CN102617642B - 一种含2-乙基咪唑的双膦酸化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含2-乙基咪唑的双膦酸化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和用途。制备该化合物的方法为将2-乙基咪唑与丙烯酸进行接触，使其发生迈克尔加成反应；反应得到的中间产物再在磷酸和三氯化磷存在下进行膦酸化反应，得到目标产物。本发明的方法合成步骤简单，省去了N烷基化步骤，直接在咪唑环的N位上引入羧酸基团，转化率达到59%，产物易分离，适宜工业化生产应用，该化合物可用于制备治疗骨肉瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种含2-乙基咪唑的双膦酸化合物及其制备方法和应用。
背景技术
骨肉瘤(osteosarcoma)是常见的骨原发性恶性肿瘤，同时也是骨骼系统疾病中最具有危害性和代表性的肿瘤之一。其主要特征表现为：以青少年多见，病死率极高，局部侵袭性强，容易复发和发生骨转移，起病时无典型的临床症状，预后较差。故骨肉瘤给患者本身、患者家庭以至社会都带来了问题，也对临床治疗提出了挑战。因此，骨肉瘤的治疗研究一直备受国内外医学研究者的关注[万洪宇.骨肉瘤治疗研究的新进展.中外健康文摘，2010，8（18），383-384]。
骨肉瘤的主要治疗手段包括手术和化疗。但是手术治疗容易造成较大的骨缺损，严重影响了肢体功能。同时，大多数化疗药物对骨肉瘤的敏感度较低，临床中缓解率能达到20％的药物主要有多柔比星、顺铂、异环磷酰胺和高剂量甲氨蝶呤等[LabotkaRJ.Principlesandpracticeofpediatricontology.JAMA，2006，296(4)：452-453]，临床应用常以高剂量甲氨蝶呤和顺铂为主。但由于使用高剂量甲氨蝶呤时要求进行血药浓度监测，而顺铂又具有较大的肾毒性，因此开发新的治疗策略和研发新的治疗药物成为新的希望途径。
双膦酸盐因具有稳定的P–C–P骨架结构，且对骨具有很高的亲和作用，因此已成为一种重要的、临床应用广泛的骨病治疗药物，主要包括骨质疏松症、高钙血症、多发性骨髓瘤、骨痛和畸形性骨炎等[VasireddyS.,TalwarkarA.,MillerH.PatternsofpaininPaget'sdiseaseofboneandtheiroutcomesontreatmentwithpamidronate.ClinRheumatol.2003,22,376-380]。
发明内容
本发明的目的是提供一种含2-乙基咪唑的双膦酸化合物。
本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法及其应用。
本发明实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种含2-乙基咪唑的双膦酸化合物，该化合物是具有如下的结构式（I）：
（I）
或其药学上可接受的盐。
Lin,J.G.等[Nuel.Med.Biol.2011,38,619-629]公开了一种在咪唑环N位上引入羧酸的方法，该方法是先经过N烷基化反应合成相应的酯后，再进行水解得到相应的羧酸，其存在合成路线长，产物收率只有39.7%。
本发明提供一种合成具有上述结构式的化合物的方法：（1）将2-乙基咪唑与丙烯酸进行接触，使其发生迈克尔（Michael）加成反应；（2）反应得到的中间产物再在磷酸和三氯化磷存在下进行膦酸化反应，得到目标产物。
其合成路线如下
步骤（1）的反应是迈克尔（Michael）加成反应的推广运用，即一个亲电的共轭体系（丙烯酸）和一个亲核的负离子（2-乙基咪唑）进行共轭加成。
具体合成过程：（1）以N,N-二甲基甲酰胺（即DMF）为溶剂，在吡啶存在下，加入2-乙基咪唑，再缓慢加入丙烯酸，发生迈克尔（Michael）加成反应，得到中间产物（为连接有咪唑环的羧酸）。反应液采用旋转蒸发除去溶剂DMF，再用异丙醇溶解，过滤除去不溶物（丙烯酸双取代物），滤液经活性碳脱色，重结晶得到中间产物。（2）将纯化的中间产物与磷酸和三氯化磷发生膦酸化反应，得到含2-乙基咪唑的双膦酸。
在步骤（1）中丙烯酸过量时容易产生双取代物，可加入阻聚剂如对苯二酚，可抑制双取代产物的生成。
进一步，对苯二酚按2-乙基咪唑质量的0.5～2%加入。
进一步，吡啶为迈克尔（Michael）加成反应的催化剂，其用量为迈克尔加成反应时反应液体积的0.1～10%。
更进一步，吡啶的用量为反应液体积的0.2～2%。
丙烯酸在光照或高温条件下容易发生聚合，因此缓慢滴加丙烯酸能够减少双取代物的产生。在其它反应条件不变时，若滴加速度过快，在重结晶时不溶物会增多，说明不利于反应转化率的提高。
进一步，2-乙基咪唑与丙烯酸的摩尔用量比优选1:（0.7～1.5），反应温度为150～170℃。
更进一步，2-乙基咪唑与丙烯酸的摩尔用量比更优选1:（0.9～1.2）。
步骤（2）的膦酸化时，磷酸（采用市售的85%w/w磷酸）用量要适中，使反应体系中的水（水主要由85%的磷酸带入）与三氯化磷能刚好完全反应为好。滴加三氯化磷时，搅拌速度要快，但滴加要慢，从而使三氯化磷滴下后能和反应物充分的接触反应。
进一步，膦酸化时反应温度为100～115℃。
结构式（I）在药学上可接受的盐，如钠盐、胺盐，可通过具有结构式（I）的化合物与相应的碱（如氢氧化钠）反应得到。
所述含2-乙基咪唑的双膦酸化合物用于制备治疗骨肉瘤的药物。
本发明的方法合成步骤简单，省去了N烷基化步骤，直接在咪唑环的N位上引入羧酸基团，该步的转化率达到59%，较传统方法的39%要高，产物易分离，适宜工业化生产应用。对该化合物进行人骨肉瘤U2-OS细胞的MTT（噻唑蓝）实验和PI-Hoechst染色实验结果表明：该化合物对人骨肉瘤U2-OS细胞具有明显的抑制作用，其半抑制浓度(IC50)为28.2μmol/L。
附图说明
图1：产物3-（2-乙基-咪唑-1-氨基）丙酸的电喷雾质谱（ESI-MS）谱图。
图2：产物EIPrDP的电喷雾质谱（ESI-MS）谱图。
图3-a：对照组（未给药）的荧光显微镜图。
图3-b：加药组（30μmol/LEIPrDP）的荧光显微镜图。
具体实施方式
下面结合优选的实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例1：3-（2-乙基-咪唑-1-基）丙酸的合成
在150ml三口烧瓶中，加入2-乙基咪唑（9.6g，0.1mol），DMF70ml，吡啶0.3～0.5ml，氮气置换烧瓶内的空气，油浴升温，待烧瓶内温度为160℃时，用恒压滴液漏斗缓慢滴加丙烯酸(7.2g，0.1mol)，约1小时左右滴加完毕。保持该温度并不断向体系中充入N2，搅拌反应12h～16h。停止反应，冷却，旋转蒸发除去DMF，得到红褐色油状物。加入至异丙醇于80℃溶解，过滤除去丙烯酸双取代不溶物，滤液经活性炭脱色并重结晶，得灰白色固体5.6g，收率为33.4%。
实施例2
在实施例1的基础上加入阻聚剂对苯二酚（0.055g～0.22g），2-乙基咪唑与丙烯酸的摩尔比例为1:1.2,丙烯酸的滴加时间变为2h。得灰白色固体7.1g，收率为42.6%。
实施例3
在实施例2的基础上将2-乙基咪唑与丙烯酸的摩尔比例调整为1:1，其它条件不变，得灰白色固体8.4g，收率为50.6%。
实施例4
在实施例2的基础上将2-乙基咪唑与丙烯酸的摩尔比例为1:0.9，其它条件不变，得灰白色固体8.9g，收率为59.6%。
实施例1～4所得灰白色固体的结构确认：
1.熔点:105-107oC
2.ESI-MS(图1):169(M+1)
3.IR:3435(nO-H),3336(nCH2),1660(nC=O),1454(nC=C),1440(nC-N)
4.1HNMR(400MHz,DMSO):
δ7.034(d,J=1.2Hz,aH),δ6.742(d,J=1.2Hz,bH),δ4.083-4.049(t,J=6.8Hz,cH),δ2.686-2.613(m,4H,dH,eH),δ1.211-1.173(t,J=7.6Hz,fH)。
实施例5：1-羟基-3-（2-乙基-1H-咪唑-1-基）丙烷-1,1双膦酸（缩写EIPrDP）的合成
3-(2-乙基-咪唑-1-基)丙酸（3.36g，0.02mol）、氯苯15ml和浓度85（质量）%的磷酸4.12ml（0.06mol）的混合物置于100ml三口烧瓶中，加热至110℃搅拌溶解，保持15分钟，然后降温到80℃以下，缓慢滴加三氯化磷7.6ml，约40min滴加完毕。搅拌下升温到110℃，壁上会有黄色杂质生成，反应液变成粘稠物质，维持该条件1h后停止反应。冷却至室温，倒去上层氯苯，加入9mol/L的盐酸20ml，搅拌回流过夜，然后加入活性炭1.0g，回流30min，过滤。滤液旋转蒸发至油状物，然后加入到大量无水乙醇中，析出白色固体。用水和乙醇对所得的白色固体重结晶,目标产物的收率为57.3%[以3-（2-乙基-咪唑-1-基）丙酸为计算基础]。
目标产物的结构确认：
1.熔点:185-188℃
2.元素分析(C8H16N2O7P2):元素分析值（计算值）/%：C：30.58%，H：5.13%，N：8.92%；（实测值）/%：C：30.62%，H：5.23%，N：8.97%
3.ESI-MS(图2):313(M-1),331(M+H2O-1)
4.IR:3432(nO-H),1453(nC=C),1440(nC-N),1165(nC-O),784(nP-C)
5. 1HNMR(400MHz,D2O):
7.348(d,J=1.6Hz,aH),7.235(d,J=1.6Hz,bH),4.395-4.354(m,dH),2.956(dd,J=7.6Hz,cH),2.429-2.319(m,fH),1.305-1.267(t,J=7.6Hz,eH）。
实施例6：EIPrDP对人骨肉瘤U2-OS细胞的MTT比色实验
用胰酶消化对数生长期细胞并接种于96孔板，为防止边缘效应，板左右两侧的孔不加细胞。设置空白孔（只加培养液不加细胞）进行调零，剩余每孔加入100μL的细胞悬液（约含7×103个细胞），置于培养箱（CO2含量5%，温度37℃）中过夜。24h后测试组和对照组分别加入100μLEIPrDP溶液（浓度范围：2.5～50μmol/L）和100μL培养液，每组设8个平行孔，继续在培养箱中培养至96h。然后加入MTT溶液20μL（浓度为5mg/mL），再在培养箱中培养4h，终止培养，小心吸掉上清液，每孔中加入100μLDMSO，震荡5-10min。在490nm处用酶联免疫仪测定各孔吸光度值，用直线回归法计算EIPrDP半抑制浓度（IC50）值为28.2μmol/L。
实施例7：PI-Hoechst染色法检测EIPrDP对U2-OS细胞的抑制作用
取对数生长期的细胞，用实施例6中的方法对细胞进行培养，培养96h后，小心吸掉上清液，再加入40μLHoechst-PI溶液（浓度为10μg/mL），在培养箱孵化10-20min，然后用倒置荧光显微镜观察并采集图像。
荧光显微镜下正常细胞呈现淡蓝色，细胞核完整；凋亡细胞呈现亮蓝色，细胞核呈碎块状致密浓染；死亡细胞则呈现橙红色。从图3-a和图3-b可看出，EIPrDP对骨肉瘤U2-OS细胞有明显的抑制作用，表明其可作为一种治疗骨肉瘤的新型药物。
Claims (5)
1.一种治疗骨肉瘤的含2-乙基咪唑的双膦酸化合物，该化合物是具有如下的结构式（I）：
（I）
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1所述含2-乙基咪唑的双膦酸化合物的制备方法，其特征在于：（1）在吡啶的催化下，将2-乙基咪唑与丙烯酸进行接触，使其发生迈克尔加成反应；（2）反应得到的中间产物再在磷酸和三氯化磷存在下进行膦酸化反应，得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤（1）所述的反应中加入对苯二酚。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将具有结构式（I）的化合物与碱反应得到其药学上可接受的盐。
5.权利要求1所述含2-乙基咪唑的双膦酸化合物的用途，其特征在于：在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
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