CN102643846B

CN102643846B - 桑树查尔酮异构酶基因及应用

Info

Publication number: CN102643846B
Application number: CN 201210119487
Authority: CN
Inventors: 余茂德; 李军; 刘长英; 赵爱春; 王茜龄; 张琼予; 金筱耘; 吕蕊花; 吴存容
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2012-04-23
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2032-04-23
Also published as: CN102643846A

Abstract

本发明公开了一个来源于桑树的查尔酮异构酶基因MaCHI的序列、克隆方法及应用。该基因全长2112bp，含4个外显子和3个内含子，开放阅读框（ORF）全长为660bp，编码219个氨基酸，包括290bp的3′端非编码区。该基因为植物类黄酮合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将其导入桑树中，实现过表达，可提高桑树各组织中类黄酮的含量。该发明还可以应用到其他植物中，改变植物体内类黄酮的含量及种类，降低从植物中提取类黄酮的成本，有利于促进类黄酮物质在医药产业中的开发利用。

Description

桑树查尔酮异构酶基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及桑树类黄酮化合物生物合成关键基因查尔酮异构酶基因及其应用。

背景技术

类黄酮是一类重要的植物次生代谢物质，是由两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物，小部分以游离形式存在，大部分与糖类合成苷类，以配基形式存在。桑树中类黄酮化合物种类丰富、分布广泛，主要有花色素、黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类等四大类，药理研究证明桑树类黄酮化合物具有良好的抗氧化、降血糖、抗病菌、降血压、降血脂等功能。类黄酮合成途径中，查尔酮异构酶基因CHI是极为关键的限速酶，控制类黄酮的合成和组分分化，因此桑树查尔酮异构酶基因MaCHI可应用于桑树类黄酮生物合成的调控。

发明内容

本发明的目的之一在于提供桑树查尔酮异构酶基因核苷酸全序列、桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框ORF序列及3′端非编码区、桑树查尔酮异构酶基因编码的氨基酸序列，以及在此序列基础上进行密码子优化或点突变所产生的与原始序列相似度在90%以上的序列。针对桑树中类黄酮含量较低、提取成本高的困难，提供一个调控桑树类黄酮生物合成的基因以及在转基因植物中的应用。

本发明所述的桑树查尔酮异构酶基因MaCHI全长的克隆，依次通过以下步骤实现：

1）根据蔷薇科植物草莓或苹果的查尔酮异构酶基因保守序列设计兼并引物，以桑树叶片基因组为模板，扩增桑树查尔酮异构酶基因的保守区域；

2）基于获得的桑树查尔酮异构酶基因的保守区域设计基因特异引物，采用接头PCR获得保守区域的侧翼序列；

3）采用软件sequencher（http://genecodes.com/）将获得的侧翼序列与保守区域序列进行拼接，采用NCBI网站的blastx程序预测拼接序列中含有的基因开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列；

4）以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框（ORF），并连接到pMD19-T Vector（TaKaRa），挑选阳性克隆并测序。

本发明同时提供桑树查尔酮异构酶基因在桑树中的应用，即：采用CaMV35S启动子、35SPolyA以及桑树查尔酮异构酶基因MaCHI构建过表达查尔酮异构酶基因的植物表达载体，并采用农杆菌感染桑树丛生芽的方式获得转基因植株，具体步骤如下：

一、植物表达载体的构建：

1）以pCMBIA2301质粒为模板，采用PCR法分别扩增得到35S启动子及35SPolyA片段，以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因MaCHI片段；

2）将各片段分别插入植物表达载体pCMBIA2301的相应酶切位点中，构建成35S启动子-CHI-35SPolyA的表达盒，并进行序列测定；

二、桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的过表达：

1）利用冻融法将植物表达载体转入农杆菌，采取PCR法鉴定阳性克隆；

2）以桑树种子为材料进行组织培养获得丛生芽，构建具有相同遗传背景的无性繁殖系；

3）采用含植物表达载体的农杆菌感染丛生芽，获得转基因植株；

4）根据标记基因的序列设计引物对转基因苗子进行PCR检测；

5）以槲皮素为标准品，采用高效液相色谱（HPLC）技术检测转基因苗与对照组类黄酮含量的变化。

上述基因侧翼序列的克隆中，接头PCR为依赖于衔接头的侧翼序列分析方法。上述植物表达载体的构建中，CaMV35S启动子是花椰菜花叶病毒启动子，一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中进行过量表达。35SPolyA为35S的终止序列。载体pCMBIA2301是目前常用的植物双元表达载体，含卡那的抗性以及Gus标记基因。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的应用，将该基因应用于真核及原核表达。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于过量表达提高桑树类黄酮的含量。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于抑制查尔酮异构酶基因的表达获得新的转基因株系。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于其他植物品种的转基因。

附图说明

图1为MaCHI保守区域PCR电泳图。M：Trans2000；1：MaCHI保守区域片段扩增

图2为MaCHI侧翼序列的扩增电泳图。M：Trans2000；1：5′端侧翼序列扩增；2-4:3′端侧翼序列扩增

图3为MaCHI全长扩增电泳图。M：Trans2000；1：ORF全长PCR扩增；2：基因全长基因组扩增

图4为MaCHI基因结构图。黑色长方形：外显子；直线：内含子；白色长方形：3′端非编码区

图5为转基因植株的PCR检测图。0：阴性对照；M：Trans2000；1-7：为转基因植株

图6为转基因植株黄酮类物质含量（%）。CK：对照植株；1-7：转基因植株

本发明的优点是：

本发明为类黄酮合成代谢路径中第一个关键酶基因，将桑树查尔酮异构酶基因（MaCHI）采用基因工程的方法，导入桑树中，实现过表达，可提高桑树各组织中类黄酮的含量（详见实施例）。此外，该发明还可以应用到其他植物中，改变植物体内类黄酮的含量及种类，降低从植物中提取类黄酮的成本，有利于促进类黄酮物质在医药产业中的开发利用。

具体实施方式

实施例1：桑树查尔酮异构酶基因（MaCHI）全长的克隆

1）以桑树中山5801（华东蚕业研究所，顾青虹，1958）为材料（也可以其它公知公用的桑树品种为材料），分别提取嫩叶基因组和总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA；

2）根据蔷薇科植物的草莓或苹果的查尔酮异构酶基因CHI序列，设计兼并引物P1-F(5′>ACTATAGGGCACGCGTGGT<3′)和P1-R（5′>GAYTCVGACTCCARDACYGC<3′），以中山5801基因组DNA为模板，扩增得到长1729bp的基因片段（图1），连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序；

3）根据步骤2）获得的基因片段核苷酸序列，分别设计两条5′端特异引物upGSP1（5′>CATGCAGAGTCAATAGGACT<3′）、upGSP2（5′>CTCTAAAGAACTCGACGGACTCC<3′）以及3′端特异引物downGSP1（5′>GCTTTTCCAAAGATGAATCCATA<3′）、downGSP2（5′>GATGAATCCATACCAGAAAAAGAG<3′）；

4）合成衔接头Adaptor 1（5'>PO3-ACCAGCCC-NH2<3'）和Adaptor 2（5'> GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT<3'），根据Adaptor 2设计两条接头特异序列AP1（5′>GTAATACGACTCACTATAGGG<3′）和AP2（5′>ACTATAGGGCACGCGTGGT<3′），衔接头经高温退火处理后，分别与经限制性内切酶EcoRⅤ、HaeⅢ和ScalⅠ消化后的基因组DNA相连接，使用引物AP1 和up-GSP1进行5'端序列第一轮扩增，AP1 和down-GSP1进行3'端序列第一轮扩增；使用引物AP2和up-GSP2进行第二轮5'端序列扩增，使用引物AP2和down-GSP2进行3'端序列第二轮扩增，获得基因侧翼片段（图2），将片段连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序；

5）采用软件Sequencher（http://genecodes.com/）将步骤4）获得的侧翼序列与步骤2）获得的基因片段序列进行拼接，采用NCBI网站的blastx程序预测拼接序列中含有的基因开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列，设计引物P-2F(5′>ACCAACGTCCTCAACAAAAACCG<3′)和P-2R（5′>CTAATTTGTTTCTGCAGGGCAGG<3′），以桑树叶cDNA为模板，扩增出开放阅读框ORF（图3）。根据NCBI报道的EST序列gi171462011和gi171462735对比分析，该基因具有290bp的3'端非编码区。

实施例2：植物过表达载体的构建

1）分别设计35S启动子、35SPolyA以及桑树查尔酮异构酶基因MaCHI片段的特异引物，并添加酶切位点及保护碱基，具体序列如下：

35S-F： 5′>CGGGGTACCCTGTCGTGCCAGCTGCATTA<3′

35S-R： 5′>AAGGGCGCGCCGCATGGTCGATCGACAGATCTGCG<3′

CHI-F： 5′>AAGGGCGCGCCGATGGCTCTTACGACAGTCGC<3′

CHI-R： 5′> GGATTAATTAAGGTCTTTTGTCTCTTTAAGCAG<3′

35spolyA-F：5′>GGATTAATTAAGGGTATCGCCGCTCCCGATTC<3′

35spolyA-R：5′>CGCGGATCCACGCCGAATTAATTCGGGGG<3′

2) 以载体pCMBIA2301为模板扩增CaMV35S启动子和35SPolyA片段，以桑树cDNA为模板扩增

得到桑树查尔酮异构酶基因MaCHI片段，扩增片段分别插入pMD19-T Vector载体中测序；

3）基于步骤2)构建的3个T克隆采用Kpn I/Asc I酶切获得CaMV35S启动子，采用Asc I/Pac I酶

切获得桑树查尔酮异构酶基因MaCHI片段，Pac I/BamH I酶切获得35SPolyA片段，将三个片段与经Kpn I/BamH I消化的pCMBIA2301相连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆并进行序列测定，构建成植物表达载体pCMBIA2301-35S-CHI-35SPolyA。

实施例3：桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的过表达

2）选取桂优62^#桑种子，经过5天的培养后采用0.1%升汞消毒处理，然后切取子叶和下胚轴接种于丛生芽诱导培养基中，放置在光照培养箱中，温度为25±2℃，光照强度为2000 lx，光照12 h，黑暗12 h，构建具有相同遗传背景的无性繁殖系；

3）将农杆菌阳性克隆在28℃、200 rpm的条件下扩大培养至OD600为0.5-1.0，然后4 000 rpm离心10 min收集菌体，并用1/2 MS液体培养基洗涤两次，菌体最后悬浮于1/2 MS液体培养基中，调节OD600为0.8，使用前4h加入乙酰丁香酮（AS），使其终浓度达到100μmol·L^-1；

4）除去丛生芽多余的叶片，保留顶端的分生组织，浸入步骤3）制备好的农杆菌菌液中，25℃摇床轻微振荡15 min，取出丛生芽，用无菌滤纸吸干多余的菌液，将浸染过的丛生芽接种于铺有无菌滤纸的增殖培养基上进行共培养，其中滤纸用共培养的条件为25℃±2℃暗箱恒温培养3d；

5）丛生芽共培养3 d后取出，置于无菌水中，室温条件下100 rpm摇床振荡30 min，其间更换2次无菌水进行丛生芽的脱菌处理。将脱菌后的丛生芽接种于含有200 mg·L^-1 Cef和25 mg·L^-1 Kan的分化培养基中，25℃±2℃，12 h光照/12 h黑暗的条件下进行培养，诱导新的丛生芽的分化。10 d后转入含有200 mg·L^-1 Cef和50 mg·L^-1 Kan的筛选培养基中进行抗性芽的筛选，每20 d转接一次，期间如果有绿色的丛生芽分化，则取出并切取绿色的丛生芽接种于上述筛选培养基中进行抗性芽的增殖，待增殖的绿色丛生芽长至2-4 cm时，转入含有200 mg·L^-1 Cef和25 mg·L^-1 Kan的生根培养基中诱导丛生芽的生根。

6）分别提取对照组与转基因植株叶片的基因组DNA，根据卡那抗性基因序列设计特异引物NPT II-F：5′- TACCGTAAAGCACGAGGAAGC-3′，NPT II-R：5′- TATGACTGGGCACAACAGACA -3′，以提取的基因组为模板进行扩增（图5），条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，运行30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；

7）分别取对照组与转基因植株叶片低温冷冻干燥，使水分小于8％，制成干粉。精确称取干粉1.0g，置于 100mL容量瓶中，加入70％乙醇30mL，浸泡24h。超声波提取30min，过滤，滤液用70％乙醇定容于100mL容量瓶中，得到黄酮提取液，待用。

8）桑树类黄酮的高效液相色谱HPLC检测（图6）。采用Shimadzu ODS C18柱(150mmX 6.0 mm，5μm)，流动相为V_甲醇：V_水(0.3％磷酸)=55：45，流速为1 mL·min^-1，紫外检测器(370 nm)。以槲皮素为标准品，在0.0100～0.2000g·L^-1范围内，相关系数为0.9995，RSD为0.75％，每个样品进行三次重复，实验结果如下表：

株系	含量1	含量2	含量3	平均值	标准误差
						CK	2.8845	2.9506	3.1025	2.9792	0.0790
1	3.6599	3.5784	3.6025	3.6136	0.0296
						2	3.7002	3.6958	3.7154	3.7038	0.0073
3	3.7405	3.8132	3.8083	3.7873	0.0287
						4	3.5035	3.4998	3.5001	3.5011	0.0015
5	3.8211	4.0048	3.9541	3.9267	0.0671
						6	3.6614	3.6254	3.5867	3.6245	0.0264
7	3.3017	3.2828	3.3799	3.3215	0.0364

转基因植株黄酮类物质含量（%）

序列表

序列表一：

西南大学

桑树查尔酮异构酶（MaCHI）基因核苷酸全序列

1

2112

DNA

桑树（Morus alba L）

1

1 ATGGCTCTTACGACAGTCGCCGGAGTTCAGGTCGAGATAGCCACGTTCCCGCCGGCGGCG

61 ACGCCTCCGGGCTCCGACAAGACTCTGTTTCTTGGCGGTGCAGGTGAGTGTAAAGCGTGA

121 TTTGTAAAGTGTTAAAAGTGGAAACGACGGTTTTTTGTTTCTTTGTCGTTTTCACATTTA

181 TTGAAAAGTCAACGGGTGATTTTCTAACGCGCCGTAGGTGCGAGGGGTTTGGAGATCCAG

241 GGGAAATTCGTCAAGTTCACGACGATCGGAGTTTACCTGGAGGATAACGCCGTTAAGTGG

301 CTCGCCGGTAAGTGGAAGGGGAAGTCGGCGGAGGAACTGACGGAGTCCGTCGAGTTCTTC

361 AGAGACATCGTAACCGGTATGTAATTTATCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGATC

421 TCATAGTATATTAGTAGCCCACATTTTTTAACGGTTAGATACGATGAAAATCACATTAAG

481 AAAAAAGCATAGCAGGCAGAATTTTACGTCAAAAAACAGAGTCCTATTGACTGTGCATGT

541 TTTTCAGATCCTACGGTAGAAATCTCTTTCTTTTTAATGTTAATGTTCGATTTGTTTTTA

601 GGTCCATTTGAGAAGTTTACCAGGGTGACGATGATATTGCCGTTAACGGGGCCACAGTAT

661 TCGGAGAAAGTGTCGGAAAATTGCGTGGCAATCTGGAAAGCTTTGGGGATTTACACTGAC

721 GCAGAGGAGAAAGCCATTGAAAAGTTCATTGAAGTCTTTAAAGATCAGAATTTCCCGCCA

781 GGATCCTCTATTCTCTTCACACAATCGCCCACCGGTTCCTTAAAGGCAAGTAAATTTATG

841 CTTTCTTCAACAGTTCTCAAGTTTCTGTTACGTTGTTTCCCTCATAAAAATTCTAATTCT

901 ACTTTTATTGATACAATTTTTCTTTCAAATAAATTCACTTTTTAATCGACAAGACGTGTT

961 GTTCTTTTCAAAGGCAAAGAGAATCAAATTTATATCATTGATTTAGTATGATATATAGGT

1021 GCTCCAACTGTTATGTAGTGGTCTTTGATTTGGGTCACATCCAACACAGTAGGCGCATTA

1081 CATGACGTCCTGATATTTGTCAATTTTACACTGCAGCATTTTATATTACGTTGTGTGAAA

1141 GATTTTGTACCACTTTCCTCCCAAGTGATCATTACGTAGATGGGGAGGTCTAATTTGAGG

1201 AGATGAGATCTGTTGTTTCCATTTTTCTATCTCATTAGTTGCCCTTCTATTATTTTATTT

1261 CTTTGCCATCAAAATTTGACAACTTAGATGTTGCAAAATTTTTCATAAGTGCGCGGGTCG

1341 CAAAAGTAATAAAGTGACTAAAAAATTGAATATCGTTCCACAAGGATTGAATTTTTGAGA

1381 ATTAAACTCAATATTATGAGTGTTCGTGACTAAATTTTATCTAGGTGAAATCGAGTGAAT

1441 TAAGTAATTGAAGCAAGAAAAGTAAATTAATTTAATTTAATTTCCTCTTAATCTCTACTA

1501 TTTTTATTTTGATTTTCATTTGAAAATTGTAATTGTGATATTGTGATATTGTAATTGTGC

1561 TTCGATTTCAAACCATTATTTTGGTTGGGGAAAATTCAAACAAAACAAGATCGTTGTGTA

1621 GAAGGAAACCAAATTTGCGCAGGCTGTTTGTGATGCGTTTCGTTTCCAGTGTCTCCTACG

1681 CTGATGAAAAGTTGCTATAGTTGGTCAACTCTCCCTACATTCTTCTTTTTTTAATAATAA

1741 AAAAAAAATGATATGAAAGATTTTGCTAAAACTACGAAAATATGACTCCTTACAATTGAT

1801 CTACTTTGGTGGGTATAATCATTTATGCATTATCTCAATAGTACTCTGTATCTGCCCTTT

1861 ACAAGTCAGGAAAAGACTTTGCATTTTTTTGAACACCCGACCAGTCTTTTTAACTCTTTT

1921 TCTTGTTTTTCAATATAGATAAGCTTTTCCAAAGATGAATCCATACCAGAAAAAGAGAAT

1981 GTTGTTATAGAAAACAAACTACTTTCGGAGGCGGTTTTGGAGTCGATTATTGGAAAGCAT

2041 GGAGTTTCTCCTGCTGCAAGGCAAAGCATTGCTTCAAGGCTAGCGGAATTGCTTAAAGAG

2101 ACAAAAGACTGA

序列表二：

西南大学

桑树查尔酮异构酶（MaCHI）基因开放阅读框（ORF）序列及3′端非编码区

1

950

DNA

桑树（Morus alba L）

1

1 ATGGCTCTTA CGACAGTCGC CGGAGTTCAG GTCGAGATAG CCACGTTCCC GCCGGCGGCG

61 ACGCCTCCGG GCTCCGACAA GACTCTGTTT CTTGGCGGTG CAGGTGCGAG GGGTTTGGAG

121 ATCCAGGGGA AATTCGTCAA GTTCACGACG ATCGGAGTTT ACCTGGAGGA TAACGCCGTT

181 AAGTGGCTCG CCGGTAAGTG GAAGGGGAAG TCGGCGGAGG AACTGACGGA GTCCGTCGAG

241 TTCTTCAGAG ACATCGTAAC CGGTCCATTT GAGAAGTTTA CCAGGGTGAC GATGATATTG

301 CCGTTAACGG GGCCACAGTA TTCGGAGAAA GTGTCGGAAA ATTGCGTGGC AATCTGGAAA

361 GCTTTGGGGA TTTACACTGA CGCAGAGGAG AAAGCCATTG AAAAGTTCAT TGAAGTCTTT

421 AAAGATCAGA ATTTCCCGCC AGGATCCTCT ATTCTCTTCA CACAATCGCC CACCGGTTCC

481 TTAAAGATAA GCTTTTCCAA AGATGAATCC ATACCAGAAA AAGAGAATGT TGTTATAGAA

541 AACAAACTAC TTTCGGAGGC GGTTTTGGAG TCGATTATTG GAAAGCATGG AGTTTCTCCT

601 GCTGCAAGGC AAAGCATTGC TTCAAGGCTA GCGGAATTGC TTAAAGAGAC AAAAGACTGA

661 agaaaatgtt aggtggaggg aaaagtgaaa cgggacgtct aacaaggaag tgtgtgagaa

721 agaaaggaga aatgaaattc cacatgaata ctgtgcgttt tttctggaac ctttattttt

781 ggatcaacgt taataagcga aagcatattg tttgtgtttt taatcaaata ttgaacccat

841 tagagttaat ttcatgcatt ttctcgttca gtgcttacaa tggagaggaa atatacaaaa

901 gaaacgtgac agattgtgtt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

序列表三：

西南大学

桑树查尔酮异构酶（MaCHI）基因编码的氨基酸序列

1

219

Amino Acid

桑树（Morus alba L）

1

1 MALTTVAGVQ VEIATFPPAA TPPGSDKTLF LGGAGARGLE IQGKFVKFTT IGVYLEDNAV

61 KWLAGKWKGK SAEELTESVE FFRDIVTGPF EKFTRVTMIL PLTGPQYSEK VSENCVAIWK

121 ALGIYTDAEE KAIEKFIEVF KDQNFPPGSS ILFTQSPTGS LKISFSKDES IPEKENVVIE

181 NKLLSEAVLE SIIGKHGVSP AARQSIASRL AELLKETKD

Claims

1.桑树查尔酮异构酶基因MaCHI，其特征在于，桑树查尔酮异构酶基因的核苷酸全序列如SEQ ID NO：1所示，桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框ORF序列及3′端非编码区如SEQ ID NO：2所示，桑树查尔酮异构酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述的桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的克隆方法，其特征在于依次通过以下步骤实现：

1）根据蔷薇科植物草莓或苹果的查尔酮异构酶基因保守序列设计简并引物，以桑树叶片基因组为模板，扩增桑树查尔酮异构酶基因的保守区域；

3）采用软件sequencher将获得的侧翼序列与保守区域序列进行拼接，采用NCBI网站的blastx程序预测拼接序列中含有的基因开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列；

4）以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框（ORF），并连接到pMD19-T Vector，挑选阳性克隆并测序。

3. 权利要求1所述桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的应用，其特征在于将该基因应用于真核及原核表达。

4.权利要求1所述桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于过量表达提高桑树类黄酮的含量。