置，该目标样品用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射。
这使用户能够建立与样品的宽范围空间取向(即，位置和倾斜/姿态)对应的辐射检测器位置的完整映射图或列表，因此为用户提供最大可用信息，利用这些信息通过升高、降低、倾斜、旋转等来当需要时调节样品、分析装置或其二者的位置。
所述关联可以包括：将辐射检测器上收集的反射辐射的位置与所述库进行比较。在一些实施例中，本发明所公开的自动对焦方法包括用两个或更多个准直辐射光束照射目标样品的至少一部分；如前所述，用多个光束辐照样品为用户提供有关样品的倾斜或其它取向特性的额外信息。
本发明还包括自动对焦装置。这些装置适当地包括：放大镜；样品台，放大镜和样品台中的至少一个能够倾斜、旋转、升高、降低或其任何组合；辐射源，其能够用以至少约5度的入射角倾斜的辐射光束照射设置在样品台上的样品；辐射检测器，其与设置在台上的样品光学通信，辐射检测器能够收集从设置在样品台上的样品反射的任何辐射的至少一部分；能够将从设置在样品台上的样品反射的任何辐射在辐射检测器上的位置与样品相对于放大镜的空间取向关联的装置。
在图4中示出了代表性装置的框图。在图5中示出了代表性装置的过程流程图。
在一些实施例中，辐射检测器包括电荷耦合器件或其它光电检测装置。适合的放大镜包括例如显微镜等。辐射源适当地为激光。
如本文别处所述，该装置还适当地包括控制放大镜的空间取向的控制器、控制样品台的空间取向的控制器、或其二者。在一些实施例中，控制器调控台和放大镜二者的空间取向。
在一些实施例中，控制器可以包括嵌入式固件。此固件适当地适于提供无误差闭环反馈控制。该控制适当地能够以大约200Hz的更新率从辐射检测器(传感器)读取基本无误差的位置，其可以包括：(a)反射激光光斑的自动搜索；(b)消除可能的误读的鲁棒算法；(c)自适应低通数字滤光器；(d)对激光功率的反馈控制，以补偿反射差异(例如，最高达300％)；(e)从不可预测状态恢复。
可以使用PID控制器。这样的控制器适当地适应成功读取周期，由此(a)响应于样品间隔和误差值的改变自动调节PID系数，并且(b)利用子步控制对Z轴移动通过成熟算法调节焦点定位。
可以使用算法来持续监控运动上限和下限，以防止物理损坏物镜或其它仪器。这还可通过防止台或系统光学器件的不期望运动的物理止动器来完成。
系统可被构造为当系统不在聚焦范围内时关闭辐射源(例如，激光)。过程参数可存储在装置的非易失性存储器中，并且在启动之后调用。在一些实施例中，该装置包括能够将辐射光束分割为多个辐射光束的分束器。分割适当地通过反射镜、滤光器、棱镜等来完成。
除了别的以外，公开的发明的一些优点包括：(1)能够以高放大因子在亚微米精度内在物体表面处聚焦并将聚焦位置保持在物体表面处；(2)适应具有显著不同的表面反射性质的目标；(3)能够实时地自动工作；(4)能够动态地控制高精度电动定位台(例如，能够沿Z方向移动的台)以在XY台运动期间自动聚焦目标物体；(5)能够使用不同的波长来进行自动对焦，以避免干扰放大镜(例如，荧光显微镜)的光路；(6)大工作范围，以充分适应机械容差和目标物体视场定位的不确定性。现有技术无法解决本发明的这些方面。
本发明尤其适合于分析在设置在基底上的一个或多个结构内前进的移动对象(例如，高分子)。本发明还适合于分析可能在分析过程中从一个位置移动或被移动到另一位置的动态或演化的对象(例如，生物样品)。
尽管本发明适合于分析动态对象，但本发明也可用于动态环境，其中环境条件会使保持样品聚焦面临挑战。例如，在振动是关注问题的环境中(例如，处于城市环境中的实验室)，本发明可以用于通过响应于环境振动实时调节样品、物镜或其二者的位置来保持样品聚焦。
在本系统的一个实施例中，红外激光二极管光束相对于显微镜物镜离轴传播(例如，图5)，并以大入射角引导到样品表面。反射光束返回穿过相同的物镜，并被位置灵敏检测器，例如电荷耦合器件(CCD)检测。检测器表面上的反射光斑的位置与显微镜物镜(或某些其他图像收集器)和样品反射表面之间的距离成比例。然后，微控制器适当地使用来自检测器的读数以向物镜的z台提供反馈，该台继而适当地以高精度和准确性移动以保持对焦距离，如图8所示。
作为一个示例，用户可以将样品置于焦点上，然后记录从聚焦样品反射的光束碰撞检测器的位置。然后，用户可以处理样品(例如，向多孔(cellular)样品添加试剂、加热多孔样品、等等)，然后在处理期间使用连接至电动样品台(或光学物镜)的电动控制器来使样品(或物镜)移动或重新取向，使得从样品反射的光束继续在与样品的聚焦位置对应的位置处碰撞检测器。如本文别处所解释的，所述系统可在样品处理或分析期间补偿环境振动(例如，由经过的车辆引起的振动)，以保持样品聚焦。
在一些实施例中，微控制器使物镜二维或三维移动。这可包括升高、下降、旋转、倾斜或在X-Y平面内移动。
不同于传统方法，本发明不利用对光电二极管区段上的光斑强度变化的检测。相反，本发明通过二维传感器(例如，CCD器件)利用多目标跟踪技术，其测量一个或多个光斑在整个传感器表面上的实际XY位置。在一些实施例中，检测器同时跟踪两个、三个或四个反射光斑并提供其绝对定位和尺寸信息；图9示出针对两个光束的这一过程。
此方法相比于现有替代方式具有许多优点。首先，本发明方法包括多光斑跟踪，其对杂质和物体结构所引起的反射和散射的局部变化基本上不敏感。其次，本发明所使用的聚焦信息直接涉及从物镜到样品反射表面的样品距离。另外，本发明以＜10nm的精度提供相对宽的线性检测范围，该范围可以为约50μm。
当使用多光斑跟踪模式时，本发明还使台或放大镜的定位精度增加，因为这样的定位根据来自多光斑的数据(即，反射辐射)进行调控，继而改善定位精度。本发明还允许用户使用相对低的激光功率(例如，当从玻璃/空气界面反射时，＜200μW)，以匹配光学传感器的要求。这使用户能够在执行分析时消耗较少功率，并且还减少由入射辐射在样品中引起的任何改变。
本发明还允许使用单个检测器来用于多光斑跟踪，这继而简化了用户的设备要求。另外，二维空间中的反射辐射光斑的位置和轨迹(例如，图9)提供关于样品相对于物镜平面的距离和倾斜的信息。本发明还使能排除模拟信号(从CCD矩阵检测器的读数是数字的，因此较少受电伪像的影响)，这导致从给定样品提取更鲁棒的数据。最后，本发明还提供简化的样品对准，因为可以利用来自反射辐射光斑的信息手动或自动执行样品对准。
自动对焦系统可以适当地包括标准的高分辨率光学部件，包括激光器。该激光器适当地聚焦于物镜的后焦平面中；反射光束被非球面透镜汇集以在传感器表面检测器(例如，CCD)上提供锐聚焦。在一些实施例中，激光束被空间滤光以最小化光束轮廓的变化，如附图中解释的。
图1示出根据本发明制成的实际自动对焦单元。如图所示，该单元包括激光单元和光学器件，其排列为使得激光束成一定角度穿过光学器件入射到样品(标有“入射”的光束)，并被样品向光学检测器反射(标有“反射”的光束)，在这种情况下光学检测器为CCD。通过利用反射光束撞击CCD检测器处的坐标，系统将那些坐标转换为表示物镜相对于样品的位置的数据集，并可相应地调节物镜和样品的相对位置。
图2示出本发明防止随时间推移监控样品时“漂移”的能力。如该图所示，当本发明的自动对焦系统关闭时，显微镜系统在时间段(60分钟)内显示出“漂移”。此“漂移”可能需要实验员对非自动对焦系统重新对焦，即使该系统无人照看仅几分钟；如图2所示，如果系统无人照看，则系统可经历相对于初始聚焦设置的相当大偏差。相比之下，图2还示出本发明激活时可在相同时间段(60分钟)内保持对对象的稳定聚焦，而在该时间段内未激活系统显示出“漂移”。
图3示出本发明响应于外部刺激的能力。如该图左侧中所示，当系统经受施加的力时，本发明实时地自动恢复对对象的聚焦。相比之下，示出自动对焦关闭时的系统行为的右侧，证明没有自动对焦的系统在施加外部力之后没有恢复聚焦。这证明系统在振动或其它外部力(例如，经过的车辆)使保持对对象的正确聚焦受到挑战的环境中的实用性。
图4示出一个样品的本发明非限制性实施例。如该图所示，通过光源和激光二者来照射样品。激光穿过显微镜物镜并经由物镜从样品反射回，反射的激光束被多目标CCD传感器或其它光学检测器收集。
反射镜、滤光器和分束器均可根据需要(单个地或彼此组合)使用以控制激光(和激励)辐射的路径。优选地，一个或多个控制器将CCD或其它检测器上激光或其它辐射撞击器件的位置与样品和物镜的相对位置关联，并调节样品、物镜或其二者的位置以保持正确聚焦。
如图所示，使用在图右上所示的激励照明器来照射样品，照明穿过分色镜并被其反射。图中示出激光和辐射检测器(CCD)；如本文别处所述，激光光束撞击样品并被样品反射，然后反射的光束被CCD单元检测。CCD单元上“光斑”的位置将随着样品位置而变化，用户可以根据CCD单元所收集的信息调节样品的位置或取向。这可通过诸如控制器的自动化系统来完成，该自动化系统继而能够实时地调节样品位置。
如本文别处所述，本发明在自动对焦操作中可使用两个或更多个激光束，如非限制性图9所示。第一激光束可以仅提供例如有关样品和物镜在Z轴上的相对位置的信息。然后，可以照射样品的不同于第一激光束的部分的第二激光束可提供有关样品相对于物镜的倾斜的额外信息或有关样品相对于物镜的XYZ取向的信息。然后，控制器将从光学检测器收集的每一个激光束聚集的信息与样品相对于物镜的位置和取向关联，并且然后相应地调节样品台、物镜或其二者。
在图9中，示出多个光束相对于物镜的光轴离轴传播，并被样品反射，反射光束撞击检测器(示出于图9右下)。
该图的左侧示出使样品平面相对于检测器垂直偏移的影响(新的样品位置由图9左上处的虚线示出)。如图9的左侧区域所示，当样品向上(即，远离检测器)移动时，检测器上的光斑从其原始位置(分别由1a和2a示出)偏移至更靠近检测器中心的新位置(分别由1b和2b示出)。
图9右侧示出样品平面倾斜对系统的影响。如该图所示，样品平面从其初始取向(由图9右上处的水平实线示出)向新的、倾斜的取向(由图9右上处的虚线示出)倾斜。如该图所示，检测器上的光斑从其原始位置(分别由3a和4a示出)偏移至检测器上的新的不同的位置(分别由3b和4b示出)，因此使用户能够解决样品的重新取向。
如图9所示，样品的不同移动(即，偏移对倾斜)导致不同的光斑偏移。因此，通过跟踪双光斑，用户可以区分(并解决)样品的偏移(即，沿着一个或多个轴平移)和倾斜。

Claims (16)

1.一种保持在目标样品上的自动光学聚焦的方法，包括：
指定放大镜内的光学平面与目标样品之间的程式化的位置和角度关系；
用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射所述目标样品的至少一部分；
在辐射检测器上收集从所述目标样品反射的任何辐射的至少一部分；并且所述照射和收集步骤通过所述放大镜的光学平面执行；
将所述辐射检测器上收集的反射辐射的位置与所述目标样品相对于所述放大镜的所述光学平面的位置和角度取向关联；
改变所述放大镜的所述光学平面、所述目标样品或其二者的位置和角度取向，以保持所述放大镜的所述光学平面与所述目标样品之间的所述程式化的位置和角度关系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中照射包括将所述目标样品曝露于激光。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述辐射检测器上收集的反射辐射的位置与所述目标样品相对于所述放大镜的位置关联包括：将(a)所述辐射检测器上收集的反射辐射的位置与(b)所述样品相对于所述放大镜处于特定空间取向时从样品反射的辐射已知照射在所述辐射检测器上的位置进行比较。
4.根据权利要求1所述的方法，其中改变所述放大镜的所述光学平面、所述目标样品或者其二者的位置和角度取向包括升高、降低、倾斜、旋转或其任何组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述辐射光束具有不会干扰所述目标样品的视觉检查的波长。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括：用两个或更多个准直辐射光束照射所述目标样品的至少一部分。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括构建数据集，所述数据集包括对于所述目标样品的两个或更多个空间取向，当所述目标样品相对于所述放大镜的所述光学平面处于特定位置和角度取向时，用以至少约5度的入射角倾斜的至少一个辐射光束照射所述目标样品，从目标样品反射的辐射已知照射在所述辐射检测器上的位置。
8.根据权利要求7所述的方法，其中关联包括将所述辐射检测器上收集的反射辐射的位置与数据集进行比较。
9.一种自动对焦装置，包括：
放大镜；
样品台，所述放大镜和所述样品台中的至少一个能够倾斜、旋转、升高、降低或其任何组合；
辐射源，所述辐射源能够用以至少约5度的入射角倾斜的辐射光束通过所述放大镜的光学平面照射设置在所述样品台上的样品；
辐射检测器，所述辐射检测器与设置在所述样品台上的所述样品光学通信，所述辐射检测器能够通过所述放大镜的所述光学平面收集从设置在所述样品台上的所述样品反射的任何辐射的至少一部分；
装置，所述装置能够将从设置在所述样品台上的所述样品反射的任何辐射在所述辐射检测器上的位置与所述样品相对于所述放大镜的位置和角度取向关联。
10.根据权利要求9所述的自动对焦装置，其中所述辐射检测器包括电荷耦合器件。
11.根据权利要求9所述的自动对焦装置，其中所述放大镜包括显微镜。
12.根据权利要求9所述的自动对焦装置，其中所述辐射源包括激光。
13.根据权利要求9所述的自动对焦装置，还包括控制所述放大镜的位置和取向的控制器。
14.根据权利要求9所述的自动对焦装置，还包括控制所述样品台的位置和取向的控制器。
15.根据权利要求9所述的自动对焦装置，还包括能够将所述辐射光束分割为多个辐射光束的分束器。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，当存在环境振动或其它外力时，保持所述放大镜的所述光学平面与所述目标样品之间的程式化的所述位置和角度关系。
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