CN102630670A - 一种抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制备方法、产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制备方法、产品及其应用,属于新材料领域。本发明是利用水滴作为模板,在固体基底上形成规则有序的多孔薄膜。该薄膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种细菌具有抑制其生长的作用,且具有抗乙肝病毒功能。多次细胞毒性实验证明该薄膜对正常细胞无毒。这种生物兼容性好的薄膜可用于污水处理、负载敷药,在血液滤膜、细菌分离、细菌传感器的制备以及肝病治疗等方面具有重要的应用价值。该多孔薄膜中的孔径可以通过改变其中表面活性剂的种类、浓度等方便地进行调节,从而满足各种情形下的实际应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的制备方法、产品及其应用,属于新材料领域。
背景技术
由表面活性剂包裹的多酸盐组装构筑有序结构成为近年来的研究热点。多酸盐(polyoxometalates,简写POMs)是一类新型的纳米级无机大分子,能很好地溶解在水中,以巨大阴离子的形式存在。基于静电相互作用,带相反电荷的表面活性剂可以对多酸盐进行表面修饰。最新研究发现,表面活性剂包覆的多酸盐复合物(surfactant-encapsulatedpolyoxometalates,SEPs)可以在固体基底上形成规则有序的多孔薄膜。
可用来构筑有序多孔薄膜的体系有很多,如应用聚合物、嵌段共聚物、两亲型聚离子复合体、表面活性剂修饰的多酸盐以及金属纳米颗粒等。其中,对表面活性剂修饰的多酸盐混合体系构筑多孔有序薄膜的研究一直比较活跃,这主要与表面活性剂本身所具有的两亲性及其杀菌等性能方面的优势有关。表面活性离子与带相反电荷的多酸盐离子通过静电相互作用形成大的聚集体,在合适的条件下构筑规整有序的多孔膜结构。可以通过采用不同表面活性剂、调节表面活性剂的浓度、改变在成膜过程中所需的湿度等来调节形成多孔薄膜的孔径,从而满足不同应用的要求。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足,提供一种制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法。在该体系中,通过对表面活性剂种类、浓度、基底种类、通入气体得温度湿度等来调节多孔有序薄膜的孔径大小,方便地进行调节制备孔径多尺度的规则有序薄膜材料,从而满足在各种情形下的实际应用。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法,其特征是,其步骤包括:
(1)称取以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂,备用;
(2)以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液的制备
配制浓度为0.06~0.08克/升,以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液,使多酸盐充分溶解,待用;
(3)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物溶液的制备
利用静电相互作用,将步骤1配制的以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂加入到步骤(2)中配制好的以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液,以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂与以Na+为反离子的阴离子多酸盐物质的量之比为9∶1-13∶1。搅拌,使之充分混合;
(4)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物的制备
将步骤(3)中的混合物过滤,弃上清,洗涤沉淀,干燥,得表面活性剂修饰的多酸盐复合物;
(5)多酸盐复合物的氯仿溶液的制备
将步骤(4)中得到的复合物溶于氯仿,配制成浓度为1.0~2.0克/升的一系列溶液;优选1.4-1.6克/升。
(6)蜂窝状多孔有序薄膜的制备
将步骤(5)制备的溶液滴加到固体基底上,通入潮湿的气流,待溶剂完全挥发,得到蜂窝状多孔有序薄膜。
上述步骤(1)中所述以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂具体选自双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr)或双十八烷基二甲基氯化铵(DODMACl)。
上述步骤(2)中所述以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液具体选自多酸盐Na11[CoW11O39]。
1.该多孔膜抑制细菌生长的作用
按照步骤(6)所述的制备方案,构筑多孔有序薄膜。加入细菌悬浮液,培养一定时间,取出细菌悬浮液,稀释,显微镜直接计数和平板菌落计数法进行细菌计数。
2.该多孔有序薄膜抗乙肝病毒的功能
按照步骤(6)所述的制备方案,构筑多孔有序薄膜。加入乙肝病人的血清,在37℃培养箱中培养一定时间,运用实时PCR荧光定量核酸扩增进行检测。
3.该多孔有序薄膜无细胞毒性的研究
按照步骤(6)所述的制备方案,构筑多孔有序薄膜。加入正常细胞悬浮液,在37℃培养箱中培养一定时间,计细胞个数,将其与空白样品进行比较。
4.该多孔有序薄膜无溶血性能的研究
按照步骤(6)所述的制备方案,在细胞培养板上形成多孔有序薄膜。将正常健康人的血液加入向膜和膜的浸提液中,在37℃培养箱中培养一定时间,显微镜下观察红细胞的形貌。将其与空白样品、阳性对照进行比较。
步骤(6)中所述制备过程中,交换装置自行制备,见附图1。在气体流量计的控制下,使氮气流通过盛有水的集气瓶,在固体基底上方形成稳定的潮湿气流。
本发明描述了一种制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法,该方法的技术要点有以下三个方面:1)首先,以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂本身具有良好的疏水性,其可以控制阳离子表面活性剂与多酸盐的摩尔比例来制备复合物;2)其次,多孔有序薄膜的孔径可通过调节表面活性剂的浓度、改变在成膜过程中所需的湿度等方便的进行控制;3)在进行生物医学功能测试时,注意避免杂菌污染,操作准确快速。
本发明的突出特色是:1)运用将表面活性剂修饰的多酸盐复合材料成功构筑蜂窝状多孔有序薄膜,这样得到的多孔薄膜保持了表面活性剂杀菌等方面特性,从而能够满足特定条件下的使用要求;2)体系中阳离子表面活性剂的种类、浓度等可以方便的调控多孔有序膜的孔径大小,从而提高了体系适应不同应用的要求,拓宽了在生物医学方面的应用范围;3)多孔有序薄膜在制备完成后具有很好的稳定性,能够在室温下长期放置而不会发生形貌变化,无菌条件下保存即可满足后期生物医学应用。
本发明还提供了采用上述的制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法制备的生物兼容薄膜。
本发明的优势在于,制备得到的构筑蜂窝状多孔有序薄膜保持了表面活性剂杀菌等方面特性;可以通过调节体系中阳离子表面活性剂的种类、浓度等方便的调控多孔有序膜的孔径大小;多孔有序薄膜在制备完成后具有很好的稳定性,能够在室温下长期放置而不会发生形貌变化,从而提高了体系适应不同应用的要求,拓宽了在生物医学方面的应用范围。
本发明中构筑蜂窝状有序多孔薄膜所采用的物质为多金属氧酸盐Na11[CoW11O39]和双链阳离子表面活性剂,多酸盐和表面活性剂组装所需的驱动力是阴阳离子之间的静电吸引作用。将组装得到的复合物溶液滴加至固体基底,在潮湿气流的作用下,利用水滴模板的方法构筑规则有序的蜂窝状多孔薄膜。研究了蜂窝状多孔有序薄膜对于多种细菌的抑制作用,抗乙肝病毒功能。该多孔薄膜能够显著的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等生长;抑制乙肝病毒核酸扩增。
因此:
本发明另外提供了上述的生物兼容薄膜在制备细菌抑制剂中的应用。
上述应用特别是其在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌的细菌抑制剂中的应用。
本发明还提供了上述的生物兼容薄膜在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
为了拓宽实际应用范围,我们进行了细胞毒性以及溶血方面的测试,发现该多孔薄膜对正常细胞无毒性,无溶血性能,这打消了应用方面上很大的顾虑,有望应用于临床治疗。
本发明中制备的蜂窝状多孔膜具有很多特性和重大的潜在应用,该多孔有序薄膜在除菌过滤、细菌传感器的制备等方面具有重要的应用价值,有望在工业污水处理、负载敷药、血液滤膜及治疗肝病等方面实现应用。
附图说明
图1制备蜂窝状多孔有序薄膜的实验装置示意图。
图2实施例1中多孔有序薄膜透射电子显微镜照片(两幅图是不同倍数下透射电镜照片)。
图3实施例1中多孔有序薄膜扫描电子显微镜照片。
图4实施例2中多孔有序薄膜扫描电子显微镜照片。
图5实施例3中多孔有序薄膜原子力显微镜照片。
图6实施例3中多孔有序薄膜扫描电子显微镜照片。
图7实施例4中a-f各样品中的抑菌环照片。其中a-f样品依次为{CoW11O39}11-(a),{CoW11O39}(DHA)11(b),{CoW11O39}(DODMA)11(c),CHCl3(d),DHABr(e),DODMACl(f),各样品中的水溶液里,以上测试物质浓度均为2g/L。
图8实施例5分别培养3h、6h、10h后显微镜直接计数法进行细菌计数的结果。各个样品培养温度环境均相同。
图9和图10为实施例6和例7,分别为加入铜绿假单胞菌悬浮液和金黄色葡萄球菌,培养1h、3h、5h,平板菌落计数法进行细菌计数结果。各个样品培养温度环境均相同。
图11实施例8分别向多孔膜和膜的浸提液分别加入正常健康人的血液,在37℃培养箱中培养,显微镜下观察细胞形态变化。各个样品培养温度环境均相同。测试蜂窝状多孔膜的溶血率,和浸提液的溶血率。
图12为实施例9细胞毒性实验测试。各个样品培养温度环境均相同。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
实施例1:制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法,包括如下步骤:
(1)称取9.2毫克的双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr),备用;
(2)多酸盐Na11[CoW11O39]水溶液的制备
称取3.8毫克多酸盐Na11[CoW11O39],充分溶解在50毫升蒸馏水中,配制浓度为0.076克/升的多酸盐Na11[CoW11O39]水溶液,待用;
(3)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物溶液的制备
利用静电相互作用,将步骤1称取的双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr)加入到步骤2中配制好的以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液50毫升中,搅拌,使之充分混合;得表面活性剂复合物。(阳离子表面活性剂DHABr与以Na+为反离子的阴离子多酸盐物质的量之比为12.5∶1)
(4)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物的制备
将步骤(3)中的混合物过滤,弃上清,洗涤沉淀,干燥,得表面活性剂修饰的多酸盐复合物;
(5)多酸盐复合物的氯仿溶液的制备
将步骤(4)中得到的复合物溶于氯仿,配制成浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0克/升的一系列溶液,研究其形成蜂窝状多孔有序薄膜的形貌;
(6)蜂窝状多孔有序薄膜的制备
将步骤(5)制备的溶液滴加到固体基底上,通入潮湿的气流,气流速度为1L/min,待溶剂完全挥发,得到蜂窝状多孔有序薄膜。
阳离子表面活性剂为双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr),在步骤(5)得到的多酸盐复合物浓度为1.6g/L时,制备的多孔有序薄膜其透射电子显微镜照片和扫描电子显微镜分别如图2和图3所示,图2、图3的电镜照片中表示了我们制备了规则有序的多孔薄膜结构。
实施例2:在实施例1的基础上,将步骤(1)双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr)的质量调整为7毫克(阳离子表面活性剂DHABr与以Na+为反离子的阴离子多酸盐物质的量之比为9.5∶1);依然可以得到规整有序的多孔薄膜。在步骤(5)得到的多酸盐复合物浓度为1.6g/L时,其扫描电子显微镜如图4所示。
实施例3:在实施例1的基础上,将步骤(1)双十六烷基二甲基溴化铵(DHABr)的质量调整为8.2毫克(阳离子表面活性剂DHABr与以Na+为反离子的阴离子多酸盐物质的量之比为11.1∶1);在步骤(5)得到的多酸盐复合物浓度为1.6g/L时,依然可以得到规整有序的多孔薄膜。
实施例4:在实施例1的基础上,将阳离子表面活性剂调整为双十八烷基二甲基氯化铵(DODMACl),步骤(5)采用的多酸盐复合物浓度为1.4g/L,时,依然可以制备得到规整有序的多孔薄膜材料,制备的多孔有序薄膜其原子力显微镜照片和扫描电子显微镜分别示于图5和图6中。图5、图6表示的电镜照片中表示了我们制备了规则有序的多孔薄膜结构。
实施例5:在实施例1、例4的基础上,向浸入大肠杆菌悬浮液中一定时间的滤纸片上加入表面活性剂复合物SEPs的溶液,在37℃培养箱中培养,12小时后抑菌环明显,照片如图7。其中由a-f样品依次为{CoW11O39}11-(a),{CoW11O39}(DHA)11(b),{CoW11O39}(DODMA)11(c),CHCl3(d),DHABr(e),DODMACl(f)。以形成薄膜所用的复合物{CoW11O39}(DHA)11(b)和{CoW11O39}(DODMA)11(c)为测试产品。其他物质为对照,分别是{CoW11O39}11-(a),代表Na+为反离子的阴离子多酸盐;CHCl3(d)为形成蜂窝状多孔膜时SEPs溶液的溶剂,阳离子表面活性剂DHABr(e)和DODMACl(f)表示复合物SEPs的形成原料;其中,对照组a、e、f与测试组b、c采用相同的浓度,均为2.0g/L,即a为{CoW11O39}11-2.0g/L的水溶液;e为DHABr的2.0g/L氯仿溶液;f为DODMACl的2.0g/L氯仿溶液;分别10μL加入到滤纸片上。这表明,多酸盐和表面活性剂复合物SEPs在溶液状态下就具有抑制细菌生长的作用。这为采用表面活性剂复合物SEPs构筑成蜂窝状多孔薄膜,为进一步研究多孔薄膜抑制细菌生长提供了依据。
实施例6:如图8所示,在实施例1、例4的基础上,加入大肠杆菌悬浮液,37℃培养箱中分别培养3h、6h、10h,取出细菌悬浮液,稀释,显微镜直接计数法进行细菌计数。由SEPs——{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11在潮湿气流的作用下,形成的蜂窝状多孔薄膜表现出比对照材料更好的抑制大肠杆菌生长的能力。对照材料分别是阳离子表面活性剂DHABr,DODMACl的氯仿溶液挥发后留下的无规则结构薄膜;Na+为反离子的阴离子多酸盐{CoW11}11-挥发后留下的无规则结构薄膜;以及空白对照(即不加任何干扰因素,正常情况下细菌生长)。各溶液的浓度一致,均为2.0g/L。
实施例7:如图9所示,分别在不同物质形成的膜上培养铜绿假单胞菌1h、3h、5h后,得到的铜绿假单胞菌的数量;对照组分别为{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11在没有通入潮湿气流时形成的无规则结构薄膜;阳离子表面活性剂DHABr,DODMACl的氯仿溶液挥发后留下的无规则结构薄膜;Na+为反离子的阴离子多酸盐{CoW11}11-挥发后留下的无规则结构薄膜;以及空白对照,各溶液的浓度一致,均为2.0g/L。在实施例1、例3的基础上,加入铜绿假单胞菌悬浮液,37℃培养箱中分别培养1h、3h、5h,取出细菌悬浮液,稀释,平板菌落计数法进行细菌计数。由SEPs——{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11在潮湿气流的作用下,形成的蜂窝状多孔薄膜表现出比其他材料更好的抑制铜绿假单胞菌生长的能力。值得一提的是,由SEPs形成蜂窝状多孔薄膜的抑菌性能比没有形成蜂窝状多孔膜的SEPs具有更好的抑制细菌的能力。膜排列形成规则多孔结构后抗菌能力明显增强是由于,铺展形成多孔薄膜结构以后,表面活性剂包裹{CoW11O39}11-形成的复合物与细菌作用的表面积增加,从而杀菌能力增强。
实施例8:如图10所示,分别在不同物质形成的膜上培养金黄色葡萄球菌1h、3h、5h后,得到的抑菌活性(由各物质得到的金黄色葡萄球菌数量与空白对照组得到的细菌数量之比得出);对照组分别为{Cow11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11在没有通入潮湿气流时形成的无规则结构薄膜;阳离子表面活性剂DHABr,DODMACl的氯仿溶液挥发后留下的无规则结构薄膜;Na+为反离子的阴离子多酸盐{CoW11}11-挥发后留下的无规则结构薄膜;以及空白对照,各溶液的浓度一致,均为2.0g/L。在实施例1、例3的基础上,加入金黄色葡萄球菌悬浮液,37℃培养箱中分别培养1h、3h、5h,取出细菌悬浮液,稀释,平板菌落计数法进行细菌计数。由SEPs——{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11在潮湿气流的作用下,形成的蜂窝状多孔薄膜表现出比其他材料更好的抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。值得一提的是,由SEPs形成蜂窝状多孔薄膜的抑菌性能比没有形成蜂窝状多孔膜的SEPs具有更好的抑制细菌的能力。
实施例9:如图11所示,Hemolysis rate of films表示膜的溶血率(即图中每组柱状图的左侧一个);Hemolysis rate of leach solutions表示浸出液的溶血率,其中DHABr和DODMACl表示阳离子表面活性剂挥发后留下的无规则结构薄膜;control表示阳性对照,本专利采用的是浓盐酸溶液;CoW-water代表Na+为反离子的阴离子多酸盐{CoW11O39}11-挥发后留下的无规则结构薄膜;CoW-DHA和CoW-DODMAC分别表示以复合物{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11形成的蜂窝状多孔膜;在实施例1、例4的基础上,向多孔膜和膜的浸提液分别加入正常健康人的血液,在37℃培养箱中培养,显微镜下观察细胞形态变化。从附图11中,得知该多孔薄膜和膜的浸提液溶血率均在5%以后,说明该多孔膜以及膜的组成成分均没有溶解血细胞的功能,细胞相容性好。
实施例10:如图12所示,横坐标分别为包括对照在内的各物质(阳离子表面活性剂DHABr,DODMACl挥发后留下的无规则结构薄膜;以复合物{CoW11O39}(DHA)11和{CoW11O39}(DODMA)11形成的蜂窝状多孔膜;Na+为反离子的阴离子多酸盐{CoW11}11-挥发后留下的无规则结构薄膜;以及阳性对照DMSO);纵坐标表示相对增长速率。在实施例1、例3的基础上,向多孔膜中加入不同浓度的正常细胞悬浮液(10%、30%、50%),在37℃培养箱中培养,计细胞个数,运用MTT比色法进行细胞毒性实验。MTT比色法是浸提液法的一种,该方法是在特定温度条件下,按照一定的比例用细胞培养液对材料浸提,一定时间之后用该浸提液培养细胞,对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高。其原理是当黄色水溶性的MTT加入活细胞后,即形成不溶于水的蓝紫色结晶物甲臜,二甲基亚砜(DMSO)可使甲臜溶解,用分光光度计可以测定溶液的吸光度,吸光度的大小取决于甲臜形成的多少即活细胞的数量和其新陈代谢强度。
RGR=(供试品组吸光度/空白对照组吸光度)×100%。根据RGR将毒性分级如下:0级:RGR≥100%;1级:80%~99%;2级:50%~79%;3级:30%~49%;4级:0%~29%。各待测样品的吸光度除以阴性对照的吸光度,得到的数值。
该蜂窝状多孔薄膜被认为是安全的,在低浓度下毒性等级是0级,在很高浓度下毒性为1级。
Claims (8)
1.一种制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法,其特征是,其步骤包括:
(1)称取以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂,备用;
(2)以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液的制备
配制浓度为0.06~0.08克/升,以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液,使多酸盐充分溶解,待用;
(3)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物溶液的制备
利用静电相互作用,将步骤1配制的以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂加入到步骤2中配制好的以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液,以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂与以Na+为反离子的阴离子多酸盐的物质的量之比为9:1-13:1;搅拌,使之充分混合;
(4)以表面活性剂修饰的多酸盐复合物的制备
将步骤3中的混合物过滤,弃上清,洗涤沉淀,干燥,得表面活性剂修饰的多酸盐复合物;
(5)多酸盐复合物的氯仿溶液的制备
将步骤4中得到的复合物溶于氯仿,配制成浓度为1.0~2.0克/升的溶液;
(6)蜂窝状多孔有序薄膜的制备
将步骤5制备的溶液滴加到固体基底上,通入潮湿的气流,待溶剂完全挥发,得到蜂窝状多孔有序薄膜。
2.如权利要求1所述的方法,其特征是,步骤1中所述以Br-或Cl-为反离子的阳离子表面活性剂具体选自双十六烷基二甲基溴化铵或双十八烷基二甲基氯化铵。
3.如权利要求1所述的方法,其特征是,步骤2中所述以Na+为反离子的阴离子多酸盐水溶液具体选自多酸盐Na11[CoW11O39]。
4.如权利要求1所述的方法,其特征是,步骤6中气流速度为1L/min。
5.权利要求1-4任一项所述的制备抗菌抗病毒的生物兼容薄膜的方法制备的生物兼容薄膜。
6.权利要求5所述的生物兼容薄膜在制备细菌抑制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征是,其在制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌的细菌抑制剂中的应用。
8.权利要求5所述的生物兼容薄膜在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
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CN115698192B (zh) * | 2020-06-05 | 2023-11-28 | 国立研究开发法人产业技术综合研究所 | 涂膜以及表面上形成涂膜的物品 |
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