CN102600078A - 一种恩诺沙星脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种恩诺沙星脂质体的制备方法，1)取2.5重量份恩诺沙星加入缓冲液制成水相；取大豆卵磷脂3～5重量份、胆固醇1重量份、0.4重量份吐温-80，采用氯仿混合溶解充分得到油相；2)将油相减压蒸馏除溶剂得到空白磷脂膜，对空白磷脂膜采用硫酸铵溶液冲洗、水化得到空白脂质体；3)将空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水于37℃恒温透析5-7小时，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中加热至45-55℃，孵化15-25分钟，离心处理将沉淀物冻干得到恩诺沙星脂质体。本发明通过将恩诺沙星制成脂质体的形式，不仅提高生物利用度，延长半衰期，脂质体形式安全可靠、无毒副作用、生理生化性质稳定等优点，可以在临床上广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种恩诺沙星脂质体的制备方法，属于制药技术领域。
背景技术
恩诺沙星化学名称为1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，具有广谱、高效、低残留、低毒、药代动力学特征好、作用机制独特、半衰期长、组织分布广等优点。在临床应用范围比较广泛，包括鸡支原体、禽大肠杆菌、鸡白痢、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜血杆菌、金黄葡萄球菌等，在临床上常见到是混合感染，应用恩诺沙星可以一举多效；猪大肠杆菌、霉形体性、多杀性巴氏杆菌、猪丹毒、布氏杆菌、链球菌、乳腺炎、子宫炎等临床上应用治疗效果明显；针对于牛、羊的大肠杆菌、霉形体肺炎、炭疽、李氏杆菌、乳房炎、子宫炎等应用注射液肌注可以完全治愈；犬、兔消化道、呼吸道、泌尿系统、生殖器官感染、外耳炎、心内膜炎、绿脓杆菌、骨髓炎等用恩诺沙星可以治疗。
恩诺沙星在动物机体内可以代谢成环丙沙星，同样是一种药效性较好的抗菌素，因此通过这种方法将恩诺沙星制成脂质体，脂质体是一种靶向药物载体，可以将药物包封在直径为亚微米或纳米的脂质体从而延长有效作用时间，提高生物利用度，减少临床用药次数，提高治愈率，增创经济效益。目前的恩诺沙星脂质体的包封率和治愈率还有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种恩诺沙星脂质体的制备方法，以延长药物的有效作用和半衰期、提高生物利用度。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种恩诺沙星脂质体的制备方法，其步骤如下：
1)取2.5重量份恩诺沙星加入到pH为6.8-7.2的缓冲液中充分溶解，制成浓度为2.5mg/mL的水相，备用；取大豆卵磷脂3～5重量份、胆固醇1重量份、0.3-0.5重量份吐温-80，采用氯仿混合溶解充分得到油相，备用；
2)将油相减压蒸馏除溶剂得到空白磷脂膜，对空白磷脂膜采用硫酸铵溶液冲洗、水化得到空白脂质体，经过滤膜过滤处理，备用；
3)将步骤2)得到的空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水于37℃恒温透析5-7小时，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中加热至45-55℃，孵化15-25分钟，得到恩诺沙星脂质体粗品；
4)将步骤3)得到的粗品进行离心处理，将离心后的沉淀物冻干得到恩诺沙星脂质体。
步骤1)所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
步骤1)氯仿混合溶解采用超声波细胞破碎仪辅助处理。
步骤2)所述硫酸铵溶液的浓度为300mmol/L。
步骤2)所述的滤膜为0.45微米滤膜。
步骤3)所述透析袋的截留分子量为600Da。
步骤4)离心处理条件为：4℃、15000转/分钟离心40分钟。
所述步骤4)采用如下方法替代：将步骤3)得到的粗品进行离心处理，向离心后的沉淀物中加入PBS缓冲溶液得到溶液型恩诺沙星脂质体，其中恩诺沙星脂质体的浓度为2.0mg/mL。
本发明恩诺沙星脂质体的制备方法简单可行，所需设施简单，原料易取，在实际生产中容易实施。恩诺沙星作用在临床得到广泛的认可，抗菌谱广、组织分布广、针对于细菌性疾病效果良好，本发明通过将恩诺沙星制成脂质体的形式，不仅提高生物利用度，延长半衰期，脂质体形式安全可靠、无毒副作用、生理生化性质稳定等优点，可以在临床上广泛应用。本发明制备得到的溶液型恩诺沙星脂质体，经过无菌处理之后在4℃保存，而采用冻干处理的冻干型恩诺沙星脂质体可以在常温下保存。
具体实施方式
实施例1
本实施例的恩诺沙星脂质体的制备方法采用如下步骤：
1)水相的制备：取2.5g精制恩诺沙星原粉，加入到pH7.2的PBS缓冲液中充分溶解，制成浓度为2.5mg/mL的水相，备用；油相的制备：取大豆卵磷脂3g、胆固醇1g、0.3g吐温-80、氯仿适量混合溶解，经过常温超声波细胞破碎仪短时间作用，作用时间3s，间隔时间3s，使其充分溶解，得到油相；
2)将油相经过水温60℃旋转减压蒸发作用15min制得空白磷脂膜，然后向空白磷脂膜加入300mmol/L硫酸铵溶液充分冲洗，水化得到空白脂质体，经0.45微米滤膜过滤处理，备用；
3)将上述步骤中的空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水(0.85％)于37℃恒温透析5h，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中，加热至45℃孵化15min，即制成恩诺沙星脂质体粗品；
4)将粗品经过4℃、15000r/min高速离心40min，留其沉淀加入PBS缓冲液制得溶剂型恩诺沙星脂质体溶液，浓度为2.0mg/mL；
5)可以将4)步骤中的溶液型恩诺沙星脂质体进一步浓缩，经真空冻干，可以制得冻干型恩诺沙星脂质体，冻干制剂不仅保存时间长，而且便于运输；也可以将步骤4)的离心沉淀直接真空冻干得到冻干型恩诺沙星脂质体。
实施例2
本实施例的恩诺沙星脂质体的制备方法采用如下步骤：
1)水相的制备：取2.5g精制恩诺沙星原粉，加入到pH6.8的PBS缓冲液中充分溶解，制成浓度为2.5mg/mL的水相，备用；油相的制备：取大豆卵磷脂4g、胆固醇1g、0.4g吐温-80、氯仿适量混合溶解，经过常温超声波细胞破碎仪短时间作用，作用时间3s，间隔时间3s，使其充分溶解，得到油相；
2)将油相经过水温70℃旋转减压蒸发作用20min制得空白磷脂膜，然后向空白磷脂膜加入300mmol/L硫酸铵溶液充分冲洗，水化得到空白脂质体，经0.45微米滤膜过滤处理，备用；
3)将上述步骤中的空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水(0.85％)于37℃恒温透析6h，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中，加热至50℃孵化20min，即制成恩诺沙星脂质体粗品；
4)将粗品经过4℃、15000r/min高速离心40min，留其沉淀加入PBS缓冲液制得溶剂型恩诺沙星脂质体溶液，浓度为2.0mg/mL；
5)可以将4)步骤中的溶液型恩诺沙星脂质体进一步浓缩，经真空冻干，可以制得冻干型恩诺沙星脂质体，冻干制剂不仅保存时间长，而且便于运输。
实施例3
本实施例的恩诺沙星脂质体的制备方法采用如下步骤：
1)水相的制备：取2.5g精制恩诺沙星原粉，加入到pH7的PBS缓冲液中充分溶解，制成浓度为2.5mg/mL的水相，备用；油相的制备：取大豆卵磷脂5g、胆固醇1g、0.5g吐温-80、氯仿适量混合溶解，经过常温超声波细胞破碎仪短时间作用，作用时间3s，间隔时间3s，使其充分溶解，得到油相；
2)将油相经过水温80℃旋转减压蒸发作用25min制得空白磷脂膜，然后向空白磷脂膜加入300mmol/L硫酸铵溶液充分冲洗，水化得到空白脂质体，经0.45微米滤膜过滤处理，备用；
3)将上述步骤中的空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水(0.85％)于37℃恒温透析7h，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中，加热至55℃孵化25min，即制成恩诺沙星脂质体粗品；
4)将粗品经过4℃、15000r/min高速离心40min，留其沉淀加入PBS缓冲液制得溶剂型恩诺沙星脂质体溶液，浓度为2.0mg/mL；
5)可以将4)步骤中的溶液型恩诺沙星脂质体进一步浓缩，经真空冻干，可以制得冻干型恩诺沙星脂质体，冻干制剂不仅保存时间长，而且便于运输。
实验例
包封率检测：将恩诺沙星脂质体溶液(步骤3)中的粗品)取1ml于离心管中，经过4℃低温15000r/min离心50min处理之后，取0.5ml上清液，进行高效液相测定，作为游离的恩诺沙星C游；另0.5ml沉淀作为总的恩诺沙星C总，然后包封率＝(C总-C游)/C总×100％。
动物试验1：100只5周龄的健康鸡进行随机分成对照、试验、空白、市售药组4组，25只/组，4组试验鸡在新的饲养环境中适应两天后，对照、试验组、市药组中每只鸡人工皮下接种致病性细菌2ml(大肠杆菌)感染鸡只，空白接种生理盐水，自由饮水和采食。
表现出临床症状时，精神沉郁，食欲减退，下痢等症状时，应用精制恩诺沙星脂质体进行治疗，注射用量1ml/Kg直至全愈，同时试验组和市药组定点采血，测定药动学。
动物试验2：40头健康猪，体重10±0.5公斤，公母兼有，随机分成对照、试验、空白、市药组4组，10只/组，4组试验猪在新的饲养环境中适应两天后，对照、试验组、市药组每头猪人工接种致病性细菌5ml(大肠杆菌)感染猪，空白组接种生理下水，自由饮水和采食。
表现出临床症状时，用精制恩诺沙星脂质体溶液进行治疗，注射用量3ml/Kg直至全愈。同时试验组和市药组定点采血，测定药动学。
动物试验3：15只实验级小白鼠，随机分成对照组、试验组1、试验组2，在屏障系统中饲养，自由采食，对照组注射生理盐水3ml；试验组1注射精制恩诺沙星脂质体溶液3ml；试验组2口服精制恩诺沙星脂质体溶液5ml，饲养一周，观察并记录临床情况。
具体的试验结果见表1～表4所示：
表1实施例1～3恩诺沙星脂质体的包封率
| 实施例 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 包封率 | 92％ | 96％ | 93％ |
表2实施例1动物试验结果统计表
注：“正”表示没有临床异常情况；“同前”表示与空白相同。
表3实施例2动物试验结果统计表
注：“正”表示没有临床异常情况；“同前”表示与空白相同。
表4实施例3动物试验结果统计表
注：“正”表示没有临床异常情况；“同前”表示与空白相同。
Claims (9)
1.一种恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：其步骤如下：
1)取2.5重量份恩诺沙星加入到pH为6.8-7.2的缓冲液中充分溶解，制成浓度为2.5mg/mL的水相，备用；取大豆卵磷脂3～5重量份、胆固醇1重量份、0.3-0.5重量份吐温-80，采用氯仿混合溶解充分得到油相，备用；
2)将油相减压蒸馏除溶剂得到空白磷脂膜，对空白磷脂膜采用硫酸铵溶液冲洗、水化得到空白脂质体，经过滤膜过滤处理，备用；
3)将步骤2)得到的空白脂质体放入透析袋中，利用生理盐水于37℃恒温透析5-7小时，然后将透析后的空白脂质体加入到水相中加热至45-55℃，孵化15-25分钟，得到恩诺沙星脂质体粗品；
4)将步骤3)得到的粗品进行离心处理，将离心后的沉淀物冻干得到恩诺沙星脂质体。
2.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤1)所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤1)氯仿混合溶解采用超声波细胞破碎仪辅助处理。
4.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤2)所述硫酸铵溶液的浓度为300mmol/L。
5.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的滤膜为0.45微米滤膜。
6.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤3)所述透析袋的截留分子量为600Da。
7.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：步骤4)离心处理条件为：4℃、15000转/分钟离心40分钟。
8.根据权利要求1所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：所述步骤4)采用如下方法替代：将步骤3)得到的粗品进行离心处理，向离心后的沉淀物中加入PBS缓冲溶液得到溶液型恩诺沙星脂质体。
9.根据权利要求8所述恩诺沙星脂质体的制备方法，其特征在于：所述溶液型恩诺沙星脂质体的浓度为2.0mg/mL。
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