CN102600171A - 一类苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构、合成方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了提供了式I所示化合物结构、合成方法、及其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，这类化合物作为醛糖还原酶抑制剂，通过抑制醛糖还原酶的活性，有效地降低山梨醇在体内的蓄积，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。本发明还提供了包含此类化合物的具有预防和/或治疗糖尿病并发症作用的药物组合物。

Description

一类苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物作为醛糖还原酶抑制剂的结构、合成方法及用途

技术领域

本发明涉及有机化学、药物化学及药物治疗学领域，具体涉及到一类新颖的醛糖还原酶抑制剂的结构、制备方法、对醛糖还原酶(Aldose Reductase，ALR2)的抑制作用以及在预防和/或治疗糖尿病并发症方面的应用。 

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)已是世界性的严重危害人类健康的疾病，糖尿病的危害性主要在于其并发症。糖尿病并发症包括肾病、视网膜病、神经性疾病和心脑血管疾病等代谢功能综合症。由于糖尿病并发症的高致残率和高致死率，它已成为世界上大多数国家居民健康和寿命的主要威胁之一。但是，目前在世界范围内针对糖尿病并发症的药物几乎是一片空白。依帕司他(Epalrestat)是目前唯一的上市药物，但仅限于日本市场，近期被引入中国。 

大量动物和临床实验已证明醛糖还原酶抑制剂对治疗糖尿病并发症非常有效。过去30年中，至少有14种醛糖还原酶抑制剂被证明非常有效并且已通过II期临床。其中最有效的是在日本已上市的依帕司他、和已进入或通过III期临床的非达司他(Fidarestat)和AS-3201。而其中非达司他被证明比已上市的依帕司他更有效，它在体内的抑制效果要远远高于依帕司他。尽管如此，很多醛糖还原酶抑制剂仍存在生物利用度低，治疗效果不佳或严重的副作用和过敏性反应等问题，甚至有的已经上市的药物由于致敏作用而撤市。因此，开发更为安全有效的治疗糖尿病并发症的药物是当务之急。基于上述背景，本发明以苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪做为母体结构，设计并合成 了一系列新型化合物，并评价、确定了部分化合物作为醛糖还原酶抑制剂化合物在大鼠体内外对ALR2的抑制作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的对ALR2具有较强抑制能力的化合物及其制备方法，并通过提取大鼠晶状体的醛糖还原酶和建立链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的大鼠糖尿病模型进行部分化合物在大鼠体内外对ALR2的抑制活性实验，证明了部分化合物是高效的醛糖还原酶抑制剂，能够明显的抑制ALR2的活性，降低山梨醇在体内的蓄积，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症的作用。 

因此，本发明的第一个方面，提供了式I所示化合物结构、合成、药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途， 

其中，X为C、N； 

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基； 

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基，酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基； 

R₃为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基、酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇的杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。 

优选地，上述化合物具有式II所示的结构 

式中，其中，X为C、N； 

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基； 

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基、酰胺基、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇杂环或杂环烷基； 

R₃-R₆为H、卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。 

更优选地，上述化合物具有式III所示的结构 

式中，其中，X为C、N； 

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基； 

R₂为H、C₁--C₄烷氧基、羟基、氨基； 

R₃-R₆为H、卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。 

本发明还提供了一种用于预防和/治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：治疗有效量的式I所示的苯并噻二嗪或吡啶噻二嗪类化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。 

本发明的第二方面，提供了一种具有式I结构的化合物的制备方法，包括步骤： 

(i)以式Ia为原料，用氯磺酸异氰酸酯(X＝C时)或氯磺酸(X＝C时)作为磺化剂，经过2-3步操作形成式Ib化合物： 

或 

(ii)以式Ib为原料，在原甲酸三乙酯存在下，回流反应，从而形成式Ic化合物： 

(iii)以式Ic为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在4位N上偶联上基团R₂，从而形成式Id化合物： 

(iv)在二氧六环或异丙醇或无水乙醇中，用硼氢化钠对式Id进行加氢还原，从而形成式Ie化合物： 

(v)以式Ie为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在2位N上偶联上基团R₃，从而形成式If化合物： 

(vi)以式If为原料，形成所需的衍生物，包括酯，酸，酰胺，含氮和/或氧的杂环化合物。 

其中，R₁--R₃的定义如上中所述。 

在优选例中，提供了一种具有式II结构的化合物的制备方法：以式Ie和取代的或未取代的苄基溴为原料，在惰性条件和碱存在下，通过C-N偶联形成式II化合物： 

其中，R₁-R₆的定义如上所述。 

在更优选例中，提供了一种具有式III结构的化合物的制备方法，包括步骤： 

(i)以式Ic和溴乙酸甲酯为原料，在乙腈和碳酸钾存在下，形成式IIId化合物： 

(ii)在二氧六环或异丙醇或无水乙醇中，用硼氢化钠对式IIId进行加氢还原，从而形成式IIIe化合物： 

(iii)以式IIIe和取代的或未取代的苄基溴为原料，在惰性条件和碱存在下，通过C-N偶联形成式IIIf化合物： 

(iv)对式IIIf进行水解，形成式IIIh化合物： 

(v)对式IIIf进行氨化，形成式IIIi化合物： 

其中，R₁-R₆的定义如上中所述。 

本发明的第三方面，提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：治疗有效量的是如权利要求1-4中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为的醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症药物上的应用。 

9.一种用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：治疗有效量的结构式I所示化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。 

本发明的主要优点在于： 

经过广泛而深入的研究，合成了一类新型的具有结构式I的苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物，并经过体内外实验证实了此类化合物对ALR2有很好的抑制作用，能够有效地降低STZ诱导的糖尿病模型大鼠体内山梨醇的蓄积，且对醛还原酶(Aldehyde Reductase，ALR1)没有明显的抑制作用，说明本发明的苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物是高效的、高选择性、低毒的醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的用途。 

基团定义 

如本文所用，术语“C₁--C₄烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或类似基团。 

术语“C₁--C₄烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基或类似基团。 

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。 

术语“C₁--C₄卤代烷基”指被相同或不同的1-6个上述卤原子取代的上述C₁--C₄烷基，如三氟甲基、五氟乙基或类似基团。 

术语“C₄--C₇的杂环”指骨架结构由4-7个C和N或O或S构成的芳香或非芳香杂环，如四氮唑，恶二唑酮，哒嗪，嘧啶或类似基团。 

术语“芳基”指单环至三环的芳簇烃基，如苯，萘或类似基团。 

术语“芳烷基”指被上述芳基取代的C₁--C₄烃基，如苄基，萘甲基或类似 基团。 

活性成份 

如本文所用，术语“活性成分”、“活性化合物”、“本发明的化合物”、“新型的醛糖还原酶抑制剂”可以互换使用，这些术语所指的均为本发明的具有结构式I所示的并噻二嗪和吡啶并噻二嗪化合物、药学上可接受的盐或它们的混合物。 

药物组合物 

本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含： 

(a)预防和/或治疗有效量的式I所示的并噻二嗪和吡啶并噻二嗪化合物、药学上可接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和 

(b)药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。 

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”都包含在术语“含有”中。 

本发明中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、和过敏反应)即有合理的效益/风险比的物质。 

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质或其生理上可接受的盐传送给人和/或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是固体或液态。 

本发明所述的药物组合物所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂，其中组合物的总重量为100％。 

附图说明附图表示的是下述实施列33中的大鼠晶状体山梨醇含量标准曲线，Y轴为荧光强度为Y轴，X轴为标准品山梨醇浓度。 

具体实施方式

以下将用实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明， 但不可以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数及说明，除另外说明外，都是以质量为依据。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。 

实施例1[2-(4-溴-2-氟苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物1)

向圆底烧瓶中加入2-氨基苯磺酰胺(17.2g，100mmol)和150mL原甲酸三乙酯150mL，搅拌回流2h，恢复到室温后，过滤，滤饼用无水乙醚洗涤，干燥得到4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧(16.2g，89％)：熔点：226-228℃；¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ7.28(m，1H)，7.43(m，1H)，7.65(m，1H)，7.78(m，1H)，7.96(s，1H)，12.28(s，1H)。 

往圆底烧瓶中加入4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧(14.6g，80mmol)，碳酸钾(12g)，溴乙酸甲酯(13.4g，88mmol)和乙腈(180mL)，70℃下反应2h，旋蒸除去溶剂后过滤，用水反复洗涤，干燥。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到白色晶体(4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基)乙酸甲酯(16.9g，83％)：熔点：154-156℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ3.74(s，3H)，5.10(s，2H)，7.34(d，1H)，7.55(m，1H)，7.74(m，1H)，7.91(d，1H)，8.10(s，1H)。 

将(4H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基)乙酸甲酯(12.7g，50mmol)溶于二氧六环中，加入NaBH4(8g)，室温下反应5min，冰浴下缓慢加入稀盐 酸中和，将生成的固体过滤，水洗，干燥.粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到白色晶体(3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基)乙酸甲酯(10.7g，84％)：熔点：146-148℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ3.75(s，3H)，4.16(s，2H)，4.85(m，2H)，5.26(m，1H)，6.67(d，1H)，6.94(m，1H)，7.37(m，1H)，7.74(m，1H)。 

往圆底烧瓶中加入(3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基)乙酸甲酯(2.6g，10mmol)，碳酸钾(3g)，4-溴-2-氟苄基溴(2.9g，11mmol)和乙腈(30mL)，70℃下反应2h，旋蒸除去溶剂后过滤，用水反复洗涤，干燥。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到白色晶体[2-(4-溴-2-氟苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸甲酯(3.5g，79％)：熔点：128-131℃；¹HNMR(400MHz，CDCl₃)：δ3.75(s，3H)，4.01(s，2H)，4.36(s，2H)，4.86(s，2H)，6.55(d，1H)，6.92(m，1H)，7.27(m，2H)，7.40(m，2H)，7.75(m，1H)。 

将[2-(4-溴-2-氟苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸甲酯(0.44g，1mmol)溶于1，4-二氧六环(5mL)中，搅拌20min后加入氢氧化钠水溶液，室温下反应2h，加入10％HCl，调pH值至2-3，用氯仿萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸，得到的粗产物用甲醇重结晶，得到[2-(4-溴-2-氟苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸，产率79％，熔点：200-203℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.21(s，2H)，4.27(s，2H)，4.89(s，2H)，6.76(d，1H)，6.87(m，1H)，7.44(m，3H)，7.59(m，2H)，12.96(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₄BrFN₂O₄S)：理论值C：44.77％，H：3.29％，N：6.53％；实际值C：44.70％，H：3.34％，N：6.53％。 

实施例2[2-(3-硝基苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物2)

用3-硝基苄基溴替代实施例1中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：166-169℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.20(s，2H)，4.42(s，2H)，4.95(s，2H)，6.76(d，1H)，6.89(m，1H)，7.46(m，1H)，7.65(m，2H)，8.17(m，1H)，8.20(m，2H)，12.98(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₅N₃O₆S)：理论值C：50.92％，H：4.01％，N：11.13％；实际值C：51.00％，H：4.05％，N：11.12％。 

实施例3[2-(4-三氟甲基苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物3)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例1中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：152-155℃；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ3.98(s，2H)，4.39(s，2H)，4.79(s，2H)，6.58(d，1H)，6.96(m，1H)，7.43(m，1H)，7.51(d，2H)，7.62(d，2H)，7.78(m，1H)；元素分析(C₁₇H₁₅F₃N₂O₄S)：理论值C：51.00％，H：3.78％，N：7.00％；实际值C：50.64％，H：3.88％，N：6.93％。 

实施例4[2-(2，4，5-三氟苄基)-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物4)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例1中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：172-174℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.21(s，2H)，4.25(s，2H)，4.90(s，2H)，6.75(d，J＝8.4Hz，1H)，6.88(m，1H)，7.45(m，1H)，7.50(m，1H)，7.56(m，1H)，7.62(m，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃F₃N₂O₄S)：理论值C：49.74％，H：3.39％，N：7.25％；实际值C：49.74％，H：3.50％，N：7.28％。 

实施例5(2-苄基-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基)乙酸(化合物5)

用苄基溴替代实施例1中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：80-82℃；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ3.83(s，2H)，4.18(s，2H)，4.62(s，2H)，6.47(d，1H)，6.80(m，1H)，7.23(m，5H)，7.64(d，1H)，8.69(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₆N₂O₄S)：理论值C：57.82％，H：4.85％，N：8.43％；实际值C：57.30％，H：4.95％，N：8.34％。 

实施例6[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-氟-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物6)

-40℃下，往三口瓶中加入26mL(300mmol)氯磺酸异氰酸酯和200mL硝基甲烷，机械搅拌下滴加对氟苯胺(270mmol)的硝基甲烷溶液。滴加完毕继续搅拌0.5小时后，加入39g(300mmol)无水三氯化铝，然后在110℃下加热搅拌1小时。待恢复到室温后，将反应液倒入冰水中，生成的沉淀过滤，反复水洗，再用乙醚冲洗，干燥，得到红棕色的中间产物。将此中间产物加入到320mL 50％硫酸水溶液中，在135℃下反应8小时，温度降至室温，将反应液倒入冰水中，生成的沉淀过滤，反复水洗，干燥，得到25.9g 2-氨基-5-氟苯磺酰胺，产率51％，熔点：149-152℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ5.71(s，2H)，6.80(m，1H)，7.14(m，1H)，7.28(m，1H)，7.35(s，2H)。 

用2-氨基-5-氟苯磺酰胺替代实施例1中的2-氨基苯磺酰胺，其余的均按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：167-169℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.24(s，2H)，4.28(s，2H)，4.88(s，2H)，6.83(m，1H)，7.40(m，2H)，7.45(d，1H)，7.52(m，1H)，7.53(m，1H)，7.60(m，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃BrF₂N₂O₄S)：理论值C：42.97％，H：2.93％，N：6.26％；实际值C：42.47％，H：2.95％，N：5.99％。 

实施例7[2-(3-硝基苄基)7-氟-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物7)

用3-硝基-苄基溴替代实施例6中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例6所述制备方法制得。 

熔点：178-180℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.21(s，2H)，4.43(s，2H)，4.94(s，2H)，6.83(m，1H)，7.39(m，1H)，7.54(m，1H)，7.68(m，1H)，7.82(d，1H)，8.18(d，1H)，8.21(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₄FN₃O₆S)：理论值C：48.61％，H：3.57％，N：10.63％；实际值C：48.40％，H：3.59％，N：10.58％。 

实施例8[2-(4-三氟甲基苄基)-7-氟-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物8)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例6中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例6所述制备方法制得。 

熔点：191-193℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.22(s，2H)，4.37(s，2H)，4.90(s，2H)，6.83(m，1H)，7.40(m，1H)，7.53(m，1H)，7.58(d，2H)，7.75(d，2H)；元素分析(C₁₇H₁₄F₄N₂O₄5)：理论值C：48.80％，H：3.37％，N：6.70％；实际值C：48.72％，H：3.44％，N：6.50％。 

实施例9[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-氟-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物9)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例6中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例6所述制备方法制得。 

熔点：146-149℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.24(s，2H)，4.27(s，2H)，4.89(s，2H)，6.84(m，1H)，7.40(m，1H)，7.52(m，2H)，7.60(m，1H)；元素分析(C₁₆H₁₂F₄N₂O₄S)：理论值C：47.53％，H：2.99％，N：6.93％；实际值C：47.44％，H：3.02％，N：6.90％。 

实施例10[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物10)

用对氯苯胺替代实施例6中的对氟苯胺，按照实施例6所述制备方法制得。 

熔点：179-181℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.25(s，2H)，4.27(s，2H)，4.90(s，2H)，6.85(m，1H)，7.40(m，1H)，7.45(d，1H)，7.52(m，1H)，7.58(m，1H)，7.65(d，1H)，7.69(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃BrClFN₂O₄S)：理论值C：41.44％，H：2.83％，N：6.04％；实际值C：41.24％，H：2.90％，N：5.97％。 

实施例11[2-(3-硝基苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物11)

用3-硝基-苄基溴替代实施例10中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例10所述制备方法制得。 

熔点：201-204℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.15(s，2H)，4.42(s，2H)，4.96(s，2H)，6.80(d，1H)，7.48(m，1H)，7.64(m，1H)，7.61(d，1H)，7.82(d， 1H)，8.17(d，1H)，8.21(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₄ClN₃O₆S)：理论值C：46.66％，H：3.43％，N：10.20％；实际值C：46.78％，H：3.62％，N：10.30％。 

实施例12[2-(4-三氟甲基苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物12)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例10中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例10所述制备方法制得。 

熔点：197-199℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.21(s，2H)，4.37(s，2H)，4.93(s，2H)，6.83(d，1H)，7.52(m，1H)，7.58(d，2H)，7.65(d，1H)，7.74(d，2H)；元素分析(C₁₇H₁₄ClF₃N₂O₄S)：理论值C：46.96％，H：3.25％，N：6.44％；实际值C：46.97％，H：3.29％，N：6.34％。 

实施例13[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物13)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例10中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例10所述制备方法制得。 

熔点：140-142℃；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ4.23(s，2H)，4.25(s，2H)，4.90(s，2H)，6.83(d，1H)，7.49(m，1H)，7.51(m，1H)，7.55(m，1H)，7.63(d，1H)，13.0(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₂ClF₃N₂O₄S)：理论值C：45.67％，H：2.87％，N：6.66％；实际值C：45.29％，H：3.01％，N：6.63％。 

实施例14[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物14)

用对溴苯胺替代实施例6中的对氟苯胺，按照实施例6所述制备方法制得。 

熔点：176-179℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.19(s，2H)，4.28(s，2H)，4.89(s，2H)，6.76(d，1H)，7.48(m，1H)，7.64(m，1H)，7.61(d，1H)，7.82(d，1H)，8.17(d，1H)，7.21(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃Br₂FN₂O₄S)：理论值C：37.82％，H：2.58％，N：5.51％；实际值C：37.96％，H：2.77％，N：5.53％。 

实施例15[2-(3-硝基苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物15)

用3-硝基-苄基溴替代实施例14中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例14所述制备方法制得。 

熔点：212-215℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.22(s，2H)，4.42(s，2H)，4.96(s，2H)，6.77(d，1H)，7.41(m，1H)，7.44(m，1H)，7.59(m，2H)，7.72(d，1H)；元素分析(C₁₆H₁₄BrN₃O₆S)：理论值C：42.12％，H：3.09％，N：9.21％；实际值C：42.26％，H：3.23％，N：9.10％。 

实施例16[2-(4-三氟甲基苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物16)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例14中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例14所述制备方法制得。 

熔点：192-193℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.16(s，2H)，4.37(s，2H)，4.91(s，2H)，6.76(d，1H)，7.58(s，1H)，7.61(m，2H)，7.73(s，2H)，7.75(s，1H)；元素分析(C₁₇H₁₄BrF₃N₂O₄S)：理论值C：42.60％，H：2.94％，N：5.85％；实际值C：42.03％，H：3.01％，N：5.72％。 

实施例17[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-苯并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物17)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例14中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例14所述制备方法制得。 

熔点：197-201℃；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ4.25(s，2H)，4.26(s，2H)，4.91(s，2H)，6.78(d，1H)，7.52(m，1H)，7.60(m，2H)，7.74(m，1H)；元素分析(C₁₆H₁₂BrF₃N₂O₄S)：理论值C：41.31％，H：2.60％，N：6.02％；实际值C：41.22％，H：2.73％，N：5.95％。 

实施例18[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物18)

-40℃下，往单口圆底烧瓶中加入50mL氯磺酸，剧烈搅拌的同时缓慢加入12.8g 2-氨基-5-氯吡啶(0.1mol)。恢复到室温，回流反应3小时。冷却后，将反应液倒入冰水中，生成的沉淀过滤，反复水洗，干燥，得到淡黄色的中间产物。将此中间产物加入到100mL THF中，搅拌30min后持续通入氨气1h，然后在室温下搅拌过夜。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体用水冲洗，过滤，干燥，得到2-氨基-5-氯吡啶磺酰胺。产率55％，熔点：213-216℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ6.67(s，2H)，7.57(s，2H)，7.82(d，J＝2.8Hz，1H)，8.18(d，J＝2.4Hz，1H)。 

用2-氨基-5-氯吡啶磺酰胺替代实施例1中的2-氨基苯磺酰胺，其余的均按照实施例1所述制备方法制得。 

熔点：190-192℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.30(s，2H)，4.31(s，2H)，4.98(s，2H)，7.40(m，1H)，7.45(m，1H)，7.56(m，1H)，8.21(d，J＝2.4Hz，1H)，8.44(d，J＝2.4Hz，1H)，12.85(s，1H)；元素分析(C₁₅H₁₂BrClFN₃O₄S)：理论值C：38.77％，H：2.60％，N：9.04％；实际值C：38.76％，H：2.67％，N：9.11％。 

实施例19[2-(3-硝基苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物19)

用3-硝基-苄基溴替代实施例18中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例18 所述制备方法制得。 

熔点：171-172℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.23(s，2H)，4.47(s，2H)，5.03(s，2H)，7.66(m，1H)，7.82(d，J＝7.6Hz，1H)，8.15(m，1H)，8.19(s，1H)，8.20(s，1H)，8.41(d，J＝2.4Hz，1H)，12.85(s，1H)。 

实施例20[2-(4-三氟甲基苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物20)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例18中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例18所述制备方法制得。 

熔点：169-171℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.29(s，2H)，4.40(s，2H)，5.00(s，2H)，7.57(d，J＝8.0Hz，2H)，7.74(d，J＝8.4Hz，2H)，8.22(d，J＝2.4Hz，1H)，8.44(d，J＝2.8Hz，1H)，12.84(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃ClF₃N₃O₄S)：理论值C：44.10％，H：3.01％，N：9.64％；实际值C：44.16％，H：3.13％，N：9.70％。 

实施例21[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物21)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例18中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例18所述制备方法制得。 

熔点：157-159℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.30(s，4H)，4.99(s， 2H)，7.53(m，1H)，7.59(m，1H)，8.22(d，J＝2.4Hz，1H)，8.44(d，J＝2.4Hz，1H)，12.86(s，1H)；元素分析(C₁₅H₁₁ClF₃N₃O₄S)：理论值C：42.71％，H：2.63％，N：9.96％；实际值C：42.89％，H：2.77％，N：9.94％。 

实施例22[2-(4-甲氧基苄基)-7-氯-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物22)

用4-甲氧基苄基溴替代实施例18中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例18所述制备方法制得。 

熔点：141-143℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ3.74(s，3H)，4.18(s，2H)，4.25(s，2H)，4.88(s，2H)，6.91(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26(d，J＝8.8Hz，2H)，8.19(d，J＝2.4Hz，1H)，8.42(d，J＝2.4Hz，1H)，12.80(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₆ClN₃O₅S)：理论值C：48.30％，H：4.05％，N：10.56％；实际值C：48.54％，H：4.14％，N：10.61％。 

实施例23[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物23)

用2-氨基-5-溴吡啶替代实施例18中的2-氨基-5-氯吡啶，按照实施例18所述制备方法制得。 

熔点：182-183℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.29(s，2H)，4.31(s，2H)，4.98(s，2H)，7.40(m，1H)，7.45(m，1H)，7.56(m，1H)，8.27(d，J＝2.4Hz， 1H)，8.50(d，J＝2.4Hz，1H)，12.85(s，1H)；元素分析(C₁₅H₁₂Br₂FN₃O₄S)：理论值C：35.38％，H：2.38％，N：8.25％；实际值C：35.40％，H：2.64％，N：8.29％。 

实施例24[2-(3-硝基苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物24)

用3-硝基-苄基溴替代实施例23中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例23所述制备方法制得。 

熔点：193-195℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.28(s，2H)，4.46(s，2H)，5.05(s，2H)，7.67(m，1H)，7.81(d，J＝7.6Hz，1H)，8.17(d，J＝8.0Hz，1H)，8.20(s，1H)，8.28(d，J＝2.8Hz，1H)，8.48(d，J＝2.4Hz，1H)，12.87(s，1H)；元素分析(C₁₅H₁₃BrN₄O₆S)：理论值C：39.40％，H：2.87％，N：12.25％；实际值C：39.41％，H：2.91％，N：12.33％。 

实施例25[2-(4-三氟甲基苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物25)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例23中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例23所述制备方法制得。 

熔点：177-179℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.29(s，2H)，4.40(s，2H)，5.00(s，2H)，7.57(d，J＝8.0Hz，2H)，7.73(d，J＝8.4Hz，2H)，8.27(d，J＝ 2.4Hz，1H)，8.50(d，J＝2.0Hz，1H)，12.85(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₃BrF₃N₃O₄S)：理论值C：40.01％，H：2.73％，N：8.75％；实际值C：40.17％，H：2.81％，N：8.81％。 

实施例26[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物26)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例23中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例23所述制备方法制得。 

熔点：159-162℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ4.30(s，2H)，4.31(s，2H)，4.99(s，2H)，7.53(m，1H)，7.59(m，1H)，8.27(d，J＝2.4Hz，1H)，8.50(d，J＝2.0Hz，1H)，12.88(s，1H)；元素分析(C₁₅H₁₁BrF₃N₃O₄S)：理论值C：38.64％，H：2.38％，N：9.01％；实际值C：38.75％，H：2.48％，N：9.10％。 

实施例27[2-(4-甲氧基苄基)-7-溴-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物27)

用4-甲氧基苄基溴替代实施例23中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例23所述制备方法制得。 

熔点：144-146℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ3.74(s，3H)，4.18(s，2H)，4.24(s，2H)，4.88(s，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.26(d，J＝8.4Hz，2H)，8.24(d，J＝2.4Hz，1H)，8.47(d，J＝2.4Hz，1H)，12.87(s，1H)；元素分析 (C₁₆H₁₆BrN₃O₅S)：理论值C：43.45％，H：3.65％，N：9.50％；实际值C：43.70％，H：3.72％，N：9.54％。 

实施例28[2-(4-溴-2-氟苄基)-7-甲基-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物28)

用2-氨基-5-甲基吡啶替代实施例18中的2-氨基-5-氯吡啶，按照实施例18所述制备方法制得。 

熔点：112-115℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ2.23(s，3H)，4.27(s，4H)，4.93(s，2H)，7.40(m，1H)，7.45(m，1H)，7.55(m，1H)，7.90(m，1H)，8.23(m，1H)，12.73(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₅BrFN₃O₄S)：理论值C：43.25％，H：3.40％，N：9.46％；实际值C：43.16％，H：3.47％，N：9.39％。 

实施例29[2-(3-硝基苄基)-7-甲基-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物29)

用3-硝基-苄基溴替代实施例28中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例28所述制备方法制得。 

熔点：152-155℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ2.23(s，3H)，4.26(s，2H)，4.43(s，2H)，4.99(s，2H)，7.66(m，1H)，7.81(d，J＝7.6Hz，1H)，7.90(d，J＝2.0Hz，，1H)，8.15(m，1H)，8.20(s，1H)，8.22(d，J＝1.6Hz，1H)，12.75(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₆N₄O₆S)：理论值C：48.97％，H：4.11％，N：14.28％；实际 值C：49.03％，H：4.16％，N：14.38％。 

实施例230[2-(4-三氟甲基苄基)-7-甲基-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物230)

用4-三氟甲基苄基溴替代实施例28中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例28所述制备方法制得。 

熔点：181-184℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：2.21(s，3H)，4.07(s，2H)，4.42(s，2H)，4.89(s，2H)，7.60(d，J＝8.0Hz，2H)，7.70(d，J＝8.0Hz，2H)，7.83(d，J＝2.0Hz，1H)，8.17(d，J＝2.0Hz，1H)。 

实施例31[2-(2，4，5-三氟苄基)-7-甲基-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物31)

用2，4，5-三氟苄基溴替代实施例28中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例28所述制备方法制得。 

熔点：162-164℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：2.23(s，3H)，4.27(s，2H)，4.29(s，2H)，4.95(s，2H)，7.51(m，1H)，7.58(m，1H)，7.892(d，J＝2.0Hz，1H)，8.23(d，J＝2.0Hz，1H)，12.74(s，1H)；元素分析(C₁₆H₁₄F₃N₃O₄S)：理论值C：47.88％，H：3.52％，N：10.47％；实际值C：47.87％，H：3.62％，N：10.53％。 

实施例32[2-(4-甲氧基苄基)-7-甲基-3，4-二氢-2H-1，2，4-吡啶并噻二嗪1，1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物32)

用4-甲氧基苄基溴替代实施例28中的4-溴-2-氟苄基溴，按照实施例28所述制备方法制得。 

熔点：188-191℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：2.23(s，3H)，3.74(s，3H)，4.15(s，2H)，4.22(s，2H)，4.82(s，2H)，6.92(d，J＝8.4Hz，2H)，7.26(d，J＝8.8Hz，2H)，7.88(d，J＝2.0Hz，1H)，8.21(d，J＝2.0Hz，1H)，12.71(s，1H)；元素分析(C₁₇H₁₉N₃O₅S)：理论值C：54.10％，H：5.07％，N：11.13％；实际值C：54.02％，H：5.11％，N：11.17％。 

实施例33部分化合物对ALR2和ALR1体外抑制作用实验

实施例中用到了ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液、ALR1测定用的磷酸钠缓冲液1、磷酸钠缓冲液2、NADPH溶液以及D，L-甘油醛溶液、D-葡萄糖醛酸钠溶液，它们的配制方法如下： 

(1)配制0.1M，pH＝6.2的ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液 

溶液A：3.12g NaH₂PO₄·2H₂O溶于100ml水配成0.2M的溶液； 

溶液B：3.58g Na₂HPO₄·12H₂O溶于50ml水配成0.2M的溶液。 

取A81.5ml，B18.5ml，用水稀释至终体积为200ml，调节pH至6.2，即得。 

(2)配制10mM，pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液1 

0.3801g磷酸钠，8.5513g蔗糖，0.0809g EDTA二钾盐，0.0175mL β-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。 

(3)配制10mM，pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液2 

0.3801g磷酸钠，0.0809g EDTA二钾盐，0.0140mL β-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。 

(4)配制0.104mM NADPH溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 

0.0043g NADPH溶于50ml缓冲溶液配制成。 

(5)配制10mM D，L-甘油醛溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 

0.045g D，L-甘油醛溶于50ml缓冲溶液配制成。 

(6)配制20mM D-葡萄糖醛酸钠溶液(以缓冲溶液作为溶剂) 

0.2341g D-葡萄糖醛酸钠溶于50ml缓冲溶液1中配制成。 

(7)处理透析袋： 

把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，剪三段。在大体积的2％(W/V)NaHCO₃和1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min。再用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中，将之煮沸10min。冷却后，存放在4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内，从此时取用透析袋时必须带手套。用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。 

(8)ALR2的提取：从正常杀死的老鼠眼球中迅速提出晶状体，然后加入3倍(0.4ml/lens)于其体积的冷去离子水(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000xg转速，0-4℃的温度，离心30min。最后取上清液，即为ALR2的水溶液，用于酶活测试。 

(9)ALR1的提取：将大鼠断颈处死，迅速取出肾脏，然后加入3倍(3ml/g肾脏)于其体积冷却的10mM磷酸钠缓冲液1(pH＝7.2，内含0.25M蔗糖，2.0mM EDTA二钾盐，2.5mM β-巯基乙醇)(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000xg转速，0-4℃的温度，离心30min。取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，形成饱和度为40％的硫酸铵溶液，0-4℃下搅拌30min，12000xg转速低温离心15min。取上清液重复上述步骤，分别使硫酸铵的饱和度达到55％，然后是75％的盐溶液。75％饱和度的硫酸铵溶液离心后的沉淀用 50体积10mM磷酸钠缓冲液2(pH＝7.2，内含2.0mM EDTA二钾盐，2.0mM β-巯基乙醇)溶解，并用此缓冲液透析过夜。透析后的即为ALR1的水溶液，用于酶活测试。 

(10)在30℃的温度下，在1ml测试比色皿中分别加入0.25mL 0.104mMNADPH，0.25mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2)，0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。参照比色皿中加入0.25mL 0.104mM NADPH，0.50mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2)，0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。然后把含有上述混合液的两个比色皿放在30℃条件下，保温10min。最后向测试比色皿中加入0.25mL 10mM底物开始反应，用紫外分光光度计在340nm监测5min。从所得数据，以吸光度为纵轴，时间为横州，可得一直线，求得此直线的斜率，记为I₀，代表酶活。酶的活性最佳值是处于NADPH吸光度变化在0.01±0.0010(ALR2)或0.015±0.0010(ALR1)吸光度单位/min的范围内，如果不在此范围，通过稀释酶液来使其达到这一范围。对测试比色皿要加对照比色皿是为了校正由于非酶因素(比如空气中氧气也会氧化NADPH)所导致的NADPH的氧化。 

(11)化合物抑制百分数的测试同测酶活的方法相似，只是在未加底物时，要在测试比色皿和参照比色皿中各加入5μL的被测化合物溶液。所得直线的斜率记为I_x。然后根据下面的公式计算可得该浓度下的抑制百分数。 

I％＝(|I₀-I_x|/|I₀|)×100％ 

重复测量不同浓度的化合物溶液，分别计算出相应浓度的抑制百分数，可得到“抑制百分数”对“浓度对数”的直线，然后从图中读出抑制百分数为50％对应的浓度对数，反对数即可得IC₅₀。 

部分化合物在体外抑制ALR2和ALR1活性的能力如表1所示。 

表1部分化合物体外对ALR2和ALR1的抑制活性 

^aIC₅₀(μM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值 

^b在浓度10^-4M下的抑制率 

^c在本发明中没有测试 

实验证实，部分化合物在体外对醛糖ALR2有明显的抑制作用，IC₅₀基本上都在纳摩尔级以下，尤其是化合物12和20，IC₅₀分别为32nM和38nM，且这些化合物对ALR1没有明显的抑制作用，说明这些化合物具有高选择性。 

实施例33部分化合物抑制STZ-糖尿病模型大鼠体内山梨醇蓄积实验

1.溶液的配制 

(1).配制0.1M，pH＝4.5的柠檬酸钠缓冲液 

1.9213g柠檬酸，溶于100mL水中，调节pH至4.5即得。 

(2)配制0.5％阿拉伯胶溶液 

2.5g阿拉伯树胶粉溶于500mL水中，搅拌完全溶解即得。 

(3)配制0.1mg/mL的山梨醇标准液 

0.001g山梨醇溶于100ml水中配制成，可长期贮存备用。

(4)配制0.1M，pH＝9.4的甘氨酸-NaOH缓冲液 

0.7507g甘氨酸，溶于100mL水中，调节pH至9.4即得。 

(5)配制1.2mM氧化型辅酶I(NAD⁺)贮液 

0.0430g NAD⁺，溶于50mL水中即得。 

(6)配制32U/mL山梨醇脱氢酶(SoDH)工作母液 

50USoDH溶于1.5625mL水中即得。 

(7)其它：6％高氯酸100mL、3M碳酸钾20mL。 

2.建立STZ-糖尿病模型 

130只雄性Wistar大鼠(来源：北京大学医学部实验动物中心，体重范围250～300g，周龄13week)，注射前大鼠禁食12h，将链脲佐菌素(STZ)溶于柠檬酸缓冲液中配成10mg/mL的注射液，经0.22μm滤膜过滤，15min内按55mg/kg剂量腹腔注射给124只大鼠。其余6只作为空白组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。4d后用血糖仪以剪尾法测定注射STZ大鼠的血糖值，其血糖值≥16.0mmol/L即为造模成功。 

3.分组与给药 

取造模成功的个体，按其血糖值以部分随机分组法分为模型组(无药物治疗，仅给予溶媒)、所合成化合物治疗组(100mg/kg体重)和非达司他治疗组(100mg/kg体重)，每日固定时间灌胃一次，共给药5天。两种受试药物均配成0.5％阿拉伯胶悬浮剂。 

4.坐骨神经中山梨醇含量测定 

(1)组织分离及匀浆 

(a)取坐骨神经第五天给药3h后剪尾测血糖，给药6h后，将大鼠拉断颈椎处死，取出坐骨神经放入生理盐水中，剥离附着肌肉和结缔组织。 

(b)冷藏坐骨神经置于事先编号的离心管中，-70℃冷藏。 

(c)坐骨神经处理精确称重后加入2mL重蒸水煮2min。煮后取出，用2mL6％高氯酸匀浆。组织液1050g离心15min后取上清，并以3M碳酸钾溶液调至pH为8-9，以荧光分光光度计测定其中山梨醇含量。 

(2)山梨醇含量测定 

(a)山梨醇标准曲线的测定 

取离心管8个，编号后1号离心管加入3mL山梨醇标准液贮液，2号离心管加入1.5mL山梨醇标准液贮液和1.5mL重蒸馏水，2号管混匀后取出1.5mL加入3号管。依次倍量稀释至7号管，然后按表2中标准管栏配制方法加入除标准液以外的其它各溶液，注意不加样品液。混合均匀后，在37℃水浴下加热45min后，进行荧光测定。 

在设定激发波长338nm条件下，反应产物NADH发射的荧光在波长460nm处的强度与其浓度呈正比，由此即可得到测定试样中山梨醇含量。在测定样品中山梨醇含量之前，需得到荧光强度与NADH浓度(即山梨醇浓度)的确切线性拟合公式，即标准曲线。荧光计工作曲线模式下将8支标准管中样品进行测定，对所测结果进行线性拟合，即可得到所需公式。 

在以空白管设定好测量零点后，测得标准品荧光强度。据此，以荧光强度为Y轴，标准品山梨醇浓度为X轴，即如附图所示。 

(c)样品山梨醇含量的测定 

如表2中样品管栏所示。37℃温孵45min后，用荧光分光光度计的定量模式测定样品中山梨醇含量，定量测定在激发波长366nm条件下，由反应产物NADH发射的荧光在波长452nm处的强度。 

经回归计算附图，所得拟合直线方程为： 

Y＝kX(k为已知) 

其中，Y为荧光强度，X为反应液中山梨醇含量。 

表2坐骨神经中山梨醇测定步骤(单位mL) 

部分化合物对STZ-糖尿病模型大鼠治疗效果如表3所示。化合物对大鼠体内山梨醇蓄积的抑制作用的评价方式为： 

抑制率％＝(S-T)/(S-N)×100％ 

其中，S、T、N分别是模型组、治疗组和空白组大鼠单位质量坐骨神经所含山梨醇质量。 

表3.部分化合物对STZ-糖尿病模型大鼠治疗效果分析 

与模型组对比^*p＜0.05，^**p＜0.01 

实验证实，部分化合物在体内对山梨醇和血糖都有明显的降低作用，尤其是化合物8对山梨醇的抑制百分率更是高达68％。说明本发明的苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物是高效的、高选择性、低毒的醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症的药物的用途。 

在本发明提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.式I所示化合物结构、合成、其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，

其中，X为C、N；

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基；

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基，酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇的杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基；

R₃为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基、酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇的杂环或杂环烷基、取代或未取代的芳基、芳烷基，其中所述的取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物具有式II所示的结构

式中，其中，X为C、N；

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基；

R₂为H、C₁--C₄烷基氰基、酯基、羧基、酰胺、含有一个至四个氧或氮的C₄--C₇杂环或杂环烷基；

R₃-R₆为H、卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物具有式III所示的结构

式中，其中，X为C、N；

R₁为H、卤素、硝基、C₁--C₄的直链或支链的烃基、C₁--C₄卤代烷基；

R₂为H、C₁--C₄烷氧基、羟基、氨基；

R₃-R₆为H、卤素、羟基、氨基、硝基、C₁--C₄烷氧基、C₁--C₄卤代烷基。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物为下述化合物之一：

5.一种具有式I结构的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(i)以式Ia为原料，用氯磺酸异氰酸酯(X＝C时)或氯磺酸(X＝C时)作为磺化剂，经过2-3步操作形成式Ib化合物：

或

(ii)以式Ib为原料，在原甲酸三乙酯存在下，回流反应，从而形成式Ic化合物：

(iii)以式Ic为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在4位N上偶联上基团R₂，从而形成式Id化合物：

(iv)在二氧六环或异丙醇或无水乙醇中，用硼氢化钠对式Id进行加氢还原，从而形成式Ie化合物：

(v)以式Ie为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-N键的生成在2位N上偶联上基团R₃，从而形成式If化合物：

(vi)以式If为原料，形成所需的衍生物，包括酯，酸，酰胺，含氮和/或氧的杂环化合物。

其中，R₁--R₃的定义如权利要求1中所述。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，以式Ie和取代的或未取代的苄基溴为原料，在惰性条件和碱存在下，通过C-N偶联形成式II化合物：

其中，R₁-R₆的定义如权利要求2中所述。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当式II中的R₂

为酯基，羧基，酰胺基时，所述方法包括步骤：

(i)以式Ic和溴乙酸甲酯为原料，在乙腈和碳酸钾存在下，形成式IIId化合物：

(ii)在二氧六环或异丙醇或无水乙醇中，用硼氢化钠对式IIId进行加氢还原，从而形成式IIIe化合物：

(iii)以式IIIe和取代的或未取代的苄基溴为原料，在惰性条件和碱存在下，通过C-N偶联形成式IHf化合物：

(iv)对式IIIf进行水解，形成式IIIh化合物：

(v)对式IIIf进行氨化，形成式IIIi化合物：

其中，R₁-R₆的定义如权利要求3中所述。

8.如权利要求1-4中任一条所述的用途，其特征在于：所述化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为的醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症药物上的应用。

9.一种用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：治疗有有效量的权利要求1-4中任一项所述的化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、悬浮剂或气雾剂，其所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％。

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