CN102617884A - 一种人血清白蛋白医用生物材料的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人血清白蛋白多孔状海绵或者薄膜的制作方法。将人血清白蛋白溶于pH范围为7.0-10.0的缓冲溶液中，缓慢加入戊二醛，通过调整戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶；清洗凝胶以除去凝胶中的缓冲液，然后用5％-30％甘油或含有凝血酶的5％-30％甘油溶液浸润，经冷冻干燥即可制成含或者不含凝血酶的人血清白蛋白多孔状海绵或薄膜。本发明方法制备得到的人血清白蛋白多孔状海绵和薄膜通过其多孔结构吸附创面血液形成凝血的网架，能够快速止血，同时具有无抗原性、生物相容性好、可降解、刺激细胞分裂、促进愈合的特点，相比现有医用材料有明显的进步。
Description
技术领域
本发明涉及一种人血清白蛋白医用生物材料制备方法，具体的说，涉及一种使用人血清白蛋白生产多孔状海绵或者薄膜的制备方法方法。
背景技术
寻找理想的医用生物材料一直是科学家们研究的焦点，这样的生物材料要求具有生物相容性、可塑性和稳定性，从而满足各种医疗上的要求，包括止血海绵，人造心瓣膜和血管的涂膜，人造骨和人造皮肤的结构材料以及伤口愈合敷料等。
目前临床上使用的医用可吸收材料其技术原理主要采用天然可吸收和人工合成可吸收材料二类，前者主要用羊肠、胶原纤维、甲壳素(壳聚糖)等制备，后者主要用聚乙交脂类、聚乳酸类、聚对二氧杂环己酮、羧甲基纤维等组成，上述产品的物理特性决定了现有产品与血液接接触时，会引发一系列非特异性的蛋白质吸附，并具有导致感染和组织排异等一系列非生物相容性反应的风险。
血液是在心血管系统中流动的一种液体组织。它在心脏推动下不断循环流动，担负着运输、防御、维持内环境相对稳定和实现体液调节等重要功能。血液从可流动的溶胶状态转变为不流动的凝胶状态的过程，称血液凝固，简称凝血。凝血是一个复杂的生化反应过程，涉及到许多血液中的凝血因子例如VIIa，，VIII，IX，von Willebrand因子等。凝血的最终表现是纤维蛋白形成。纤维蛋白在形成过程中交织成网，并把许多血细胞网罗其中，使原来液体状的血液逐渐变成血凝块。凝血酶(Thrombase)可以直接作用于纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白多聚体；它还可以促进血小板发生不可逆的聚集和血小板释放效应，加速血液凝固；同时它还促进上皮细胞生成，减少创面渗出。这些效应直接导致堵塞毛细血管的出血点而速效止血。凝血酶是目前国际公认的速效止血药。
外伤和手术操作通常造成大量失血现象，局部止血药物、材料可以控制创面渗血、保证术野清晰，对减少创伤、提高手术效率、加速患者术后恢复具有重要意义。多年来已经开发了众多止血剂耒控制出血。作为创伤止血材料目前已有大量文献报道[王秋卓，王彩虹，张文博，连霞.2010.可吸收性胶原止血海绵的制作工艺研究。《中国医药导报》2010年17期；王立军和陈榕.2004.胶原/壳聚糖复合表皮生长因子凝血酶海绵敷料的研制.《广东药学院学报》2004年第5期，471-472页；Yannas IV，Tzeranis DS，Harley BA，So PT.2010.Biologically active collagen-based scaffolds：advances inprocessing and characterization.Philos Transact A Math PhysEng Sci.368：2123-2139.Review；Jayakumar R，Chennazhi KP，Srinivasan S，Naif SV，Furuike T，Tamura H.2011.Chitinscaffolds in tissue engineering.Int J Mol Sci.12：1876-87；Jayakumar R，Prabaharan M，Sudheesh Kumar PT，NairSV，Tamura H.2011.Biomaterials based on chitin and chitosanin wound dressing applications.Biotechnol Adv.29：322-37]。临床上也有不少使用胶原蛋白或者壳聚糖等材料制作的产品例如无锡贝迪生物工程有限公司生产的可即邦
明胶海绵，和德州海利安生物科技股份有限公司生产的壳聚糖止血海绵。
胶原蛋白是生物体内的一种纤维蛋白，也是一种具有很高抗张强度的蛋白质，其多孔结构吸收血液后膨胀，形成凝血的网架，封闭血管裂口或创面，并激活血小板，达到止血目的。但胶原蛋白是一种异物，可发生发热，嗜酸粒细胞增多、皮肤过敏等不良反应，同时会增加伤口的感染，尤其是污染伤口，另外，其止血速度较慢，对血小板等止血成分的牵拉能力以及和创面的附着能力均差，容易破裂。尤其是自1996年3月，英国发现第一宗因食用患有疯牛病的牛肉而死于克雅氏病(海绵状脑病)的病例后，源于哺乳动物牛中的胶原蛋白被多数国家停止应用，其中也包括我国。中国政府为防止牛海绵脑病传入我国，已禁止进口和销售疯牛病发生国生产的一切从哺乳动物牛羊等中提取的原料和用于制备医药或化妆品的商品，并对市场上出售的含有以胶原蛋白为原料的商品实行召回制。为此胶原蛋白及其制品市场遇到很大困难。此外，虽然胶原蛋白具有较低的免疫原性，但对于某些特殊体质的人群依然存在组织不相容而引起免疫反应的风险。而壳聚糖作为异源物质，具有免疫不相容性和降解难控制的难题。因此，临床上急需性能更为优越的产品。
人血清白蛋白是构成血浆的主要成分，其生理功能主要是维持血浆胶体渗透压，还具有载体的功能(孙世光，余明莲，王建民等2009.人清血白蛋白的临床应用误区及其对策.解放军药学学报25(4)：366-368)。Munro等的研究表明，聚合物材料表面可逆吸附的白蛋白层具有良好的抗感染(Munro MS，Quattrone AJ，EllsworthSR，Kulkarni P，Eberhart RC.1981.Alkyl substituted polymerswith enhanced albumin affinity.Trans Am Soc Artif Intern Organs.27：499-503)，由此启发研究者在材料表面复合白蛋白来改善材料的生物相容性。
虽然人血清白蛋白作为药物载体而制成纳米颗粒而被国内外广泛研究(于耀宇，李建，李立宏，曲友直，于嘉，邓建平，高国栋，张文彬，焦德让.2011.磁性白蛋白纳米微粒的制备及其物理性能分析。《中国临床神经外科杂志》。16：609-611；张良珂侯世祥宋相容卢懿.2007.一种白蛋白纳米粒的制备与评价。《中国药学杂志》。42：365-367；Elmer J，Cabrales P，Wang Q，Zhang N，Palmer AF.2011.Synthesis and biophysical properties of polymerizedhuman serum albumin。Biotechnol Prog.27：290-296；Jain S，Mathur R，Das M，Swarnakar NK，Mishra AK.2011.Synthesis，pharmacoscintigraphic evaluation and antitumor efficacy ofmethotrexate-loaded，folate-conjugated，stealth albuminnanoparticles.Nanomedicine(London).6：1733-1754)，但据我们所知，使用戊二醛把人血清白蛋白作为一种基质材料生产多孔状的材料或膜还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人血清白蛋白医用生物材料的制备方法，具体可用于制作多孔状海绵或者薄膜。
首先，本发明涉及一种人血清白蛋白多孔状海绵的制作方法，包括以下步骤：
(1)、配制人血清白蛋白溶液：将人血清白蛋白溶于pH范围为7.0-10.0的缓冲溶液中，最终蛋白溶液中含有5％-30％(w/v)的人血清白蛋白；
(2)、缓慢加入0.025％-3％(v/v)的戊二醛，通过调整戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶；
(3)、清洗凝胶以除去凝胶中的缓冲液，然后用5％-30％(w/v)甘油或含有10-100U/ml凝血因子的5％-30％甘油溶液中浸润30-60分钟。
(4)、将人血清白蛋白凝胶经冷冻干燥，即可制成含或者不含凝血因子的人血清白蛋白多孔状海绵。
本发明还涉及一种人血清白蛋白薄膜的制作方法，包括以下步骤：
(1)、配制人血清白蛋白溶液：将人血清白蛋白溶于pH范围为7.0-10.0的缓冲溶液中，最终蛋白溶液中含有5％-30％(w/v)的人血清白蛋白；
(2)、缓慢加入0.025％-3％(v/v)的戊二醛，通过调整戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶；
(3)、清洗凝胶以除去凝胶中的缓冲液，然后用5％-30％甘油或含有10-100U/ml凝血因子的5％-30％甘油溶液中浸润30-60分钟；
(4)、将人血清白蛋白凝胶干燥后，即可获得具有较强延展性和机械强度的含或者不含凝血因子的人血清白蛋白薄膜。
上述方法制备得到的多孔状海绵或者薄膜，其基质成分为单一的人血清白蛋白。人血清白蛋白可以通过基因工程重组表达生产，或者可从人血浆中提取。
上述方法中，所述的缓冲液为能够维持在水溶液状态下pH值为7.0-10.0的任何一种缓冲液，可任选自磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液、碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或二乙醇胺缓冲液等，优选碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液；优选缓冲液的pH为7.0-9.0，更优选为7.0-8.0；浓度范围为1-100mM，优选5-40mM，最优选为10-20mM。
在配制人血清白蛋白溶液过程中，在搅拌使白蛋白彻底溶解成为透明状液体后，可用真空泵抽气30-60分钟使得溶液中气泡快速消除。
上述方法中，调整交联剂戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶，更优选的浓度为0.08％-2.0％(v/v)，最优选的为0.125％-1.25％(v/v)。在达到饱和度之前，戊二醛的浓度愈高，则白蛋白凝胶交联程度愈高。
上述方法中，凝血因子可任选自以下的一种组分或其混合物：凝血酶，重组人凝血因子VIIa，重组人凝血因子VIII，重组人凝血因子IX或重组人von Willebrand因子，其中最优先考虑的成分是凝血酶。
其中，凝血因子的单位(U)为国际标准单位，即美国国立卫生研究院(NIH)制定的标准单位。
在制备多孔海绵时，步骤(4)中的冷冻干燥过程可优选为将白蛋白凝胶放置于-40～-70℃超低温冰箱冰冻1-4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥5-24小时，可制成含或者不含凝血酶的具有多孔状的人血清白蛋白海绵。由于此海绵是由极具亲水性的白蛋白构成，因此具有具有极强的吸水性，其吸水率可高达35倍。孔隙率可达93.5％。
而在制备蛋白薄膜时，经甘油浸润后的凝胶可选择在20-40℃烘箱(优选37℃)或者室温干燥12-36小时，可获得具有较强延展性(伸长率6-10％)和机械强度(断裂强度为0.2-1.0cN/dtex)的人血清白蛋白薄膜。
上述方法制备好的人血清白蛋白多孔状海绵或薄膜经干燥密封，可长期保存。
本发明使用人血清白蛋白生产多孔状海绵和薄膜，这将从根本上改善组织相容性问题。人血白蛋白海绵通过其多孔结构吸附创面血液形成凝血的网架，封闭血管裂口或创面，并激活血小板，达到止血目的。大鼠测试结果显示人白蛋白多孔海绵在面对脆性血管的穿刺伤口得活跃出血时，可非常有效地实现完全止血。人血清白蛋白多孔海绵(不含有凝血酶)止血所需的时间为52±8秒，耐受动脉压力为150mmHg；而含有凝血酶的人白蛋白多孔海绵为35±10秒，耐受动脉压力为300mmHg；胶原蛋白止血海绵为63±5秒，耐受动脉压力为150mmHg。实验结果证明含有凝血酶的人血清白蛋白多孔海绵可以非常牢固地粘附到血管，具有止血效果好、较高的动脉压力耐受性，使用安全方便的特点。
此外，人血清白蛋白能诱导血小板附着，产生释放反应，激活凝血因子，对损伤的血管壁起堵塞作用而达到止血目的，同时它具有无抗原性、生物相容性好、可降解、刺激细胞分裂、促进愈合的特点。
从动物组织中提取的胶原蛋白由于动物组织本身可能携带病毒(疯牛病、猪瘟疫)而使胶原蛋白产品存在病毒隐患。而本发明方法制备的人血清白蛋白多孔状海绵和薄膜优选使用基因重组技术生产的人血清白蛋白从根本上避免了这个问题。基因重组人血清白蛋白是根据人体白蛋白基因构建的，因此在酵母中表达的人白蛋白与人血浆来源的白蛋白完全一致，在进入人体后，有很好的生物相容性。而且材料亲水性优良，拥有很强的吸附其他蛋白的能力。敷于体表创面，创面干燥，不易发生感染，创面愈合迅速。用于体内脏器止血，材料可降解、吸收性好，因此相对于现有的医用材料具有明显的进步。
附图说明
图1人血清白蛋白多孔海绵和薄膜制作方法的一个优选工艺流程图
图2人血清白蛋白多孔海绵止血实验流程图
具体实施方式
实施例1
称取重组人血清白蛋白0.5克(5％，w/v)，溶解在由去离子水配制的10ml碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(10mM，pH 7.4)。37℃间断搅拌1小时，使其溶解，待蛋白彻底溶解成为透明状液体后，用真空泵抽气30分钟使得溶液中气泡快速消除。缓慢加入0.25％(v/v)的戊二醛，使之形成凝胶。用去离子水将此凝胶清洗3遍，每次2升，3小时，以除去凝胶中的缓冲液。由去离子水配制10％甘油，将白蛋白凝胶浸润30分钟。将白蛋白凝胶放置于-70℃超低温冰箱冰冻4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥24小时，可制成不含有凝血酶，具有多孔状的海绵。将白蛋白多孔海绵密封4℃干燥保存。此白蛋白多孔海绵具有具有极佳的吸水性，其吸水率可高达35倍，孔隙率可达93.5％。此外此海绵还具较佳的延展性(伸长率8％-10％)和机械强度(断裂强度为0.4-0.6cN/dtex)，适合应用于术后腔内止血纱布。
实施例2
称取血浆来源的人血清白蛋白0.5克(5％，w/v)，溶解在由去离子水配制的10ml碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(10mM，pH 7.4)。37℃间断搅拌，使其溶解，待蛋白彻底溶解成为透明状液体后，用真空泵抽气30分钟使得溶液中气泡快速消除。缓慢加入0.25％(v/v)的戊二醛，使之形成凝胶。用去离子水将此凝胶清洗3遍，每次2升，3小时，以除去凝胶中的缓冲液。由去离子水配制10％甘油，将白蛋白凝胶浸润30分钟。将白蛋白凝胶放置于-70℃超低温冰箱冰冻4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥24小时，可制成不含有凝血酶，具有多孔性的海绵。此海绵的性能略差于实施例1中的来自于基因重组的白蛋白海绵，其吸水率可达25倍，孔隙率达90.5％。伸长率为6％-8％，断裂强度为0.2-0.4cN/dtex)，也可应用于术后腔内止血纱布。
实施例3
称取通过基因工程菌酵母发酵生产的人血清白蛋白1.0克(10％，w/v)，溶解在由去离子水配制的10ml磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.4)。37℃间断搅拌1，使其溶解，待蛋白彻底溶解成为透明状液体后，用真空泵抽气30分钟使得溶液中气泡快速消除。缓慢加入0.125％(v/v)的戊二醛，使之形成凝胶。用去离子水将此凝胶清洗3遍，每次2升，3小时，以除去凝胶中的缓冲液。由去离子水配制10％甘油，将白蛋白凝胶浸润30分钟。将白蛋白凝胶放置于-70℃超低温冰箱冰冻4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥24小时，可制成不含有凝血酶，具有多孔性的海绵。此白蛋白海绵具有较差的吸水性(12倍)，孔隙率为75％。由于使用较高的白蛋白浓度(5％增加到10％，w/v)，具有较强的机械强度和硬度，其断裂强度为0.9-1.0cN/dtex，适合于需要较强机械性能的可降解医用器械。
实施例4
称取通过基因工程菌酵母发酵生产的人血清白蛋白0.5克(5％，w/v)，溶解在由去离子水配制的10ml碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(10mM，pH 7.4)。37℃间断搅拌1，使其溶解，待蛋白彻底溶解成为透明状液体后，用真空泵抽气30分钟使得溶液中气泡快速消除。缓慢加入0.25％(v/v)的戊二醛，使之形成凝胶。用去离子水将此凝胶清洗3遍，每次2升，2-4小时，以除去凝胶中的缓冲液。由去离子水配制10％甘油，再加入50U/ml凝血酶，将白蛋白凝胶浸润30分钟。经过浸润后，将白蛋白凝胶放置于-70℃超低温冰箱冰冻4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥24小时，可制成含有凝血酶，具有多孔状的海绵。将白蛋白多孔海绵密封4℃干燥保存。此白蛋白多孔海绵的性能与实施例1中的海绵一样，其差别为此海绵含有吸附状的凝血酶，可增强凝血效果。
实施例5
称取通过基因工程菌酵母发酵生产的人血清白蛋白0.5克(5％，w/v)，溶解在由去离子水配制的10ml碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(10mM，pH 7.4)。37℃间断搅拌，使其溶解，待蛋白彻底溶解成为透明状液体后，用真空泵抽气30分钟使得溶液中气泡快速消除。缓慢加入0.25％(v/v)的戊二醛，使之形成凝胶。用去离子水将此凝胶清洗3遍，每次2升，3小时，以除去凝胶中的缓冲液。由去离子水配制10％甘油，将白蛋白凝胶浸润30分钟。经过甘油浸润但未经过-70℃冰冻的凝胶放置于37℃烘箱或者室温干燥过夜，可获得具有较强延展性和机械强度的人白蛋白薄膜，其伸长率为6％-8％，断裂强度为0.8-1.0cN/dtex，可应用于术后腔内防肠粘连。
实施例6
大鼠穿刺的股动脉。大鼠股动脉穿刺是研究止血和组织粘附机理的优良动物模型。控制从受伤的大鼠股血管的出血是一个止血上挑战。通过暴露两侧股动脉，用30规格的针耒穿刺动脉，形成动脉破口和活跃出血。
用巴比妥钠将大鼠麻醉后，将5只大鼠(体重520±20克)的股动脉双侧暴露，在每一右侧动脉上形成穿刺伤口，将含有凝血酶的人白蛋白多孔海绵(5mm3)(实施例3获得)或者不含凝血酶的人白蛋白多孔海绵(5mm3)(实施例1获得)，或者胶原蛋白止血海绵(作为对照)置于穿刺位点。对海绵轻轻按压10秒，释放后该海绵下有非常微量的出血，再次进行轻微的手动按压2秒，但仍有逐步减低速率的微量出血，未进行继续按压，计算出血完全停止的时间。观察到完全止血后20分钟，在所述股动脉的近端和远端进行结扎，进行爆裂强度测试。大鼠测试结果显示人白蛋白多孔海绵(不含有凝血酶)止血所需的时间为52±8秒，耐受动脉压力为150mmHg；而含有凝血酶的人白蛋白多孔海绵为35±10秒，耐受动脉压力为300mmHg；胶原蛋白止血海绵为63±5秒，耐受动脉压力为150mmHg。我们的结果证明人白蛋白多孔海绵尤其是含有凝血酶的海绵，在面对脆性血管的穿刺伤口得活跃出血时，可非常有效地实现完全止血和耐受较高动脉压力。
Claims (10)
1.一种人血清白蛋白多孔状海绵的制作方法，包括以下步骤：
(1)、配制人血清白蛋白溶液：将人血清白蛋白溶于pH范围为7.0-10.0的缓冲溶液中，最终蛋白溶液中含有5％-30％(w/v)的人血清白蛋白；
(2)、缓慢加入0.025％-3％(v/v)的戊二醛，通过调整戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶；
(3)、清洗凝胶以除去凝胶中的缓冲液，然后用5％-30％(w/v)甘油或含有10-100U/ml凝血因子的5％-30％甘油溶液中浸润30-60分钟
(4)、将人血清白蛋白凝胶经冷冻干燥，即可制成含或者不含凝血因子的人血清白蛋白多孔状海绵。
2.一种人血清白蛋白薄膜的制作方法，包括以下步骤：
(1)、配制人血清白蛋白溶液：将人血清白蛋白溶于pH范围为7.0-10.0的缓冲溶液中，最终蛋白溶液中含有5％-30％(w/v)的人血清白蛋白；
(2)、缓慢加入0.025％-3％(v/v)的戊二醛，通过调整戊二醛的浓度可获得具有不同交联度的人血清白蛋白凝胶；
(3)、清洗凝胶以除去凝胶中的缓冲液，然后用5％-30％甘油或含有10-100U/ml凝血因子的5％-30％甘油溶液中浸润30-60分钟；
(4)、将人血清白蛋白凝胶干燥后，即可获得具有较强延展性和机械强度的含或者不含凝血因子的人血清白蛋白薄膜。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中的缓冲液为能够维持在水溶液状态下pH值为7.0-10.0的任何一种缓冲液，可任选自磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液、碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或二乙醇胺缓冲液等。
4.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中缓冲液的pH为7.0-9.0。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中缓冲液浓度范围为1-100mM。
6.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，在配制人血清白蛋白溶液过程中，搅拌使白蛋白彻底溶解成为透明状液体后，可用真空泵抽气30-60分钟使得溶液中气泡快速消除。
7.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，交联剂戊二醛的浓度0.08％-2.0％(v/v)。
8.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，凝血因子可任选自以下的一种组分或其混合物：凝血酶，重组人凝血因子VIIa，重组人凝血因子VIII，重组人凝血因子IX或重组人von Willebrand因子。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中的冷冻干燥过程为将白蛋白凝胶放置于-40～-70℃超低温冰箱冰冻1-4小时以上，再将冰冻白蛋白凝胶放入冻干机中，抽真空干燥5-24小时，可制成含或者不含凝血酶的具有多孔状的人血清白蛋白海绵。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(4)经甘油浸润后的凝胶可选择在20-40℃烘箱(优选37℃)或者室温干燥12-36小时，可获得具有较强延展性(伸长率6-10％)和机械强度(断裂强度为0.2-1.0cN/dtex)的人血清白蛋白薄膜。
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