CN102628072A - 一种胰岛素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胰岛素的制备方法，该方法包括两步层析纯化的步骤，能提高酶切效率和酶切过程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全，并且能彻底去除未与羧肽酶B反应的胰岛素前体，从而提高最终胰岛素产品的纯度和质量，使最终胰岛素纯品的纯度能达到99.7%以上，并且回收率高，可以进行工业化生产。

Description

一种胰岛素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胰岛素的制备方法，具体地说，涉及一种包括两步层析纯化胰岛素步骤的制备方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。而在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趋势，到2011年底，中国已经确诊的糖尿病患者人数超过了9240万人，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。

胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素，到90年代，随着胰岛素技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的新一代胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素等。

目前生产重组胰岛素的方法一般是先通过基因工程合成胰岛素原(pro-insulin)或胰岛素前体(pre-proinsulin)，再通过酶切形成胰岛素。胰岛素原由A链、B链、C链(又叫连接肽)组成，其由N端至C端的连接顺序NH₂-B链-Arg-Arg-C链-Lys-Arg-A链-COOH(参见附图1)。为了促进胰岛素原的正确折叠，人们有时会在B链N端通过Arg或Lys连接融合蛋白或信号肽，形成胰岛素前体。此外，为了生产不同结构的胰岛素类似物，人们会在胰岛素的A链或B链上进行氨基酸突变或是侧链连接，形成胰岛素类似物原或胰岛素类似物前体，但是其C链、融合蛋白或信号肽与A链、B链的连接关系一般不会改变。

胰蛋白酶和羧肽酶B是重组胰岛素生产过程中不可或缺的双酶。胰蛋白酶可以从肽链中精氨酸Arg或赖氨酸Lys的羧端切断肽链(EC3.4.21.4)；羧肽酶B可以切除肽链羧端的碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸(EC3.4.17.2)。在形成正确折叠的胰岛素原或胰岛素前体、或是胰岛素类似物原或胰岛素类似物前体后，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切，可将C链和其他连接肽切除，形成正确折叠的胰岛素或胰岛素类似物(参见附图1)。

因此，目前通过基因工程生产重组胰岛素的步骤一般为：工程菌发酵表达胰岛素原或胰岛素前体、提取包涵体或可溶性表达产物、纯化、复性、酶切、纯化。在原核表达的现有技术中，通常是在通过复性步骤得到具有正确构象的胰岛素原或胰岛素前体后，同时加入胰蛋白酶和羧肽酶B，酶切得到胰岛素，然后再通过离子树脂、HPLC等方法进行纯化(参见EP0055945、CN90101415.X、CN86106574、CN200610117742.8等)。这种同时加入两种酶的缺点是1.由于羧肽酶B只能酶切肽链羧端的碱性氨基酸，因此要等胰蛋白酶酶切后，羧肽酶B才能发挥作用，这样会导致酶切作用不完全，效率低；2.两种酶的作用位点不一致，会导致副产物多，酶切过程不易控制。

在中国专利CN98813941.3中，公开了另一种制备重组胰岛素的方法，该方法在获得正确构象的胰岛素前体后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正确构象的Arg(B31)-胰岛素，纯化后再用羧肽酶B去除Arg(B31)-胰岛素C端的Arg，形成正确构象的胰岛素，最后再用HPLC纯化。该方法虽然分别采用胰蛋白酶和羧肽酶B进行两步酶切，但是在羧肽酶B酶切之后直接用HPLC进行纯化，会导致有些未与羧肽酶B反应的Arg(B31)-胰岛素与胰岛素难以分离，影响最终产品的纯度。该专利中最终人胰岛素的纯度为99％，由于胰岛素制剂是注射到人体内的药物制剂，因此目前国际上对胰岛素终产品纯度的要求非常严格，规定单个杂质的含量不能超过0.1％，杂质总量不能超过0.3％，即胰岛素纯度需要达到99.7％以上。而上述专利的制备方法均不能达到该要求，实际上，在现有技术中，如要高回收率的制备纯度达到99.7％以上的胰岛素，并且实现工业化生产是非常困难的。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有问题，提供一种包括两步层析纯化胰岛素步骤的制备方法，该方法能提高酶切效率和酶切过程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全，并且能彻底去除未与羧肽酶B反应的胰岛素前体，从而提高最终胰岛素产品的纯度和质量，使最终胰岛素纯品的纯度在99.7％以上，并且回收率很高，可以进行工业化生产。

因此，为了实现本发明的目的，本发明提供一种胰岛素的制备方法，该方法包括以下步骤：

1.获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；

2.使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；

3.纯化步骤2的酶切产物；

4.使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；

5.使用阳离子交换层析纯化步骤4的酶切产物。

所述胰岛素为任何A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物，所述碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等。优选的胰岛素包括但不限于人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素等。

步骤1中所述正确构象的胰岛素原或胰岛素前体可以通过各种本领域技术人员所公知的现有技术获得。例如，可参见EP0055945发明详述中步骤A1至C1获得正确构象的人胰岛素原，参见CN98813941.3实施例5-5.3获得正确构象的hGH-小胰岛素原，参见CN90101415.X的各实施例(如实施例29)或CN 98114950.2的各实施例(如实施例2)获得正确构象的胰岛素类似物原等。此外，还可以通过US5358857、Villa-Komaroff et al.，PNAS，1978，75(8)：3727-3731，Thim et al，PNAS，1986，83：6766-6770等文献中介绍的方法获得，或是采用其他公知肽合成技术制备，例如溶液法、固相合成法(J.Stewart等，《固相肽合成》，Freeman and Co.，San Francisco，1969)、半合成法、基因工程法、DNA重组法等。

步骤2中的胰蛋白酶可以从肽链中精氨酸Arg或赖氨酸Lys的羧端切断肽链。用胰蛋白酶酶切步骤1中的胰岛素原或胰岛素前体，可以切除胰岛素A链、B链之间的连接肽以及与B链连接的融合蛋白或信号肽，从而得到正确构象的具有B31位精氨酸(Arg^B31)的胰岛素前体(参见附图1)。所述使用胰蛋白酶进行酶切的方法可通过各种本领域技术人员所公知的方法进行，例如以上述参考文献中所公开的胰蛋白酶酶切条件进行。具体的说，可以先将步骤1中的胰岛素原或胰岛素前体配制成浓度为1-15mg/ml的溶液，调pH值至碱性环境，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与胰岛素原或胰岛素前体的质量比为1/100-800，在4-15℃下反应2-10小时，酶切反应结束时用再将溶液调pH至酸性环境终止反应。

步骤3纯化步骤的目的是去除未与胰蛋白酶反应完全的各种副产物，得到纯化的正确构象的具有Arg^B31的胰岛素前体，该步骤可以通过各种本领域技术人员所公知的方法进行。例如可以通过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析、排阻层析、HPLC等之一或其组合的方法进行纯化。其中所述各种层析介质可以是本领域常用的介质，可以通过多种商业途径购得。例如，阳离子交换介质包括但不限于CM Sepharose^TM、SP Sepharose^TM等，阴离子交换介质包括但不限于DEAE Sepharose^TM、Q Sepharose^TM等，疏水层析介质包括但不限于丁基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶等，排阻层析介质包括但不限于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

步骤4中的羧肽酶B可以切除肽链羧端的碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸，应用羧肽酶B酶切步骤3所得到的纯化的Arg^B31-胰岛素前体，可切去Arg^B31，得到正确构象的胰岛素(参见附图1)。所述使用羧肽酶B进行酶切的方法可通过各种本领域技术人员所公知的方法进行，例如以上述参考文献中所涉及的羧肽酶B酶切条件进行。具体的说，可以将步骤3中的纯化产物配制成浓度为1-50mg/ml的溶液，调pH值至碱性环境，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与Arg^B31-胰岛素前体的质量比为1/200-3000，在20-40℃下反应0.1-2小时，酶切反应结束时再将溶液调pH至酸性环境终止反应。

步骤5纯化步骤的目的是去除未与羧肽酶B反应完全的具有Arg^B31的胰岛素前体，得到纯化的正确构象的胰岛素。该步骤采用阳离子交换层析进行纯化，具有以下优点：1.Arg^B31带有正电荷，能与层析介质牢固地结合，可使Arg^B31胰岛素前体与胰岛素分离彻底；2.切去了Arg^B31的胰岛素电荷发生变化，其洗脱时间也发生变化，此纯化步骤可以去除步骤3中与Arg^B31胰岛素前体具有相同洗脱时间的微量杂质；3.阳离子交换层析的洗脱液不含有机溶液，可提高最终产品的安全性。其中所述阳离子交换层析所采用的介质可以是本领域常用的介质，可以通过多种商业途径购得，包括但不限于CM Sepharose^TM、SP Sepharose^TM等。

优选地，本发明步骤3包含阳离子交换层析纯化步骤，并且其层析介质与步骤5中的阳离子交换层析介质相同。发明人经多次试验发现，在两步层析纯化中使用相同的阳离子交换介质，可使纯化效果协同增加，使胰岛素产品的最终纯度更高，能达到99.8％以上。

优选的，本发明所述胰岛素的制备方法还可包含对步骤5的纯化产物进行精纯的步骤。所述精纯可采用本领域所公知的技术进行，例如，可通过HPLC的方法进行。

本发明胰岛素的制备方法具有以下优点：

1.先后使用胰蛋白酶和羧肽酶B对胰岛素原或胰岛素前体进行酶切，能够提高酶切效率和酶切过程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全。

2.在羧肽酶B酶切Arg^B31-胰岛素前体后增加一次阳离子交换层析的纯化步骤，能彻底去除未与羧肽酶B反应的胰岛素前体，从而提高最终胰岛素产品的纯度和质量，使最终胰岛素纯品的纯度能达到99.7％以上。

3.切除了Arg^B31的胰岛素电荷发生变化，洗脱时间发生变化，步骤5的第二次纯化可以去除步骤3中与Arg^B31-胰岛素前体具有相同洗脱时间的微量杂质。

4.本制备方法制备的胰岛素，不仅杂质总量低，低于0.3％，并且单个杂质的含量也很低，都低于0.1％。

5.在步骤3和步骤5中使用相同的阳离子交换介质进行层析纯化，可使纯化效果协同增加，使胰岛素产品的最终纯度更高，能达到99.8％以上。

6.本制备方法能应用于任何A、B链末端不是精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸的胰岛素，应用性广。

7.本制备方法方法简单，成本低，回收率高，可以进行工业化生产。

附图说明

图1：应用胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原酶切成胰岛素的反应流程示意图。

图2：实施例1中人胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

图3：实施例2中人胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

图4：实施例3中人胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

图5：实施例4中赖脯胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

图6：实施例5中赖谷胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

图7：实施例6中门冬胰岛素的纯度分析图及局部放大图。

具体实施方式

材料：

胰蛋白酶、羧肽酶B购自Sigma-Aldrich公司；CM Sepharose^TM、SPSepharose^TM、DEAE Sepharose^TM、Q Sepharose^TM、苯基琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶购自通用电气医疗系统贸易发展有限公司；

C8柱购自阿克苏诺贝尔管理有限公司。

实施例1制备人胰岛素

根据欧洲专利EP0055945发明详述中步骤A1至C1获得正确构象的人胰岛素原，并将其配制成1mg/ml的溶液。用浓氨水调节上述溶液pH值至8，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与人胰岛素原的质量比为1∶200，将混合液于15℃下反应2小时，用盐酸将pH值调为4以终止酶切反应，得到Arg^B31-人胰岛素。

将上述酶切后的溶液采用疏水层析进行纯化，采用苯基琼脂糖凝胶作为层析介质，洗脱液为溶于磷酸缓冲液的硫酸铵溶液，梯度0M-2M，得到纯化的Arg^B31-人胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-人胰岛素用pH为7.5的1M Tris缓冲液配制成1mg/ml的溶液，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与Arg^B31-人胰岛素的质量比为1∶200，将混合液于20℃反应2小时，用盐酸将pH值调为4以终止酶切反应，得到人胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速SPSepharose^TM作为层析介质，洗脱液为NaCl溶液，梯度20mM-160mM，得到纯化的人胰岛素。

将上述纯化的人胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的人胰岛素，测定纯度为99.71％(图2)。

实施例2制备人胰岛素

根据中国专利CN98813941.3实施例5-5.3获得正确构象的hGH-小胰岛素原融合蛋白，并将其配制成10mg/ml的溶液。用NaOH调节上述溶液pH值至10.8，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与hGH-小胰岛素原融合蛋白的质量比为1∶100，将混合液于4℃下反应5小时，用磷酸将pH值调为3.5以终止酶切反应，得到Arg^B31-人胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速CMSepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM，得到纯化的Arg^B31-人胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-人胰岛素用pH8的50mM Tris-HCl缓冲液配制成10mg/ml的溶液，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与Arg^B31-人胰岛素的质量比为1∶1000，将混合液于37℃反应1小时，用磷酸将pH值调为3.5以终止酶切反应，得到人胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速CMSepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM，得到纯化的人胰岛素。

将上述纯化的人胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的人胰岛素，测定纯度为99.85％(图3)。

实施例3制备人胰岛素

根据中国专利CN200610117742.8实施例1(说明书30-37段)获得正确构象的胰岛素原，并将其配制成15mg/ml的溶液。用NaOH调节上述溶液pH值至12，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与胰岛素原的质量比为1∶400，将混合液于12℃下反应3小时，用磷酸将pH值调为4以终止酶切反应，得到Arg^B31-人胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阴离子交换层析，采用DEAE Sepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于0.1M Tris和50％乙醇溶液的NaCl溶液，梯度20mM-50mM，得到纯化的Arg^B31-人胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-人胰岛素配制成20mg/ml的溶液，并用NaOH调pH值至10，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与Arg^B31-人胰岛素的质量比为1∶1500，将混合液于25℃反应2小时，用磷酸将pH值调为3.5以终止酶切反应，得到人胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速SPSepharose^TM作为层析介质，用NaCl溶液作为洗脱液，梯度为0M-0.5M，得到纯化的人胰岛素。

将上述纯化的人胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的人胰岛素，测定纯度为99.75％(图4)。

实施例4制备赖脯胰岛素(Lys^B28pro^B29-人胰岛素)

根据中国专利CN90101415.X实施例29(至说明书第74页第3段)得到正确构象赖脯胰岛素原，并将其配制成10mg/ml的溶液。用NaOH调节上述溶液pH值至11，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与赖脯胰岛素原的质量比为1∶600，将混合液于10℃下反应4小时，用盐酸将pH值调为2.5以终止酶切反应，得到Arg^B31-赖脯胰岛素前体。

将上述酶切后的溶液先进行阳离子交换层析，采用快流速CMSepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM；之后再进行阴离子交换层析，采用DEAESepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于0.1M Tris和50％乙醇溶液的NaCl溶液，梯度20mM-50mM，得到纯化的Arg^B31-赖脯胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-赖脯胰岛素前体配制成10mg/ml的溶液，并用50mM Tris-HCl缓冲液调pH至8，加热至35℃，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与赖脯胰岛素前体的质量比为1∶2000，将混合液于35℃反应1小时，用盐酸将pH值调为3以终止酶切反应，得到赖脯胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速CMSepharose^TM作为层析介质，洗脱液为溶于10mM柠檬酸缓冲液的NaCl溶液，梯度75mM-225mM，得到纯化的赖脯胰岛素。

将上述纯化的赖脯胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的赖脯胰岛素，测定纯度为99.86％(图5)。

本方法也可应用于中国专利CN90101415.X中其他的胰岛素类似物，制备方法同赖脯胰岛素，最终产品经纯度分析都可达99.8％。

实施例5制备赖谷胰岛素(Lys^B3Glu^B29-人胰岛素)

根据中国专利CN 98114950.2说明书和实施例2得到正确构象赖谷胰岛素原，并将其配制成5mg/ml的溶液。用浓氨水调节上述溶液pH值至9，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与赖谷胰岛素原的质量比为1∶800，将混合液于4℃下反应10小时，用盐酸将pH值调为2以终止酶切反应，得到Arg^B31-赖谷胰岛素前体。

将上述酶切后的溶液采用排阻层析进行纯化，采用葡聚糖凝胶作为层析介质，用5mM柠檬酸作为洗脱液，得到纯化的Arg^B31-赖谷胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-赖谷胰岛素前体配制成30mg/ml的溶液，并用NaOH调pH至9，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与赖谷胰岛素前体的质量比为1∶2500，将混合液于40℃反应0.5小时，用盐酸将pH值调为2以终止酶切反应，得到赖谷胰岛素。

将上述酶切后的溶液再进行阳离子交换层析，快流速CM Sepharose^TM作为层析介质，用NaCl溶液作为洗脱液，梯度为0M-0.5M，得到纯化的赖谷胰岛素。

将上述纯化的赖谷胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的赖谷胰岛素，测定纯度为99.71％(图6)。

本方法也可应用于中国专利98114950.2中其他的胰岛素类似物，制备方法同赖谷胰岛素，最终产品经纯度分析都可达99.7％。

实施例6制备门冬胰岛素(Asp^B28-人胰岛素)

根据中国专利CN86106574和CN98813941.3的方法得到正确构象门冬胰岛素原，并将其配制成5mg/ml的溶液。用NaOH调节上述溶液pH值至10，然后加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶与门冬胰岛素原的质量比为1∶600，将混合液于8℃下反应5小时，用盐酸将pH值调为2以终止酶切反应，得到Arg^B31-门冬胰岛素前体。

将上述酶切后的溶液先进行阴离子交换层析，采用Q Sepharose^TM作为层析介质，用NaCl溶液作为洗脱液，梯度为0M-0.5M；之后再进行阳离子交换层析，采用快流速SP Sepharose^TM作为层析介质，用NaCl溶液作为洗脱液，梯度为0M-0.5M，得到纯化的Arg^B31-门冬胰岛素前体。

将纯化后的Arg^B31-门冬胰岛素前体配制成50mg/ml的溶液，并用NaOH调pH至10，然后加入羧肽酶B，使羧肽酶B与门冬胰岛素前体的质量比为1∶3000，将混合液于30℃反应1小时，用盐酸将pH值调为3以终止酶切反应，得到门冬胰岛素。

将上述酶切后的溶液进行阳离子交换层析，采用快流速SPSepharose^TM作为层析介质，用NaCl溶液作为洗脱液，梯度为0M-0.5M，得到纯化的门冬胰岛素。

将上述纯化的门冬胰岛素(经氨基酸序列分析，所得结构与预期一致)可以再经过一次HPLC层析进行精纯，树脂为

C8，流动相为溶于0.25M醋酸铵缓冲液的乙腈，梯度17％-35％，得到精纯后的门冬胰岛素，测定纯度为99.85％(图7)。

本方法也可应用于中国专利CN86106574中其他的胰岛素类似物，制备方法同门冬胰岛素，最终产品经纯度分析都可达99.8％。

Claims (10)

1.一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；

（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；

（3）纯化步骤2的酶切产物；

（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；

（5）使用阳离子交换层析纯化步骤4的酶切产物；

其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中胰岛素选自人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素。

3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤3中的纯化步骤选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析、排阻层析、HPLC之一或其组合。

4. 根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤3中的纯化步骤包含阳离子交换层析纯化，并且层析介质与步骤5中的阳离子交换层析介质相同。

5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤5中阳离子交换层析的介质选自CM Sepharose™或SP Sepharose™。

6. 根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其还进一步包括在步骤5后使用HPLC进行精纯的步骤。

7. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；

（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；

（3）使用CM Sepharose™ 纯化步骤2的酶切产物；

（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；

（5）再次使用CM Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；

（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；

其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

8. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；

（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；

（3）使用CM Sepharose™和DEAE Sepharose™纯化步骤2的酶切产物；

（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；

（5）再次使用CM Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；

（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；

其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

9. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；

（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；

（3）使用Q Sepharose™和SP Sepharose™纯化步骤2的酶切产物；

（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；

（5）再次使用SP Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；

（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；

其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。

10. 根据权利要求7-9中任一项所述的制备方法，其中胰岛素选自人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素。

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