CN102599173A - 琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用，本发明还公开了该琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用方法，将琼胶寡糖用海水配制50～250μg/ml的浓度，搅拌均匀，得到琼胶寡糖海水溶液，或将琼胶寡糖均匀喷洒于海水晶上，制得琼胶寡糖在海水晶中的终浓度是50～250μg/ml，得到琼胶寡糖海水溶液；用前述的琼胶寡糖海水溶液对海区养殖的坛紫菜在干露时期的藻体进行喷洒或对实验室养殖的坛紫菜进行浸泡，处理时间为0.5h～2h。克服现有坛紫菜防治病烂的技术薄弱问题，用免疫学的方法改善坛紫菜的生长状态，增强对病原微生物和恶劣环境的抵抗力。

Description

琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种琼胶寡糖的应用，本发明还涉及该琼胶寡糖的应用方法。

背景技术

坛紫菜是我国浙江、福建一种重要的养殖红藻，也是细胞壁以琼胶为骨架的一种红藻。近年来，由于不符合生长规律的人工栽培技术，海区环境的恶化、气候原因以及病原菌病害等问题，使坛紫菜的烂苗时有发生，历史上大面积的紫菜病烂出现过多次，如2008年和2011年都出现严重病烂现象，养殖户的损失非常严重。因此除了苗种改良、合理栽培等方法外，如何增强养殖坛紫菜自身的免疫能力，提高抗病性，是减少坛紫菜病烂发生率和发生程度的最佳策略。

植物在长期进化过程中形成了一套自我保护机制，即植物的抗病性，其中一种方式是诱导抗病性，即通过对各种激发子的识别来快速有效的激活自身的防御机制，诱导植物产生抗性物质，从而增强植物的抵抗能力，其方式类似于动物的天然免疫反应。这些寡糖抗性诱导剂作为新型生物农药，通过激发植物内部免疫机制，起到抗病、防病、治病的目的。寡糖是一类在高等植物中被广泛研究和应用的生物激发子，能够激活高等植物的自身防御系统。在大型海藻的研究中，也涉及到寡糖对海藻的抗病防御的研究，如红藻Chondrus crispus和Gracilariaconfertas中，寡糖通过诱导氧爆发来防御寄生物；在Chondrus crispus-Acrochaeteoperculata相互作用中，κ-卡拉胶寡糖能提高寄主对病原体的识别，减少病原体的毒性；用琼胶寡糖处理Gracilaria confertas，琼胶寡糖激发了Gracilariaconfertas的防御物质，并杀死附生在藻上的菌；寡聚藻酸能激发Laminaria digitata中超氧阴离子的释放等。专利(ZL200410050261.0)公开一种褐藻酸寡糖防治海带脱苗和烂苗方法。专利(ZL200710031733.1)公开一种新琼寡糖作为水产养殖动物的免疫增强剂，但琼胶寡糖在坛紫菜的研究和应用都未见进行。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种琼胶寡糖在坛紫菜作为免疫增强剂的应用。克服现有坛紫菜防治病烂的技术薄弱问题，用免疫学的方法改善坛紫菜的生长状态，增强对病原微生物和恶劣环境的抵抗力，获得一种无污染、无残留、提高免疫力的藻类免疫增强剂。

本发明还公开了琼胶寡糖在坛紫菜作为免疫增强剂的应用方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用，该琼胶寡糖的结构式表示如下：

其中n＝2-10，为自然数。

所述的琼胶寡糖是来自于红藻多糖琼胶的降解产物，平均分子量在324～1620Da。

所述的琼胶寡糖降解时所用的介质为酸。可以是无机酸或有机酸，如盐酸、硫酸、柠檬酸等。

一种琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用方法，其特征在于包括如下步骤：将琼胶寡糖用海水配制50～250μg/ml的浓度，搅拌均匀，得到琼胶寡糖海水溶液，或将琼胶寡糖均匀喷洒于海水晶上，制得琼胶寡糖在海水晶中的终浓度是50～250μg/ml，得到琼胶寡糖海水溶液；

用前述的琼胶寡糖海水溶液对海区养殖的坛紫菜在干露时期的藻体进行喷洒或对实验室养殖的坛紫菜进行浸泡，处理时间为0.5h～2h，

前述的琼胶寡糖的结构式表示如下：

其中n＝2-10，为自然数。

与现有技术相比，本发明的优点在于：原料来源于纯天然的海洋藻类，又应用于海藻，所以对海洋环境、对坛紫菜的食品质量安全无任何影响，是一种环境友好的，安全的生物制剂；琼胶寡糖有着广泛的生物学作用，是比良种选育更简单，比化学抗生素更安全，效力更广泛的，不仅能减少病原菌数量，还可促进坛紫菜多种免疫反应的免疫增强剂。由于喷洒时间、时间间隔和喷洒途径可影响该活性琼胶寡糖对坛紫菜的非特异性免疫反应，因此为减少病烂造成的损失，本琼胶寡糖作为免疫增强剂特别适用于平时养殖过程中的施用。也适合于海区养殖过程中有干露过程的坛紫菜以及实验室内小体积养殖坛紫菜，具有使用方便、方法多样化的特点。

附图说明

图1为18℃培养5d时对照组坛紫菜叶边缘细胞。

图2为18℃培养5d时琼胶寡糖处理坛紫菜叶边缘细胞。

图3为35℃培养30min时对照组坛紫菜叶边缘细胞。

图4为35℃培养30min时琼胶寡糖处理坛紫菜叶边缘细胞。

图5为琼胶寡糖对坛紫菜病烂率的影响。

图6为琼胶寡糖对坛紫菜致病菌的影响。

图7为琼胶寡糖诱导坛紫菜H₂O₂的产生。

图8为琼胶寡糖诱导下坛紫菜Phrboh的差异表达。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

制备实施例1

将市售的琼胶配成1.5％的溶液，加入终浓度为0.5mol/l的HCl，于50℃水浴，搅拌反应2h，中和，溶液加入活性炭柱中吸附，先以水洗脱去掉未吸附物，再以5％乙醇洗脱去除聚合度小于2的单糖，最后以25％乙醇洗脱获得的溶液减压浓缩至近干，冷冻干燥得到聚合度在2-10的琼胶寡糖。

将琼胶寡糖用海水配成浓度为200μg/ml的溶液，在半浮式网帘养殖的坛紫菜的干出时期(离涨潮浸入水中前1h)，向坛紫菜幼苗叶状体均匀喷洒活性琼胶寡糖溶液。可每隔1天重复一次。

制备实施例2

将市售的琼胶配成2％的溶液，加入终浓度为0.3mol/l的HAc，于90℃水浴，搅拌反应6h，中和，后续实验过程同制备例1。

将琼胶寡糖加入实验室的坛紫菜培养瓶中，使寡糖的终浓度为100μg/ml，坛紫菜培养密度7mg/ml，处理1h后换普通海水继续培养。

试验实施例1

琼胶寡糖对坛紫菜叶片的影响：

以10、100μg·mL^-1琼胶寡糖分别于18℃、35℃两个温度下处理自然状态的坛紫菜，其中后者是在35℃热激30min后恢复至18℃培养，在5d时显微镜下观察叶边缘变化，在8d时，记录病烂情况，以边缘局部白化定为轻度病烂，以局部大范围或周圈白化为中度病烂；以整个叶片的腐烂定为重度病烂。

病烂率＝各病烂程度的紫菜数/总叶片数×100％

未经无菌处理的坛紫菜在培养箱中自然生长至9d会发现有37.5％的叶边缘有轻微白化现象，有12.5％有中度白化。而35℃高温热激，会严重加剧病烂现象，其中66.6％出现中度白化，8.3％有严重腐烂现象。但经琼胶寡糖预处理后，两种温度下，病烂现象都较对照组有所减轻，在18℃下，100μg·mL^-1处理的轻微白化率下降至25％，中度为8.3％，而35℃时，轻度和中度病烂率都为16.6％，并且无严重腐烂现象(如图1所示)。显微观察叶边缘的状态也显示，18℃培养5d后两个组间细胞状态有明显的区别，100μg·mL^-1寡糖处理的坛紫菜圆片边缘细胞生长良好，而对照组同样在叶圆片边缘细胞死亡较多，附图可以参考图2～图5所示。

试验实施例2

琼胶寡糖对坛紫菜致病菌的减少作用：

选取抗生素氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素，以300、100和100μg·mL^-1组合，处理坛紫菜圆片18h后，用无菌海水清洗坛紫菜圆片3次，以去除残留抗生素，转入坛紫菜培养液培养6d，获得无菌坛紫菜。以致病菌浸泡无菌坛紫菜1h，再以100μg·mL^-1琼胶寡糖处理1h；处理后坛紫菜以无菌海水清洗3次，置于研磨器中加海水研磨，取适当稀释度上清液涂布平板，在22℃培养2-3d后计数。

人为感染菌的坛紫菜，利用100μg·mL^-1琼胶寡糖处理不同时间后，琼胶寡糖能使附着在坛紫菜上的致病菌数量明显减少，并且随时间延长，抑制率增高，在处理3h后菌落减少率达到60.8％(见图6)。

试验实施例3

琼胶寡糖对坛紫菜H₂O₂的产生：

H₂O₂是植物防御反应的关键信号分子。以含100μg/mL琼胶寡糖的海水培养液处理坛紫菜叶片1h(培养密度为7mg/mL)。各时间点取培养液，添加POHPAA混合剂(6.13μM POHPAA，276.9U/L POD，8.6mM Tris-HCl，pH＝8.8)，避光反应35min后检测吸光值(ex＝313nm，em＝400nm)。

100μg/mL琼胶寡糖处理5min就能检测到坛紫菜迅速的释放H₂O₂，在15min时达到峰值，含量可达到102.1nM，比对照组高出近10倍(见图7所示)。

试验实施例4

NADPH氧化酶(Phrboh)是动植物细胞中产生防御信号物质-活性氧的主要酶。

100μg/mL琼寡糖处理坛紫菜，在各时间点采集叶片，提总RNA。反转录成cDNA后进行实时定量PCR检测。以藻类NADPH氧化酶类似物保守区为模板，设计Phrboh定量引物，正：5′TGCCGCTCAAGACGACCTA3′；反：5′CACCCACCACAGACCCAGA3′，扩增90bp片段。以18s为参照基因，正：5′AGTTAGGGGATCGAAGACGA3′；反：5′CAGCCTTGCGACCATACTC3′。两基因同一程序下进行扩增：1、holding：95℃，3min；2、cycling：95℃，10s；58℃，18s；72℃，15s；40cycles；3、melting：60℃-90℃。用Delta-deltaCt法进行结果分析。

100μg/mL琼胶粗糖处理坛紫菜3min内，Phrboh已出现表达上调，比正常水平上调约1.73倍，并且12min内Phrboh一直处于上调。在15min时，Phrboh回复到正常表达水平。说明在坛紫菜中，琼胶寡糖能诱导NADPH氧化酶基因表达上调，以增加酶量，进而参与活性氧的爆发(见图8所示)。

Claims (6)

1.一种琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用，该琼胶寡糖的结构式表示如下：

其中n＝2-10，为自然数。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的琼胶寡糖是来自于红藻多糖琼胶的降解产物，平均分子量在324～1620Da。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的琼胶寡糖降解时所用的介质为酸。

4.一种琼胶寡糖在坛紫菜免疫增强剂中的应用方法，其特征在于包括如下步骤：将琼胶寡糖用海水配制50～250μg/ml的浓度，搅拌均匀，得到琼胶寡糖海水溶液，或将琼胶寡糖均匀喷洒于海水晶上，制得琼胶寡糖在海水晶中的终浓度是50～250μg/ml，得到琼胶寡糖海水溶液；

用前述的琼胶寡糖海水溶液对海区养殖的坛紫菜在干露时期的藻体进行喷洒或对实验室养殖的坛紫菜进行浸泡，处理时间为0.5h～2h，

前述的琼胶寡糖的结构式表示如下：

其中n＝2-10，为自然数。

5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述的琼胶寡糖是来自于红藻多糖琼胶的降解产物，平均分子量在324～1620Da。

6.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述的琼胶寡糖降解时所用的介质为酸。

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